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Methodenartikel

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

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DOI:

10.3791/53407

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19. Dezember 2015

 ,  ,  , 
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die molekularen Mechanismen der Dekondensation von hochverdichtetem mitotischem Chromatin sind unklar. Wir präsentieren einen zellfreien Assay, der auf mitotischen Chromatinclustern basiert, die aus HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt isoliert wurden und den Dekondensationsprozess in vitro originalgetreu rekonstituieren.

Zusammenfassung

Während des Zellzyklus von Wirbeltieren erfährt Chromatin umfangreiche strukturelle und funktionelle Veränderungen. Beim Eintritt in die Mitose kondensiert es massiv zu stäbchenförmigen Chromosomen, die einzeln durch den mitotischen Spindelapparat bewegt werden. Die mitotische Chromatinkondensation führt zu verdichteten Chromosomen, die fünfzigfach dichter sind als in der Interphase. Beim Austritt aus der Mitose müssen die Chromosomen ihren funktionellen Interphase-Zustand wiederherstellen, der von einer Kernhülle umschlossen ist und für die Replikation und Transkription zuständig ist. Der Dekondensationsprozess ist morphologisch gut beschrieben, aber molekular wenig verstanden: Uns fehlt das Wissen über die zugrundeliegenden molekularen Vorgänge und zu einem großen Teil über die beteiligten Faktoren sowie deren Regulation. Wir beschreiben hier ein zellfreies System, das die Chromatin-Dekondensation in vitro originalgetreu rekapituliert, basierend auf mitotischen Chromatinclustern, die aus synchronisierten HeLa-Zellen und X. laevis Ei-Extrakt gereinigt wurden. Unser zellfreies System stellt ein wichtiges Werkzeug für die weitere molekulare Charakterisierung der Chromatin-Dekondensation und ihre Koordination mit Prozessen dar, die gleichzeitig während des Mitoseaustritts ablaufen, wie z. B. die Wiederassemblierung der Kernhülle und des Porenkomplexes.

Einleitung

Xenopus laevis Eiextrakt ist ein leistungsfähiges und breit angelegten Werkzeug komplizierte zelluläre Ereignisse in der Einfachheit eines zellfreien Assay zu studieren. Seit ihrer ersten Beschreibung durch Lohka & Masui 1 wurden sie ausgiebig genutzt, um mitotische Prozesse wie Chromatinkondensation 2, Spindelanordnung 3, Kernhülle Aufteilung 4, aber auch nukleozytoplasmatischen Transport 5 oder DNA-Replikation 6 studieren. Die Veranstaltungen finden am Ende der Mitose für die Reformation der interphasic Kern erforderlich, wie beispielsweise Kernhülle Reformation und Kernporenkomplex Remontage sind viel weniger verstanden, den frühen mitotischen Ereignissen verglichen, sondern kann auf ähnliche Weise unter Verwendung von Xenopus Eiextrakt 7 untersucht werden. Wir haben vor kurzem einen Test basierend auf Xenopus-Ei-Extrakt zu Chromatindekondensation am Ende der Mitose 8 studieren gegründet, ein untersuchten Prozess, den ich erwartetts detaillierte Charakterisierung.

In Metazoen, Chromatin ist stark an mitotischen Eintrag, um treu Trennung des genetischen Materials durchzuführen kondensiert. Um sicherzustellen, dass das Chromatin während der Interphase ist für die Genexpression und die DNA-Replikation zugänglich ist, muss es bei Ende der Mitose De-verdichtet werden. Bei Wirbeltieren ist Chromatin bis zu fünffach während der Mitose kompakteren gegenüber Interphase 9, in Gegensatz zu Hefen, wo der mitotischen Verdichtung ist in der Regel viel geringer, beispielsweise nur zwei-fach in S. cerevisiae 10. Vertebraten Chromatindekondensation wurde hauptsächlich im Zusammenhang mit der Spermien DNA Reorganisation nach Eibefruchtung sucht. Ein molekularer Mechanismus, bei dem Nucleoplasmin, eine reichliche Oozyte Protein tauscht spermienspezifische Protamine Histone H2A und H2B im Ei gespeichert. Dieses Verfahren wurde auch unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt 11, 12 erläutert. Jedoch bedeutet der Ausdruckvon Nucleoplasmin an Oozyten 13 und mitotischen Chromatin beschränkt nicht diese Spermien spezifische Protamine enthalten. Daher Chromatindekondensation am Ende der Mitose unabhängige Nucleoplasmin 8.

Für die in vitro Dekondensation Reaktions beschäftigen wir Auszug aus aktiviert X. laevis Eiern und Chromatin-Cluster aus synchronisierten HeLa-Zellen isoliert generiert. Die Behandlung der Eier mit einem Calcium-Ionophor ahmt die Calcium-Freisetzung in die durch Spermien Eintrag bei der Befruchtung erzeugten Eizelle. Das Calciumwelle triggert den Zellzyklus wieder aufgenommen und das Ei, in der zweiten Metaphase der Meiose fest schreitet zu dem ersten Zwischenphase 14. Daher Ei Extrakte hergestellt Form aktiviert Eier stellen die mitotische exit / Interphasezustand und sind befugt, die spezifisch für mitotische Ausfahrt wie Chromatindekondensation, Kernhülle Ereignisse induzieren und Porenkomplex Reformation. Zur Isolierung von mitotischen chromatin Cluster verwendeten wir eine leicht modifizierte Version des von Gasser & Laemmli 15, in dem Chromosom Cluster werden durch Lyse aus HeLa-Zellen in der Mitose synchronisiert und in Polyamin enthaltenden Puffern getrennt durch eine Gradienten-Zentrifugationen erfolgten Veröffentlichung Protokoll.

