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Methodenartikel

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen

20.4K Aufrufe

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DOI:

10.3791/53422

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14. Januar 2016

 ,  ,  , 
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine ​​in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.

Zusammenfassung

Komplizierte genregulatorische Netzwerke orchestrieren biologische Prozesse und Entwicklungsübergänge in Pflanzen. Die selektive transkriptionelle Aktivierung und das Silencing von Genen vermitteln die Reaktion von Pflanzen auf Umweltsignale und Entwicklungssignale. Daher sind Einblicke in die Mechanismen, die die Genexpression von Pflanzen steuern, unerlässlich, um ein tiefes Verständnis dafür zu erlangen, wie biologische Prozesse in Pflanzen reguliert werden. Die hier beschriebene Chromatin-Immunpräzipitationstechnik (ChIP) ist ein Verfahren zur Identifizierung der DNA-Bindungsstellen von Proteinen in Genen oder genomischen Regionen der Modellspezies Arabidopsis thaliana. Die Wechselwirkungen mit der DNA von Proteinen von Interesse wie Transkriptionsfaktoren, Chromatinproteinen oder posttranslational modifizierten Versionen von Histonen können mit dem ChIP-Protokoll effizient analysiert werden. Diese Methode basiert auf der Fixierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo, der zufälligen Fragmentierung von Chromatin, der Immunpräzipitation von Protein-DNA-Komplexen mit spezifischen Antikörpern und der Quantifizierung der DNA, die mit dem interessierenden Protein assoziiert ist, durch PCR-Techniken. Die Anwendung dieser Methodik in Arabidopsis hat wesentlich dazu beigetragen, transkriptionelle Regulationsmechanismen aufzudecken, die eine Vielzahl von pflanzenbiologischen Prozessen steuern. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifizierung der Bindungsstellen des Arabidopsis-Chromatinproteins EBS an regulatorische Regionen des Master-Gens der blühenden FT. Der Einfluss dieses Proteins auf die Akkumulation bestimmter Histonmarkierungen in der genomischen Region von FT wurde auch durch ChIP-Analyse aufgedeckt.

Einleitung

In den letzten Jahren eine Vielzahl von genetischen, molekularen und genomischen Werkzeuge wurden in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana entwickelt. Diese Technologie hat sich enorm die Fortschritte im Verständnis, wie die Pflanzenentwicklung reguliert wird erleichtert. Unter den Entwicklungsprozesse untersucht unter Verwendung von Arabidopsis als Modell hat sich die genetische Kontrolle der Blütezeit wurde ausgiebig untersucht. Diese Studien haben gezeigt, dass Pflanzen modulieren, sehr genau den Zeitpunkt der Blüte als Reaktion auf endogene Signale wie Hormone und Alter der Anlage, aber auch auf Umweltsignale, wie beispielsweise Fotoperiode und der Temperatur, die der Blüte synchronisieren Zeit mit den natürlichen Kreislauf der Jahreszeiten 1, 2. Die Isolierung und Charakterisierung von Arabidopsis-Mutanten mit Veränderungen in der Zeit der Blüte wurde Determinante Enthüllung eines komplexen Netzwerks von Genen, die die Blütezeit als Reaktion auf endogene und Umweltfaktoren zu regulieren. Diese genetischen Schaltkreiseauf der Ebene der wenigen Master-Gene, die als Schalter der Blüte handeln integriert, und der genaue Zeitpunkt der Initiierung Blumen hängt von der Balance der Blüte zu fördern und zu verdrängen Aktivitäten, die stromaufwärts von den Blumen Integrator-Gene 1,3 zu arbeiten.

Die funktionelle Charakterisierung von Genen, die für ihre Rolle bei der Kontrolle der Blüte Einleitung identifiziert, von der jüngsten Nutzung genomischer Ansätze unterstützt, haben die zentrale Rolle der Transkriptionsregulation bei der Modulation der Blütezeit ergab. In der Tat, viele der Mastergene der Blüte kodieren Transkriptionsfaktoren 4. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Chromatin-Remodeling-Protein-Komplexe beeinflussen die Expression der Mastergene der Blüte. Eine Anzahl der Arabidopsis-Mutanten auf ihre veränderten Blühzeit isoliert erwies sich Mutationen in Genen eine Vielzahl von Chromatin Modifikatoren kodiert tragen. Verschiedene Chromatin remodelers die posttranslationale Modifikationen in Histon einzuführene Schwänze, neu zu positionieren Nukleosomen relativ zur DNA oder kanonischen Histone austauschen durch Histon-Varianten sind für die ordnungsgemäße Regulierung der Blüte in Arabidopsis 5,6. Einige dieser Chromatin-Remodeling-Aktivitäten katalysieren die Ablagerung oder Entfernung von kovalenten Modifikationen wie Acetylierung oder Methylierung spezifischer Histon-Resten. Diese Histonmarkierungen werden spezifisch durch spezialisierte Effektoren, die andere Chromatin-Remodeling-Komplexe, Transkriptionsfaktoren oder Komponenten der Transkriptionsmaschinerie zu rekrutieren, um die Transkriptionsaktivität der Blüte Gene regulieren erfasst.

Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ermöglicht die Identifizierung von in vivo-DNA-Bindungsstellen für Proteine ​​von Interesse (Abbildung 1). Dieses Verfahren nutzt die Fähigkeit von bestimmten Chemikalien zu vernetzen, die Proteine ​​mit der DNA. Die resultierenden DNA-Protein-Komplexe können dann unter Verwendung von spezifischen Antikörpern immunpräzipitiert werden against Transkriptionsfaktoren, Chromatin-bindende Proteine ​​oder bestimmte Modifikationen und heterologe Epitope zu dem Protein der Wahl angebracht (im allgemeinen als "Tags" genannt). Die aus diesen Immunpräzipitaten gereinigte DNA kann als Matrize in quantitative PCR (qPCR) Reaktionen verwendet werden, um für die Anreicherung bestimmter Sequenzen von Interesse zu bewerten. Auf diese Weise können die Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren oder die Verteilung Histonmarkierungen in bestimmten Genen 7,8 hergestellt werden. Darüber hinaus kombiniert mit Next Generation Sequencing (NGS), die massiv parallele Sequenzierung ermöglicht, Chip-Technologie ist möglich, die genomweite Identifizierung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren sowie Enthüllung epigenomischen Landschaften von Histon-Modifikationen vorgenommen. Ferner ist die gleichzeitige Analyse der Genexpression ermöglicht die Überwachung, wie die Bindung von Transkriptionsregulatoren oder die Abscheidung insbesondere Histonmarkierungen korrelieren mit der Transkriptions activity von Genen 9.

Die Verwendung von Chip-Protokolle in Arabidopsis hat es die Bewertung der Auswirkungen, dass eine Vielzahl von Transkriptionsregulatoren haben auf der Chromatin-Organisation des Mastergene der Blüte und wie diese strukturellen Veränderungen beeinflussen die Genexpression 5,6. Vorherige Ergebnisse zeigten, dass die Arabidopsis-Locus EARLY BOLTING im Kurztag (EBS) als Repressor der Blüte und Mutanten in diesem Gen zeigen eine Beschleunigung der Blüte und Hochregulation von dem Master-Gen der Blüte FT wirkt. Darüber hinaus loss-of-function Mutationen im FT vollständig zu unterdrücken, die früh blühende Phänotyp der ebs mutierten Pflanzen, die anzeigt, dass FT wird für die vorzeitige Blüte der ebs Mutanten und dass EBS ist für die Unterdrückung von diesem Meister-Gen der Blüte 10 erforderlich erforderlich , 11. EBS kodiert ein PHD-haltigen Protein, das spezifisch binden können Histon H3 Di- und in th trimethyliertese Lysin 4 Rückstand (H3K4me2 / 3), was auf eine Rolle für die EBS in der Chromatin-vermittelten Repression der FT 12. Die Verwendung des Chips Ansatz gezeigt, dass die Arabidopsis PHD-enthaltendes Protein EBS 10,11 bindet regulatorischen Regionen des Blumen Integrator Gen FT seinen Ausdruck 12 zu unterdrücken. Durch die Verwendung von Chip-Technologie erhalten zusätzliche Daten zeigen, dass dieses Protein ist erforderlich, um niedrige Histonacetylierung, ein Markenzeichen der aktiven Transkription im Chromatin dieser Mastergens der Blüte während Anfangsstadien von Arabidopsis Entwicklung. Diese Beobachtungen zusammen mit genetischen und Genexpressionsdaten, zeigen, dass diese Arabidopsis PHD haltige Protein hat eine zentrale Rolle bei der Feinabstimmung der Blütezeit durch Modulation der Expression des Blumen Integrator Gen FT 12. Die vorliegende Arbeit stellt ein optimiertes Verfahren nützlich, nicht nur für die Analyse von Histonen sondern auch für andereChromatin-assoziierten Proteinen, und mit mehr Effizienz und weniger Versuchszeit. Darüber hinaus zeigt dieser Bericht, wie die Verwendung von Chip-Protokolle hat neue Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen Veränderungen der Chromatinstruktur Modifikationen und Transkriptions Staaten von Pflanzengenen diese Chromatin-vermittelten Mechanismen der Gen-Expressionskontroll Auswirkungen auf den Beginn der Blüte in Arabidopsis vorgesehen ist, und wie.

