Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix. Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht. Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.
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Methodenartikel
Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es wird angenommen, dass die invasive Natur von Krebszelllinien mit ihrem Metastasierungspotenzial korreliert. Die meisten herkömmlichen Assays untersuchen diese invasiven Merkmale jedoch nicht in einer dreidimensionalen Umgebung, und die daraus resultierenden Daten leiden unter einer eingeschränkten biologischen Anwendbarkeit. Hier wird ein Ansatz vorgestellt, um die Invasionsfähigkeit von Zelllinien in einem physiologisch relevanten Setting sichtbar zu machen. Der Assay zur Sphäroidinvasion von Krebszellen nutzt zunächst die Schwerkraft, um Sphäroide in Medientropfen zu erzeugen, die am Deckel einer Zellkulturschale hängen. Anschließend werden diese Sphäroide in eine 3D-Matrix eingebettet, die aus einer Mischung aus Basalmembranmaterialien und Typ-I-Kollagen besteht. Die Auswanderung von Krebszellen von den Sphäroiden in die umgebende Matrix wird dann im Laufe der Zeit überwacht. Das hier beschriebene Verfahren kann modifiziert werden, um die Invasion verschiedener Zelltypen nach Kokultur, den Einschluss von Arzneimitteln/Inhibitoren oder Veränderungen in den Bestandteilen der extrazellulären Matrix (EZM) zu untersuchen.
Einleitung
Wird festgestellt, dass Krebszellbeweglichkeit prädiktiv ist metastatischen Potential, da ein solches Verhalten erleichtert Invasion durch die Basalmembran und den Eintritt in das Kreislaufsystem 1. Die meiste Forschung auf Motilität hat, wie sich Zellen in einem zweidimensionalen (2D) Einstellung, obwohl es immer weitgehend anerkannt, dass die Bewegung von Zellen in einer dreidimensionalen (3D) Matrix ist repräsentativ dafür, wie diese selben Zellen tatsächlich fokussiert verhalten in vivo 2. 3D-Kultursysteme werden zunehmend eingesetzt, um zelluläre Verhaltensweisen, die von Zellmorphologie reichen, um das Wachstum Kinetik und Arzneimittelempfindlichkeit 3 studieren. Der Wunsch, die Invasion von Krebszellen im Rahmen einer 3D Milieu überwacht wurde zur Synthese der zuvor festgelegten Verfahren, bei denen die Erzeugung von 3D-Zellaggregate (Sphäroide) über den hängenden Tropfen Kulturverfahren 4, gefolgt von Einbettung dieser Sphäroide in ein 3D extrazellulärem führten Matrix (ECM) von Kollagen und Basalmembran Materialien 5 zusammengesetzt. Diese Methode dient, auf diese vorher festgelegten Techniken durch Bereitstellung eines optimierten Ansatz, die leicht verwendet werden kann, um das Eindringen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu vergleichen verbessern.
Weitere traditionelle Wege, um Zellbeweglichkeit in vitro zu beurteilen sind die kratz gewickelt Assay und die Transwell Assay 6. Erstere Assay zeigt Zellmotilität in einem 2D-Einstellung und ist daher unabhängig von einer Vielzahl von Funktionen kritisch für die in vivo-Invasion, zum Beispiel Proteaseaktivität 7. Die Transwell-Assay kann besseres Modell Zellinvasion, wenn die auch Einsätze mit ECM Substrate jedoch nur einen einzelnen Parameter beschichtet, dh das Auftreten von Zellen, die auf der gegenüberliegenden Membranoberfläche gemessen wird, und viele Nuancen der Zellinvasion sind daher nicht leicht beobachtbar. Im Gegensatz zu diesen Techniken ist die Krebszelle Sphäroid Invasionsassay (Abbildung 1 </ strong>) ermöglicht die Echtzeit-Überwachung der Zellinvasion in einer Umgebung, die nicht nur physiologisch relevant, sondern erlaubt auch die wichtigen Zelllinie spezifische Merkmale sichtbar zu machen, wie einzelne vs. kollektiven Zellmigration 8. Dieses Verfahren bietet auch Vorteile gegenüber Standard-3D-Kulturwachstums-Assays. Die Erzeugung von Zellaggregaten über die Hängetropfenmethode zunächst schränkt Zellbewegung, so dass Zellen Anreize zu erobern, nachdem diese Einschränkung aufgehoben werden. Darüber hinaus einmal, dass Zwang angehoben wird, wird Zell Egress gehen in eine einheitliche Richtung, die dann bequem quantitativ bestimmt werden kann.