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Protokoll

Mitotische Chromatin Cluster Isolation aus HeLa-Zellen

1. Vorbereitungen

  1. Cell Culture-Lösungen
    1. Vorbereitung abgeschlossen Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) durch Zusatz von 10% fötalem Kälberserum, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM Glutamin in DMEM. Vorbereitung Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), die 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O und 2 mM KH 2 PO 4 in entionisiertem Wasser und Einstellen des pH auf 7,4 mit 10 N NaOH.
      HINWEIS: PBS als 10x Stammlösung im Laufe der Zeit bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Verdünnen Sie es mit entsalztem Wasser Vor Gebrauch auf 1x. Filtern Sie die 1x-Lösung wieder, wenn es in der Zellkultur verwendet werden.
    2. Bereiten Sie eine 40 mM Stamm von Thymidin-Lösung (Zellkultur geeignet) in DMEM-Medium. Aufzulösen 0,97 g Thymidin in 90 ml DMEM-Medium. Einstellen Endvolumen auf 100 ml. Lagerung der Stammlösung bei -20 °C. auflösen (VORSICHT! Arbeiten unter chemischen Abzugshaube, Handschuhe und Mundschutz) Nocodazol zu einer 5 mg / ml Stammlösung in DMSO.
  2. Mitotische Cluster Isolation Solutions
    HINWEIS: Alle in 1.2 beschriebenen Lösungen benötigen, um auf dem Eis nach der Zubereitung / Auftauen während des gesamten Experiments gehalten werden.
    1. Autoklav vollentsalztem Wasser 105 min bei 121 ° C. Aufzulösen Spermin-tetrahydrochlorid in autoklavierten, deionisierten Wasser bis zu einer Endkonzentration von 200 mM (69,6 mg / ml). Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C. Aufzulösen Spermidin Trihydrochlorid in autoklavierten, deionisierten Wasser bis zu einer Endkonzentration von 200 mM (50,8 mg / ml). Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C.
    2. Bereiten Sie 5% (w / v) Digitonin (VORSICHT! Arbeiten unter chemischen Abzugshaube, Handschuhe und Mundschutz) in heißem, deionisiertem Wasser. Filter und speichern Aliquots bei -20 ° C. Löse Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (VORSICHT! Arbeiten under chemischen Abzugshaube, Handschuhe und Mundschutz) zu tragen, um eine Endkonzentration von 200 mM (35 mg / ml) in 100% Ethanol. Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C.
    3. Löse Dithiothreitol (DTT) mit entionisiertem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 M (154 mg / ml) (VORSICHT! Arbeiten unter chemischen Abzugshaube, Handschuhe). Filter und Speicher-Stammlösung bei -20 ° C.
    4. Bereiten Sie eine 100-fach-Protease-Inhibitor-Mix (VORSICHT arbeiten unter chemischen Abzugshaube, Handschuhe tragen!) Durch Lösen von 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml Leupeptin, 0,1 mg / ml Pepstatin und 0,2 mg / ml Aprotinin in entionisiertem Wasser. Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C.
    5. Bereiten Sie eine 10x Stammlösung von Puffer A, enthaltend 150 mM Tris-Cl (pH 7,4), 800 mM KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM Spermin Tetrahydrochlorid und 5 mM Spermidin Trihydrochlorid. Speicher Puffer A bei 4 ° C ohne Spermin und Spermidin Tetrahydro Trihydrochlorid, die zugegeben werden sollfrisch, kurz bevor zu verwenden.
      HINWEIS: EDTA löst sich nur bei pH-Werten von mehr als 8, daher, ein hochkonzentriertes EDTA-KOH-Stammlösung (0,5 M empfohlen) vorzubereiten, fügen Sie 5 N KOH auf pH knapp über 8, um es aufzulösen. Danach titriert auf pH-Wert 7,4.
    6. Vorbereitung einer 20x Stammlösung von Puffer als das 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 400 mM KCl, 400 mM EDTA-KOH (pH 7,4) und 5 mM Spermidin Trihydrochlorid. Buffer Wie kann unter denselben Bedingungen wie Puffer A gespeichert werden
      HINWEIS: Bereiten Sie die Arbeitslösungen I bis IV (siehe in den folgenden Schritten), die Glycerin-Gradienten und die kolloidalen Silicapartikel Lösungen Silicapartikel (15 bis 30 nm Durchmesser) mit nicht dialysierbar Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschichtet mit frisch kurz vor der Trennung Verfahren (PMSF und Digitonin sollte unmittelbar vor der Verwendung zugesetzt werden, wie PMSF labil ist in wässrigen Lösungen und Digitonin neigt, bei der Langzeitlagerung auf Eis ausgefällt).
    7. Vorbereitung auf 100 ml Lösung I durch Zugabe von 0,5 x Puffer A,1 mM DTT, 1: 100 der Proteaseinhibitor-Mix und 0,1 mM PMSF in autoklavierten, deionisierten Wasser. Vorbereitung 50 ml der Lösung II (zur Zelllyse) durch Zusatz von 1x Puffer A, 1 mM DTT, 1: 100 der Proteaseinhibitor-Mischung, 0,1 mM PMSF, 0,1% Digitonin und 10% Glycerin in autoklavierten, deionisierten Wasser.
    8. Vorbereitung 200 ml Lösung III enthält 0,25x Puffer A, 1 mM DTT, 1: 100 der Proteaseinhibitor-Mischung, 0,1 mM PMSF und 0,05% Digitonin in autoklavierten, deionisierten Wasser. Vorbereitung 40 ml Lösung IV aus 1x Puffer als, 1 mM DTT, 1: 100 der Proteaseinhibitor-Mischung, 0,1 mM PMSF und 0,1% Digitonin in autoklavierten, deionisierten Wasser.
    9. Bereiten Sie 120 ml Glycerin-Gradienten-Lösung durch Zusatz von 25% Glycerin und 0,1% Digitonin zur Lösung I.
    10. Vorbereitung 150 ml kolloidaler Silikapartikel Lösung, enthaltend 60% v / v (Volumen pro Volumen) einer Suspension, die Siliciumdioxidteilchen (15 bis 30 nm Durchmesser) mit nicht-dialysierbaren Polyvinylpyrrolidon (PVP), 15% Glycerin, 2 mM s beschichtetpermidine Trihydrochlorid und 0,8 mM Spermin Tetrahydrochlorid in der Lösung IV.
    11. Vorbereitung Cluster-Speicherpuffer, der 250 mM Saccharose, 15 mM Hepes (pH 7,4), 0,5 mM Spermidin-Trihydrochlorid, 0,2 mM Spermin-tetrahydrochlorid, 1: 100 der Proteaseinhibitor-Mischung, 0,3% BSA und 30% Glycerin. Gruppenspeicherpuffer kann bei -20 ° C aufbewahrt werden.
    12. Bereiten Squash fix Lösung mit 10% Formaldehyd (VORSICHT! Arbeiten unter chemischen Abzugshaube, Handschuhe), 50% Glycerin, Doppelte Marks Modifizierte Ringer-Puffer (MMR siehe 4.5.) Und 0,2 ug / ml DAPI (ACHTUNG! Schutzhandschuhe tragen). Lagerung bei 4 ° C in lichtgeschützten Reaktionsrohre. Es ist nicht entscheidend für das Experiment, um dieses Squash fix Rezept verwenden, werden alternative Rezepte auch funktionieren.

2. Synchronisation der Zellen

  1. An Tag 1: Samen HeLa-Zellen in fünf 75 cm 2 (250 ml) Flaschen mit Medium und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2.
    Hinweis: das wird etwa 18 × 10 6 Zellen am Tag der Chromatin-Cluster Isolation ergeben in.
  2. An Tag 2: Wenn die Zellen mindestens 50% Konfluenz (ungefähr die Hälfte der Oberfläche von Zellen bedeckt und es gibt immer noch Raum für die Zellen zu wachsen), fügen Thymidin bis zu einer Endkonzentration von 2 mM (Thymidin-Block) und Kulturzellen für 24 h bei 37 ° C in 5% CO 2.
    Hinweis: Dadurch werden die Zellen an der G1 / S-Phasengrenze zu verhaften.
  3. Am Tag 3: Absaugen Medium, das Thymidin und fügen sterilem PBS. Waschen Sie die Zellen durch zarte Spülen mit sterilem PBS. Aspirat PBS und sanft hinzuzufügen 15-20 ml frisches, warmes komplettem DMEM Medium und Kulturzellen für 3-4 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2, um sie von der G1 / S-Phasenblock freizugeben.
  4. Am Tag 3 (Fortsetzung): Nach dem Lösen der Zellen aus der G1 / S-Phasenblock hinzuzufügen Nocodazol bis zu einer Endkonzentration von 100 ng / ml. Nocodazol verdünnte durch Zugabe von 2 & mgr; l der Stammlösung (5 mg / ml) bis 98ml frisches DMEM-Medium, und fügen 1 ul Nocodazol pro jedem ml der Zellkultur verdünnt. Kulturzellen für etwa 12 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. Dadurch werden die Zellen in der Mitose blockieren.