Die für die Krebszelle Sphäroiden Assays verwendet beliebtesten ECM Materialien sind Matrigel und Kollagen Typ I, wobei jede dieser Komponenten hat wichtige und unterschiedliche Rollen bei der Beeinflussung metastatischen Verhalten. Matrigel ist eine sekretierte Proteingemisch von Engelbreth-Holm-Swarm-Maus Sarcomazellen erzeugt und in baseme angereichertnt Membranproteine wie Laminin, Entactin und Kollagen Typ IV 9. Aus diesem Grund Matrigel wird fortan als "Basalmembran Materialien." Diese Basalmembran Materialien liefern wichtige Liganden für Integrin Haftung während Invasion von Krebszellen 10 zusätzlich zu vielen anderen Proteinen, die eine Reihe von Auswirkungen auf das Verhalten der Zelle 11 auszuüben brauchte. Im Vergleich Kollagen Typ I, die gemeinhin aus sauren Aufschlüssen von Sehnen und anderen dichten Kollagenstrukturen 12 hergestellt wird, ist eine viel einfachere Matrixmaterial, das als Hauptstrukturelement des Bindegewebes und Stroma Stützgewebe und Organen des Körpers dient. Es hat sich gezeigt, dass die physikalischen Eigenschaften von Kollagen können eine Reihe von Merkmalen der Zellmotilität regeln; zum Beispiel die Ausrichtung der Kollagenfasern in den Tumor-Stroma-Schnittstelle ermöglicht die Krebszellen zu migrieren anschließend entlang dieser Fibrillen, wenn eindringende in das Stroma 13. In dem Assay hier präsentierten sowohl Typ I-Kollagen und Basalmembran-Materialien werden als Werkzeuge, um 3D-Zell-Stroma-Interaktionen zu untersuchen nutzt.
Die Wirkung der Inhibierung oder Stimulierung von Bahnen, die Invasion überwacht, nachdem die Zellen in die 3D-Matrix eingebettet werden, zu steuern. Zellen können während des Wachstums in den hängenden Tropfen oder bei Übertragung der 3D-Kultur, abhängig davon, ob eine längere Behandlung erforderlich, um Invasion modulieren vorbehandelt werden. Für kürzere Behandlungs, ist es empfehlenswert, dass das Medikament mit dem Sphäroid Suspension nach der Erfassung, sowie die Medien, die den 3D-Kulturen umgeben wird, um eine angemessene Arzneimittelexposition zu den Zellen erleichtern gemischt werden. Als nächstes kann normal oder Tumor-assoziierten Stromazellen mit dem Matrixmaterial vermischt werden, um ihre Rolle bei der Modulation der Tumorzellinvasion zu bewerten, oder um festzustellen, wie parakrine und autokrine Signalisierung Einflüsse Zellverhalten. Diese Idee wurde in einer Studie gezeigt, wo die Co-Kultur von colüber Krebs und Endothelzellen in hängenden Tropfen zu einer Gefäßnetz innerhalb der Sphäroide 14. Schließlich kann das ECM Komponenten auch verändert werden, da Invasion von Krebszellen wird durch verschiedene Substrate 15 belastet. Die unten dargestellten Verfahren wird somit ein Rahmen für die Beurteilung Invasion von Krebszellen unter einer Vielzahl von Bedingungen. Allgemein wurde festgestellt, dass nicht alle Zelllinien Sphäroide in den hängenden Tropfen zu erstellen und epithelialen gerichteten Zelllinien bilden in der Regel regelmäßige Sphären.
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Protokoll
1. Erzeugung von Spheroids
- Vorbereitung Einzelzellsuspension für hängende Tropfen Kulturen durch Ablösen haftKrebsZellKulturen von ~ 70% Konfluenz unter Verwendung eines PBS-Wasch durch Belichtung mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung.
- Neutralisieren die Trypsin-Lösung mit Zellkulturmedien und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Aliquots der Zellsuspension. Anmerkung: Die spezifische Zellkulturmedien werden auf der Zelllinie abhängig getestet. Folgen ATCC Medienempfehlungen, wobei die Zellkulturmedien typischerweise DMEM + 10% FBS. Weitere Informationen finden Sie in der Werkstoff-Tabelle gefunden werden.