3. Mitotische Cluster Isolation

  1. Am Tag 4: Abtrennung mitotischen Clustern. Unter Verwendung einer Hellfeld-Mikroskopie, zu überprüfen, ob die Mehrzahl der Zellen mitotische sind. Wenn weniger als 50% der Zellen mitotische warten, bis mehr Zellen zu erreichen Mitose. Sammeln mitotischen Zellen, indem kräftig an der Seite des Kolbens (oder durch leichtes Besprühen mit Pipette) wird dieser Rest mitotischen Zellen abzulösen. Übertragen Sie die Zellsuspension in 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Mitotische Zellen runden sich und kann leicht aus dem Kolben unten (wie Zellen nach Trypsinierung) abgelöst werden, im Gegensatz zu Zellen in anderen Zellzyklus-Stadien, die flach und fest mit dem Kolben verbunden sind.
  2. Ernten mitotischen Zellen durch Zentrifugieren der Röhrchen bei 1.500 × g für 10 min (476; C oder RT) und Entfernen des Überstands danach. Zellpellet in 8 ml PBS, Pool in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen, füllen Sie das Rohr vollständig mit PBS und Spin wieder für 10 Minuten bei 1500 x g. Wiederholt diesen Waschvorgang insgesamt dreimal.
  3. Von nun an alle Schritte auf Eis mit kaltem Lösungen. Kräftig das Pellet in 37 ml kalte Lösung II. Übertragen Sie die Suspension auf eine kalte 40 ml Glas-Glas-Homogenisator unter Verwendung einer 25 ml Pipette und lysieren Zellen auf Eis durch Douncing mit einem engen Stößel, bis mitotischen Cluster sind frei von zytoplasmatischen Material. Die Hubzahl ist stark abhängig von der Digitonin Lager und kann 3 bis 20 Mal variieren.
    HINWEIS: Die Homogenisierung kann ziemlich kräftig sein, sollte aber als abgeschlossen betrachtet werden, wenn fast alle mitotischen Zellen lysiert und die Cluster gesehen frei von zytoplasmatischen Material zu sein (siehe 3.4).
  4. Nach ein paar Striche mischen 5-10 & mgr; l der Zellsuspension 1: 2 mit Trypanblau und prüfen von MICR-oscopy in einer Neubauer-Kammer. Wenn die Zellen lysiert Chromatin ist blau gefärbt und frei von Zellmembranen (HINWEIS: möglich zytoplasmatischen Reste werden ansammeln um die blau gefärbte Chromatin und leicht zu unterscheiden sein).
    HINWEIS: mitotischen Zellen wird vor interphasic Zellen zu lysieren, aber dennoch vorsichtig, nicht zu Homogenisierung, um eine Kontamination mit interphasic Kernen und verstümmelten Chromatin zu vermeiden übertreiben.
  5. Sofort Schicht die gesamte Zelllysat über Kalt Stufengradienten (mit 5 ml 60% ige kolloidale Siliciumdioxidteilchen Lösung an der Unterseite, überlagert mit 19,5 ml Glycerin Gradientenlösung jedes) in fünf Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen (28,8 x 107,0 mm, wird folgendes empfohlen legen Sie die Röhrchen auf Eis, bevor sie abgekühlt ist) unter Verwendung einer 10 ml Pipette. Zellen halten nicht in Lösung II für eine lange Zeit, so empfiehlt es sich, den Rohren und dem Gradienten im Voraus vorzubereiten (zum Beispiel während der Waschschritte).
  6. Zentrifugieren Sie die Gradienten für 30 min bei 1.000 × g bei 4 ° C in einem Festwinkelrotor.
    HINWEIS: Die Kerne, nicht lysierten Zellen und Cluster werden an der Schnittstelle des Glycerin und die kolloidalen Kieselsäureteilchen Schichten gewonnen.
  7. Entfernen Sie die Flüssigkeit über dem Interphase mit einer Pipette und überweisen Sie den Rest an die Kälte-Homogenisator. Wieder nachhomogenisieren Mischung durch 3-15 Striche (je Digitonin Lager wieder) mit dem engen Pistill, um Aggregate zu eliminieren und Zytoskelett-Fasern von den Cluster zu entfernen. Nachdem alle paar Striche überprüfen Sie die Effizienz der Homogenisierung. Mischen Sie 1 ul der Probe mit 1 ul Squash fix mit DAPI ergänzt und untersucht unter dem Fluoreszenzmikroskop.
    HINWEIS: Die Anzahl der Hübe ist wichtig, die Gegenwart von Streuaggregaten wird verstanden, daß die Anzahl der Hübe unzureichend, während verstümmelten Chromatin und Kerne Schmutz anzuzeigen, daß die Homogenisierung zu stark war.
  8. Verteilen Sie die Lösung unter den vier neuen Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen (28,8 x107,0 mm) (ca. 10 ml Lösung pro Röhrchen) und füllen Sie sie vollständig mit 60% kolloidalen Silicapartikel-Lösung (ca. 30 ml kolloidalen Silicapartikel-Lösung pro Röhrchen).
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überlastung der kolloidalen Silicapartikel Gradienten, da Cluster können leicht eingefangen, wenn es zu viel zytoplasmatischen Trümmern des Gradienten werden.
  9. Spin für 5 min bei 3.000 x g, gefolgt von 30 min bei 45.440 × g bei 4 ° C in einem Festwinkelrotor.
    HINWEIS: Wie bisher werden interphasic Kerne vom Betreten des Gradienten (wenn Homogenisierung nicht zu stark durchgeführt, welche Kerne von cytoplasmatischen Trümmer Mitteilungen), aber die Cluster bei rund 1,5 cm von dem Boden des Rohres oft als loses Kugel akkumulieren, gehalten werden.
  10. Entfernen Sie die Flüssigkeit über die Cluster mit einer Pipette, bündeln den Rest in ein Rohr, resuspendieren gut und verteilen zu zwei Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen (28,8 x 107,0 mm). Verdünnen Sie die Cluster-Suspension 1: 4 mit III-Lösung in jedes Röhrchen und gut mischen. Mark the Ort waren das Pellet wird und Spin 1.000 xg für 15 min bei 4ºC in einem Festwinkelrotor.
  11. Resuspendieren der Pellets in Lösung III, Pool in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen geben und mit Lösung III. Zentrifuge bei 300 · g für etwa 10 min. Nicht bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren nicht - es könnte irreversible Aggregation von Clustern.
  12. Dann wird noch einmal mit Lösung III in 1,5 oder 2 ml Reaktionsgefäße (Resuspendieren der Pellets und die Röhrchen vollständig füllen) und Zentrifuge bei 300 x g. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Pellet vorsichtig in 250 ul Clusterspeicherpuffer (wenn Sie mehrere Pellets verwenden 250 ul für alle zusammen und bündeln sie). Verdünnen 5-10 ul der Probe 1: 2 mit Trypanblau und zählen in der Neubauer-Kammer. Ggf. verdünnten mehr um eine ungefähre Konzentration von 500 Clustern / ul zu erhalten.
  13. Schieben Sie die Suspension durch ein 100 & mgr; m Zellsieb um sicherzustellen, dass die Cluster-Aggregation zu entfernens unsachgemäße Aufwirbelung entstehen. Die Cluster können monatelang in -80 ° C gelagert werden. Zur Vermeidung von Mehrfach erneutes Einfrieren geeignete Teilmengen und Snap freeze in flüssigem Stickstoff.

4. Vorbereitungen Puffer für Interphasic Xenopus laevis Eiextrakt

HINWEIS: Xenopus laevis Frösche sind gepflegt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Übereinkommen des Europarates über den Schutz von Wirbeltieren für Versuche und andere Zwecke (EU im Jahr 1998 ratifiziert) verwendet gesetzt behandelt, und das deutsche Recht in Bezug auf die Verwendung von Wirbeltieren in der Forschung.