- Führen eine Verdünnung für die Aussaat von 500-1000 Zellen pro 20 ul Tropfen der Zellkulturmedien ermöglichen.
- Erwerben Sie 10 cm Schüssel und 5 ml sterilem PBS auf den Grund. Hinweis: Dieser Schritt schützt den hängenden Tropfen aus der Verdampfung. Kostengünstigere "bakteriologischen grade" Gerichte können an Stelle der Zellkultur Geschirr verwendet werden, wie Zellen nicht conthandeln die Kulturfläche.
- Verwenden einer Mehrkanal-Pipette 20 ul Tropfen der verdünnten Zellsuspension auf die innere Oberfläche des Deckels übertragen.
- Pipette 40 Tropfen (5 Reihen von 8 Tropfen) auf dem Deckel des 10 cm-Schale.
- Kehren Sie die Deckel und Platz über der Kulturschale. Der hängende Tropfen Kulturen bei 37 ° C inkubieren 72 h bis Sphäroide zu erzeugen.
- Klappen Sie den Deckel in eine selbstbewusste, dennoch kontrolliert. Hinweis: Invertierung des Deckels zu schnell oder zu langsam, kann dazu führen, die Tröpfchen zu verschieben. Einige Zelllinien können Sphäroiden in 48 Stunden oder weniger zu bilden, während andere erfordern mehr als 72 Stunden, um kompakte Aggregate zu erzeugen.
2. Einbetten von Sphäroiden in 3D-Matrix
- Auftauen eines Aliquots Wachstumsfaktor reduziert Basalmembran Stoffe bei 4 ° C über Nacht vor dem Einbetten der Sphäroide.
- Optional: Layer Vertiefungen mit ECM im voraus, um mögliche Sphäroid Wechselwirkung mit dem Gewebe zu verhindern cultuwieder auftauchen.
- Jeweils 200 ul ECM pro Well auf einer 24-Well-Platte.
- Kippen Sie die Platte, um sicherzustellen, dass das ECM umfasst die gesamte Erdoberfläche.
- Überschüssige ECM Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette.
- Die Platte, bis die Brunnen sind trocken: 3 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Optional: Layer Vertiefungen mit ECM im voraus, um mögliche Sphäroid Wechselwirkung mit dem Gewebe zu verhindern cultuwieder auftauchen.
- Sammeln der Sphäroide durch Kippen des Deckels der Gewebekulturschale und das Poolen der Medien. Übertragen Sie die Medien mit den Sphäroiden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Gestatten 10 min für die Sphäroide, sich am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu regeln. Sphäroiden sollte mit dem Auge sichtbar sein.
- Mischungs 100 ul der Basalmembran Materialien mit 100 ul kaltem (4 ° C) Kollagen vom Typ I in einem separaten vorgekühlte Röhrchen. Halten der Mischung bei 4 ° C entweder Gel verfestigt vorzeitig zu verhindern.
- Verwenden Sie vorgekühlte Pipettenspitzen, wenn die Übertragung kleiner Volumina.
- Geben Sie vorsichtig, wenn SieMischen der Basalmembran Materialien und Kollagen Typ I, um Luftblasenbildung zu verhindern. Anmerkung: Luftblasen können Abbildungs später in dem Protokoll zu behindern, wenn sie in dem Gel eingebettet werden.
- Absaugen Sphäroide aus der 40 ul Bodenabschnitt des Mikrozentrifugenröhrchens, und verbinden sich mit der Basalmembran Stoffe / Kollagen Typ I-Gemisch. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasenbildung beim Mischen zu verhindern. Anmerkung: Die Lösung, die von 100 ul Basalmembran Materialien 100 ul Kollagen Typ I, und 40 ul der Sphäroide genügend Material für 4 unabhängige 3D Kulturen zu schaffen. Dies kann nach oben oder unten skaliert werden.
- Pipette 40 ul Tropfen der viskosen Mischung in die Zentren der Vertiefungen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen. Halten Sie die Platte Ebene, um die Mischung aus Laufen in die Seite des Bohrlochs zu verhindern. Hinweis: Eine einzelne Spalte auf der 24-Well-Platte - 4 Brunnen - wird empfohlen, für jede Bedingung getestet werden.