  1. Vorbereitung DTT und einem 100fachen Proteaseinhibitor Mischung gemäß 1.2.3 und 1.2.4. Löse Cytochalasin B, um eine Endkonzentration von 10 mg / ml in DMSO, Aliquot (10 oder 20 & mgr; l empfohlen) und bei -20 ° C.
  2. Aufzulösen Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 20 mg / ml in Ethanol, Aliquot (500 & mgr;empfohlen) und bei -20 ° C. Man löst das Kalzium A23187 bis zu einer Endkonzentration von 2 mg / ml in Ethanol, aliquotieren und bei -20 ° C.
    HINWEIS: PI, DTT, Cytochalasin B, Cycloheximid und A23187 wiederholt eingefroren und aufgetaut werden.
  3. Vorbereitung 20x Marks Modified-Ringer-Puffer (MMR), enthaltend 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 40 mM CaCl 2, 2 mM EDTA und 100 mM Hepes, pH-Wert auf 8,0 mit 5 N KOH.
    HINWEIS: Der 20x MMR kann über lange Zeit bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. In Abhängigkeit von den Mengen an Eiern, für eine Herstellung von interphasic Eiextrakt 1 l 1x MMR pro injizierter Frosch und weitere 5-10 Liter für die Waschschritte notwendig. Durch Veränderung der pH-Wert von 1x MMR auf 8,0 mit 5 N KOH. 1x MMR bereit, die Frösche in O zu halten / N x 1 sollte bei Raumtemperatur sein. 1x MMR für den Extrakt prepared sollte kalt gehalten werden, bis sie verwendet wird, aber es ist nicht entscheidend für das Experiment, dass die MMR-1x ist wirklich kalt.
  4. Bereiten Sie 1 l sucRose-Puffer, enthaltend 250 mM Saccharose, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2 und 10 mM Hepes pH 7,5. Saccharosepuffer sollte der Tag hergestellt werden vor der Verwendung steriles Wasser und bei 4 ° C aufbewahrt werden.
  5. Bereiten Sie die dejellying Lösung frisch am Morgen des Experiments durch Auflösen von 2% L-Cystein in 0,25x MMR. Einstellen des pH auf 7,8 mit 5 N KOH. Halten bei 4 ° C gehalten, bis sie verwendet wird.

5. Protocolfor Interphasic Xenopu s laevis Eiextrakt

  1. Injizieren Sie 120 IE schwangere Stutenserum-Gonadotropin (PMSG) in die dorsale Lymphsack jeder Frosch 3-10 Tage vor dem Experiment (5 ml Spritzen, 27 G ¾ '' Nadeln).
    Hinweis: Diese Injektion wird die Ovulation zu induzieren. Die Menge der Eier ein Frosch legt sehr unterschiedlich. Ein gut zur frog könnten Eier Besatzungs ein Volumen von bis zu 7 ml nach dem De-jellynated was bis zu 3,5 ml Rohextrakt entspricht herzustellen. , Sind jedoch der Auffassung, dass einige Frösche möglicherweise nicht la legen oder wirdy faulen Eiern.
  2. Injizieren Sie 500 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) pro Frosch am Abend vor dem Experiment (5 ml Spritzen, 27G ¾ '' Nadeln). Dadurch wird die Freisetzung der Eier zu induzieren. Halten Sie die Frösche für 13-17 Stunden bei 18 ° C in den einzelnen Tanks mit 1,2 l 1x MMR (pH 8).
  3. Sammeln Sie die Eier durch Gießen sie in 600-1.000 ml Bechergläser.
    HINWEIS: Nehmen Sie nur die guten Chargen von Eiern, die individuell festgelegt werden, eine ähnliche Größe und deutlich mit einer dunklen und einer hellen Hälfte pigmentiert. Nehmen Sie nicht die Eier, die Saiten oder die aussehen geschwollenen und Weiß bilden. Diese sollten während des gesamten Verfahrens mit einem Kunststoff-Pasteurpipette sortiert werden. Für eine detaillierte Beschreibung von Gut gegen schlechte Eier sehen Gillespie et al. 6
  4. Eier intensiv zu waschen, etwa 4-mal, mit 1x MMR durch Dekantieren des Überstandes, wenn die Eier nieder und Nachfüllen der Becherglas mit frischem Puffer danach.
    HINWEIS: DerEier sind stabile, bevor sie dejellynated werden und der Waschpuffer kann direkt auf die Eier aufgebracht werden.
  5. Dejellynate die Eier durch Inkubation in der 2% Cystein-Lösung. Ändern Puffer einmal nach 2-4 min durch Dekantieren des Puffers und sorgfältig Befüllen der Becher mit frischem Puffer. Considerdejellying abgeschlossen, wenn das Volumen der Eier drastisch ab, und die Eier werden immer dichter gepackt.
    HINWEIS: Die dejellying braucht ca. 5-7 Minuten und sollte, wenn sichtbar, aber spätestens nach 10 Minuten angehalten werden.
  6. Wash Eiern ca. 4-mal mit 1x MMR durch Dekantieren und Nachfüllen des Pufferüberstand.
    HINWEIS: Die Eier sind zerbrechlicher nachdem dejellynated, und daher müssen die Waschschritte genauer erfolgen. MMR sollte eher an der Wand des Becherglases auf die Eier gespült anstatt unmittelbar werden.
  7. Aktivieren Eier in 100 ml 1x MMR durch Zugabe von 8 & mgr; l von dem Calcium-Ionophor (2 mg / ml in Ethanol). Stopp-Aktivierung, wenn Tierkappe Ziehung seinkommt sichtbar oder nach 10 min.
    HINWEIS: Das Tier cap Kontraktion kann durch die Verdichtung des schwarz Eihälfte identifiziert werden.
  8. Sorgfältig 4mal mit 1x MMR durch Dekantieren und Nachfüllen des Pufferüberstand zu waschen.
  9. Eier auszubrüten für 20 min in 1x MMR bei RT.
  10. Die Zentrifugationsröhrchen vorzubereiten während der Inkubationszeit: Platz 50 ul Saccharosepuffer, 50 ul 100-fach-Proteaseinhibitor-Mischung, 5 ul 1 M DTT, 12,5 & mgr; l Cycloheximid (die Translation zu verhindern, insbesondere von Cyclin B) und 2,5 ul Cytochalasin B (um verhindern Aktin-Polymerisation) in 5 ml Zentrifugenröhrchen (13 x 51 mm). Alternativ kann für mehr als 30 ml von Eiern, 14-ml-Röhrchen (14 x 95 mm) durch das 2,4-fache eingesetzt werden, in diesem Fall geringfügig Volumen.
  11. Zweimal waschen Sie die Eier mit kaltem Saccharosepuffer (dekantieren und Refill-Puffer in das Becherglas) und sie in Zentrifugenröhrchen mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette mit breiter Öffnung (schneiden Sie das schmale Ende).
  12. PackEier durch Zentrifugieren für 1 min bei 130 x g. Setzen Sie die Rohre in 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen für diesen Zweck (setzen Sie die 14-ml-Röhrchen in 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen, respectively). Das Ziel ist, so viel Puffer wie möglich zu entfernen, um eine Verdünnung des Extrakts zu verhindern. Nach dem Zentrifugieren zu entfernen mehr als Puffer unter Verwendung eines Kunststoff-Pasteurpipette und schließlich füllen mehr Eier auf die Oberseite.
  13. Spin in einem 6 x 5 ml schwingen Rotor für 20 min bei 21.000 × g bei 4 ° C.
  14. Entfernen niedriger Geschwindigkeit Extrakt unter Verwendung einer 5-ml-Spritze mit einer 16 G 1 ½ '' Nadel zwischen Eigelb an der Spitze und dunkel zerbrochenes Ei Schmutz im Boden. Dazu drücken Sie die Spritzennadel durch die Wand des Zentrifugenröhrchens gerade über der Schicht aus zerbrochenes Ei Schmutz im Boden. Halten Sie das Röhrchen gegen einen Widerstand beim Schieben mit der Nadel.
    HINWEIS: Ein gefüllter 5 ml Zentrifugenröhrchen gibt zwischen 1,8 bis 2,5 ml Extrakt.
  15. Pro 1 ml Extrakt werden 10 & mgr; l 100-fach-Protease-Inhibitor-Mix, 1 & mgr;1 M DTT, 2,5 ul Cycloheximid (20 mg / ml) und 0,5 ul Cytochalasin B (10 mg / ml). Halten Sie das Extrakt auf Eis.
    HINWEIS: Der Extrakt kann entweder direkt für das Experiment verwendet oder aliquotiert, schockgefroren und in flüssigem Stickstoff für mehrere Monate gelagert. Einfrieren des Extrakts wird seine Aktivität verringern. Für empfindliche Experimente wie Immunodepletion ist es sehr empfehlenswert, um frischen Extrakt sofort verwenden.