- Legen Sie die Platte intoa 37 ° C-Inkubator und lassen Sie ungestört für 30 Minuten. Die 3D-Kultur wird in diesem Zeitraum zu polymerisieren.
- Langsam tauchen die 3D-Kulturen in 1 ml Zellkulturmedien.
- Stellen Sie sicher, dass die Medien ist warm, wenn Sie die Ware in die Vertiefungen zur weiteren Förderung Gelpolymerisation.
- Wichtiger Schritt: die Medien, um die 3D-Kulturen hinzuzufügen vorsichtig. Pipettieren der Medien zu schnell in die Vertiefungen können zur Ablösung der 3D-Kulturen aus dem Gewebekulturoberfläche führen.
3. Überwachung und Analyse der Spheroid Invasion
- Bild Invasion aus der Sphäroide in das umgebende 3D-Matrix bei vom Forscher beschlossen Zeitpunkten. Erwerben Fotografien mit einem inversen Mikroskop mit 20-facher Objektivlinse. Anmerkung: Ideal Zeitpunkten in Abhängigkeit von der Zelllinie getestet abweichen. Invasiveren Zellinien ihre Austritt aus den Sphäroiden kurz nach der Plattierung zu beginnen, und daher nehmen anfängliche Fotografies innerhalb von ein paar Stunden nach der Plattierung. Im Allgemeinen werden Fotografien bei 0 h (nach der Beschichtung), 24 h und 48 h entnommen. Invasion, schließt in der Regel 24 bis 48 Stunden nach der Plattierung.
- Quantifizieren invasive Möglichkeit, anhand der Bildanalyse-Software wie Bild J.
- Analyse Invasion als der Zellenabstand von der Kante des Sphäroids.
- Verwenden Sie den Straight Draw-Tool, um den Radius und / oder maximale invasive Entfernung zu markieren.
- Klicken Sie auf "Analysieren" in der oberen Menüleiste und klicken Sie auf "Messen", um die Längenmessung anzuzeigen.
- Analysieren Invasion als der Gesamt invasive Bereich außerhalb der Sphäroid.
- Verwenden Sie die Freihand-Zeichenwerkzeug, um die Grenze des Sphäroids und / oder Gesamt invasive Bereich zu verfolgen.
- Klicken Sie auf "Analysieren" in der oberen Menüleiste und klicken Sie auf "Messen", um die Flächenmessung anzuzeigen.
- Verwenden Sie ein Plugin wie ROI Manager Tools, um Messungen für einen Stapel von Bildern erstellen.
- Analyse Invasion als der Zellenabstand von der Kante des Sphäroids.
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Ergebnisse
Verwendung des Sphäroids Invasionsassay (Abbildung 1), eine Reihe von Krebszelllinien wurden auf ihre Fähigkeit zur Sphäroide als auch für die Höhe der Zelle Austritt nach der Implantation in einer 3D-Matrix gezeigt, die aus Basalmembran Materialien und Typ I-Kollagen zu bilden getestet (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht jeder Krebszelllinie wird wohlgeformt Sphäroiden, wo Zelllinien besitzen eine epitheliale Morphologie in vitro neigten dazu, regelmäßige und glat...
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Diskussion
In dieser Studie wurde die Leistung einer Reihe von Krebszelllinien in einem Sphäroid Invasionstest (Tabelle 1). Im Allgemeinen finden wir, dass Sphäroidbildung ist in den mehr epitheliale gerichteten Zelllinien, bei denen die Anwesenheit von Zell-Zell-Verbindungen fördert die Bildung von einem Sphäroid-like-Architektur verbessert. Bekannten Zelllinien, welche eine epitheliale-mesenchymale Transition erfahren haben, wie MDA-MB-231-Zellen nicht Sphäroide im Drop Kultur wahrscheinlichste hängenden bilden ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Unterstützt von NIH Zuschüsse P30 CA051008 und T32 CA009686 (ATR).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Matrigel Wachstumsfaktor reduziert | Corning | CB-40234 | |
| Kollagen Typ I, Rattenschwanz, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Mittel; | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviert | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-behandelte Schalen | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-Well-TC-behandelten Platten | NEST Biotechnlologie | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverses Mikroskop | |||
| Zelllinien wurden in DMEM + 10 % FBS gehalten, mit der Erwartung von BT-474- und LNCaP-Zellen, die in RPMI + 10 % FBS gehalten wurden. |
Referenzen
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
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