6. Herstellung von Puffer für In-vitro-Rekonstitution von Chromatindekondensation

  1. Vorbereitung der Energie Mischung Stammlösung, die 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg / ml Kreatinphosphat und 2,5 mg / ml Creatinkinase in Puffer, enthaltend 250 mM Saccharose, 1,2 mM Hepes, 5,9 mM KCl und 0,3 mM MgCl 2. Aliquotieren und bei -80 ° C. Verwenden Sie frisch nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.
  2. Man löst 0,2 g / ml Glykogen in entionisiertem Wasser. Lagerung bei -20 ° C. Aufzulösen 6-dimethyl Aminopurin (DMAP) in einer Endkonzentration0,25 M in DMSO. Aliquot und bei -20 ° C. Verwenden Sie frisch nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.
  3. Bereiten Sie 30% (w / v) Saccharose in PBS, filtern und bei 4 ° C. Bereiten Sie 4% VikiFix Lösung, die 80 mM PIPES, pH 6,8, 1 mM MgCl 2, 150 mM Sucrose und 4% Paraformaldehyd (PFA) (VORSICHT! Arbeiten unter chemischen Abzugshaube, Handschuhe und Mundschutz).
    HINWEIS: Die PFA ist schwierig, deshalb lösen, wird empfohlen, es als folgendes tun: Für 1 l Viki-Fix lösen sich 24,2 g Rohre und 40 g PFA in getrennte Bechergläser, sowohl in heißem (fast kochendes) VE-Wasser. Beide werden durch die Zugabe von 10 N NaOH auflösen aber seien Sie vorsichtig, um nicht zu viel hinzuzufügen. In 51,4 ​​g Saccharose und 1 ml 1 M MgCl 2 auf die PFA-Lösung. Fügen Sie den PIPES-Lösung auf die andere Mischung. Füllen Sie bis zu 1 l Endvolumen und pH-Wert auf neutral durch Zugabe von NaOH.
  4. Man löst 10 mg / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in Wasser (ACHTUNG! Schutzhandschuhe tragen). Bewahren Sie inDunkeln bei -20 ° C.

7. Protokoll zur In-vitro-Rekonstitution von Chromatindekondensation

  1. Spin niedriger Geschwindigkeit interphasic Extrakt für 12 min bei 386.000 xg in einem festen Winkel 20 x 0,2 ml oder 355 000 · g in einer 10 x 2,0 ml Rotor.
  2. Entfernen Sie vorsichtig die Lipidschicht auf der Oberseite mit einer Vakuumpumpe oder einer Pipette und nehmen den Überstand (danach genannt Hochgeschwindigkeits-Extrakt) Vermeidung Membran Verunreinigungen aus der unteren Schicht und entsorgen Sie das Pellet.
    WICHTIG: Um mögliche Membran Verschmutzung zu reduzieren, ist es ratsam, den Extrakt zweimal drehen oder den Extrakt mit 20% des Volumens mit Saccharose-Puffer vor der Zentrifugation zu verdünnen. Allerdings kann Verdünnung und weitere Zentrifugationsschritte den Extrakt Aktivität reduzieren.
  3. Pipettieren Sie 18 ul der Hochgeschwindigkeitsextrakt in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß, fügen 0,7 ul mitotischen Cluster (Menge kann leicht nach Chromatin Stammkonzentration variiert werden), 0,5 ul Glykogen, 0,5 ulEnergiemix und 0,3 ul DMAP. Verwenden Spitzen mit großer Öffnung, um die Reaktion so schnell mischen, während das Chromatin wird zugegeben, um Scherung des decondensing Chromatin verhindern.
    HINWEIS: Die Umsetzung kann in Gegenwart oder Abwesenheit von Membranen (siehe Figur 3) durchgeführt werden. Chromatin in Gegenwart von Membranen decondense, fügen 2 ul schwamm Membranen, hergestellt nach dem von Eisenhardt et al beschriebenen Protokoll. 16
  4. Inkubieren des Reaktionsgemisches für bis zu 2 Stunden bei 20 ° C (oder weniger zu früheren Zeitpunkten der Dekondensation Prozesses zu untersuchen).
  5. Befestigen Sie die Probe durch Zugabe von eiskaltem 0,5 ml Viki-Fix mit 0,5% Glutaraldehyd und 0,1 mg / ml DAPI und Inkubation für 20-30 Minuten auf Eis.
    HINWEIS: Wenn die Proben weiter verarbeitet werden, Immunfluoreszenz, sollte die Fixierung ohne Glutaraldehyd durchgeführt werden, wie dies oft stört die Antikörperfärbung. Wenn jedoch nur der DAPI-Färbung analysiert werden, die Zugabe von GLUTaraldehyde wird ein schöneres Chromatinstruktur zu bewahren.
  6. Inkubieren runde Deckgläser (Durchmesser 12 mm) 5 min mit Poly-L-Lysin-Lösung, um die Affinität der Deck Chromatin erhöhen. Trocknen Sie die Deckgläser auf Filterpapier danach.
  7. Zubauen Flachboden-Zentrifugenröhrchen (6 ml, 16/55 mm), indem die Deckgläser mit der beschichteten Stelle nach oben auf den Boden des Zentrifugenröhrchen. Zugabe von 800 ul der 30% Saccharose-Kissen und Schicht der fixierten Probe an der Spitze.
  8. Spin für 15 min bei 2.500 × g bei 4 ° C.
    HINWEIS: Die Flachboden-Zentrifugenröhrchen, um Rotoren, 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen übernehmen passen.
  9. Den Überstand umfüllen, dann entfernen Sie die Deckgläser aus den Rohren durch Stossen sorgfältig den Boden der Zentrifugenröhrchen mit einer 16 G 1 ½ '' Spritzennadel. Hierzu Band der Deckel der Nadel und die Nadel sich an ihren Unterseiten und schneiden das vordere Ende des Deckels, so dass der Nadelstiche etwa 3mm heraus. Wenn das Deckglas wird von der Nadel auf einer Website aufgehoben, mit Hilfe einer Pinzette, um das Deckglas zu entfernen.
  10. Schnell Waschen Sie die Deckgläschen durch Eintauchen in entionisiertes Wasser, trocknen Sie es vorsichtig durch, um ein Filterpapier zu berühren seine Seite und legen Sie sie auf dem Objektträger auf einem Tropfen Eindeckmittel. Verschließen Sie diese mit Nagellack, trocken und halten in dunklen.
    HINWEIS: ohne Glutaraldehyd fixiert Proben in PBS in einer 24-Well-Platte gelagert und ferner für Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden. Wenn für mehrere Tage gelagert, fügen 0,05% Natriumazid (ACHTUNG! Schutzhandschuhe tragen) an das PBS, um eine Kontamination mit Bakterien zu vermeiden.
  11. Analysieren Sie die Proben durch Fluoreszenzmikroskopie der DAPI-Signal (mit zB einem konfokalen Mikroskop mit einem 405 nm-Laser).

8. Herstellung der Puffer für Immunfluoreszenz-Färbung von In-vitro rekonstituierte Chromatindekondensation Proben

  1. Bereiten PBS nach 1.1.1. Aufzulösen NH 4 Cl, an der RippeAl-Konzentration von 50 mM in PBS. Diese Lösung wird bei 4 ° C. Man löst 5 ug / ml DAPI in PBS (frisch herstellen). Mit 0,1% Triton X-100 zu PBS. Halten bei 4 ° C. Vorbereitung blockierendem Puffer vor Gebrauch frisch hergestellt durch Verdünnen von 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS + 0,1% Triton X-100.

9. Protokoll für Immunfluoreszenzfärbung von In-vitro rekonstituierte Chromatindekondensation Proben

. HINWEIS: Alle folgenden Inkubationen der Deckgläser werden in einer 24-Well-Platte mit mindestens 250 ul Lösung pro gut gemacht, wenn nicht anders angegeben In vitro dekondensiert Chromatin Proben sind empfindlicher als fixierten Zellen daher vorsichtig sein, wenn das Hinzufügen oder Entfernen von Lösungen. Es wird empfohlen, Kunststoff-Pasteurpipetten verwenden geschnitten Winkel. Für Waschschritte und sekundären Antikörper-Inkubation wird die Platte bei RT auf Schaukeln oder drehende Plattform, bewegen nicht schneller als 100 Umdrehungen pro Minute.

  1. Quench Proben durch Inkubation Deckglass mit 1 ml NH 4 Cl in PBS für 5 min. Block Proben durch Inkubation mit 1 ml Blockierungspuffer für mindestens 30 min.
  2. Zubauen einer Feuchtigkeitskammer für die Inkubation mit dem primären Antikörper: Setzen eines nassen Gewebes auf den Boden eines verschließbaren Kasten und dem Deckel der Platte mit 24 Vertiefungen auf den Kopf auf der Oberseite des feuchten Tuchs. Platzieren Parafilm in den Deckel und füge 70 ul der Antikörperlösung pro Probe auf dem Parafilm. Für die Antikörperlösung, verdünnte Antiserum oder affinitätsgereinigtem Antikörper 1: 100 in Blockierungspuffer.
  3. Legen Sie die Deckgläser kopfüber auf der Antikörperlösung und inkubiert sie für 1 bis 2 Stunden. Legen Sie die Deckgläser zurück in die 24-Well-Platte mit der Probenseite nach oben und waschen Proben dreimal für 10 Minuten mit 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
  4. Deck inkubiere 1 h bei RT in 250 ul fluoreszierenden Sekundär-markierte Antikörper in Blocking-Puffer in einer Konzentration, die vom Hersteller empfohlen verdünnt. Vor Licht schützen. Thr waschenee mal für 10 min mit 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
  5. Inkubieren der Proben für 10 Minuten mit 1 ml von 5 & mgr; g / ml DAPI in PBS. Dreimal 5 min lang mit 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS waschen.
  6. Schnell Waschen Sie die Deckgläschen durch Eintauchen in entionisiertes Wasser, trocknen Sie es vorsichtig durch, um ein Filterpapier zu berühren seine Seite und legen Sie sie auf dem Objektträger auf einem Tropfen Eindeckmittel. Verschließen Sie diese mit Nagellack, trocken und halten bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Verwendung. Analyse der Proben durch Fluoreszenzmikroskopie.

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Ergebnisse

Zeitabhängigkeit der Dekondensation Reaktions

Figur 1 zeigt einen typischen zeitlichen Verlauf der Dekondensation Assay. Die Gruppe von Chromosomen zu Beginn der Reaktion sichtbar decondenses und geht in einem einzigen, runden und glatten Kern. Wenn das Ei-Extrakt wird durch Saccharose ersetzt puffern das Chromosom Cluster bleibt Kondenswasser, die vorschlagen, dass Dekondensation Aktivität im Ei-Extrakt vorhanden ist.

Chromatindekondensation ist...

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Diskussion

Xenopus laevis Eiextrakten sind ein sehr nützliches Werkzeug, um originalgetreu zu reproduzieren zellulären Prozessen in vitro, und dieses System wurde erfolgreich für die Charakterisierung einer Zellzyklus und Zellteilung Ereignisse 2, 3,5,6,17 verwendet. Aufgrund großer speichert der Kernkomponenten in dem Ei während der Oogenese sequestriert sind Eiextrakten eine ausgezeichnete Quelle für zelluläre Bestandteile. Im Vergleich zu anderen Ansätzen wie RNAi auf Säugergewebezelllini...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem ERC (AN377 / 3-2 und 309.528 CHROMDECON zu WA) und ein PhD Fellowship of des Boehringer Ingelheim Fonds unterstützt werden, um AKS Abbildung 1 und 2 werden von Developmental Cell 31 (3), Magalska nachgedruckt et al., RuvB artigen ATPasen Funktion in Chromatindekondensation am Ende der Mitose, 305-318, 2014, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Spermin TetrahydrochloridFluka analytisch85610-25G
SpermidintrihydrochloridSigma S2501-5G
hochreines DigitoninMillipore300410-1GMtoxisches
PMSFApplichemA0999,0100toxisches
ThymidinCalbiochem6060
NocodazolCalbiochem487928giftige
37%ige FormaldehydlösungRoth7398-1giftige
Trypanblaulösung (0,4% )SigmaT8154toxisches
1,4-Dithiothreitol (DTT)Roth6908.2
AEBSF-HydrochloridApplichemA1421.0001
PepstatinRoth2936.1/2/3
Leupeptin,RothCN334
AprotininRothA162.3
Percoll (kolloidale Kieselsäurepartikel GEHealthcare17-0891-01
GlutaminGibco25030-024
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
75 cm² GewebekulturkolbenGreiner Bio-one658175
hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)Gibco10500-064
Homogenisator (40 ml Gewebewolf)Wheaton357546
Neubauerchamber Assistent441/1
  Oak Ridge Zentrifugenröhrchen, Polycarbonat (50 ml)Nalgene3118-0050
100 µ m-Zell-Sieb, NylonBD Falcon352360
Cytochalasin BApplichemA7657,0010toxisches
CycloheximidRoth8682.3toxisches
L-CysteinMerck1.028.381.000
hCG erhältlich als OvogestMSD1431593
PMSG erhältlich als IntergonanMSD1431015
A23187 (gemischtes Calcium-Magnesium-Salz)EnzoALX-450-002-M010giftige
Spritzenkanülen (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")Braun4665120
ATPServa10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20RothK056.1/2/3/4
Kreatinphosphat DinatriumsalzCalbiochem2380
KreatinphosphokinaseSigmaC3755-35KU
DMAPSigmaD2629-1G
DAPI Roche10236276001
PFASigmaP-6148
Zentrifugationsröhrchen für Toxizität für TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 Zoll)Beckman Coulter343775
"Cell-Saver" (Spitzen mit breiter Öffnung, 1.000 & micro; l)Biozym729065
50%ige Glutaraldehyd-Lösung, Grad ISigma alderichG7651-10 mlgiftig
0,1% (w/v) Poly-L-Lysin-LösungSigmaP8920-100 ml
Flachboden-Röhrchen (6 ml, 16,0/55 mm)Greiner Bio-one145211
Vectashield EindeckmediumVector laboratoriesH1000
Rohre für TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 Zoll)Beckman Coulter343778
"Cell-Saver" (Spitzen mit breiter Öffnung, 200 & micro; l)Biozym729055
12 mm DeckgläserThermo Scientific0784 #1

Referenzen

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