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Protokoll

1. Die Vernetzung des Pflanzenmaterials (1 h)

  1. Wachsen die Arabidopsis-Linien in dem Experiment verwendet (Wildtyp - WT - gegen Mutanten und / oder Linien der markierten Version des Proteins von Interesse im Vergleich zu Linien das Tag zum Ausdruck bringen zum Ausdruck zu keinem Protein fusioniert) für 12-18 Tage auf großen Petrischalen (150 mm) mit MS-Agarmedium (1 L: 1x Murashige & Skoog-Salze, 10 g Sucrose, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% Agar). Alternativ wachsen Pflanzen auf Töpfe mit 3: 1 Mischung aus Erde und Vermiculit.
    VORSICHT! Formaldehyd ist giftig beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken und sollte in einer chemischen Abzugshaube trägt geeignete persönliche Schutzausrüstung handhaben. Schritte 1,2-1,6 sollte unter dem Abzug durchgeführt werden.
  2. Stellen kleine Löcher in den Deckel der 50-ml-Röhrchen mit einem Laborbrenner heizten Nadel. 40 ml 1x PBS-Puffer und 1,08 ml Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 1% (stock 37% solution). Sammeln 1,5 g Pflanzenmaterial in den 50-ml-Röhrchen. Während der Vernetzung Halten Sie die Röhrchen auf Eis.
  3. Schließen Sie die 50-ml-Röhrchen mit dem Deckel. Die Röhrchen in einem Exsikkator und gelten Vakuum. Vacuum infiltrieren das Gewebe für 10 Minuten, dann lassen Sie das Vakuum vorsichtig, am laufenden Band die Lösung zu verhindern. Mischen Sie die Probe. Zweimal wiederholen. Nach der Infiltration des Pflanzenmaterials zu beobachten und bestätigen, dass sie leicht durchscheinend wird, und neigen dazu, an der Unterseite des Rohres (2) zu sinken.
  4. Hinzufügen von 2,5 ml von 2 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M zu erreichen Anwenden Vakuum 5 min. Glycin wirkt als kompetitiver Inhibitor von Formaldehyd vernetzt.
  5. Verwerfen die PBS formaldehyd Glycin-Lösung durch Invertieren des geschlossenen 50-ml-Röhrchen mit Löchern im Deckel.
  6. Zweimal mit 1 × PBS und einmal Spülen Sie die Pflänzchen mit Wasser Verwerfen der Waschlösung, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Trocknen Sie sie auf ein Papiertuch und frieren in flüssiger nitrogen.
    HINWEIS: Gefrorenes Gewebe kann bei -80 ° C für Wochen aufbewahrt.

2. Herstellung der Antikörper (1 Tag)

HINWEIS: Immunpräzipitation wird die Verwendung von mit Antikörpern über eine Protein G oder Protein A-Linker mit einer hohen Affinität für die konstante Domäne der Antikörperschwerkette konjugierte magnetische Perlen empfohlen. Die DNA-Protein-Komplexe können unspezifisch an der Oberfläche der Kügelchen-Antikörper-Konjugate zu befestigen. Aus diesem Grund ist es notwendig, Kontrollen ohne spezifische Antikörper durchzuführen, um die nicht-spezifische Hintergrundbindung zu quantifizieren.

  1. Für jede Immunpräzipitation vorzubereiten 15 ul magnetischen Perlen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die Menge der Kügelchen hängt von der Menge des Chromatin für die Immunpräzipitation als auch an den Antikörper verwendet.
  2. Zu waschen, 1 ml Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Verdünnungspuffer an die Beads, mischen durch Rotation und legen Sie die 1,5 ml Mikro tuwerden in einem Magnethalter. Warten Sie etwa 1 min zu lassen, die Kügelchen mit dem Magneten befestigen. Mit der 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen noch im Rack, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Zweimal wiederholen.
    HINWEIS: Für jedes Pflanzenlinie zwei Immunpräzipitation Sätzen benötigt werden: eine mit den Perlen und Antikörper (Ab), und eine zweite ohne Antikörper (No-Ab) Steuerung mit nur magnetischen Kügelchen.
  3. Resuspendieren der Kügelchen in 200 ul ChIP Verdünnungspuffer. Die erforderliche Menge des spezifischen Ab, um eine der beiden Röhren für jedes Pflanzenlinie hergestellt (die genaue Verdünnung unterscheidet sich für jeden Ab und muss experimentell optimiert werden oder, im Falle der kommerziellen Antikörper, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers). Verwenden Sie dieses Beispiel für die Immunpräzipitation. Dieselbe Menge an unspezifischer IgG zu der anderen Röhre, die als negative Kontrolle verwendet wird.
  4. Inkubieren O / N auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C der Antikörper an die Kügelchen zu befestigen zu lassen.

3. Chromatin Extraction (4 Stunden)

  1. Mahlen gründlich die gefrorene Pflanzenmaterial in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel, bis das Pulver homogen wird und hellgrün. Übertragen Sie das Pulver auf ein neues 50-ml-Tube.
  2. Für die Schritte 3,2-3,6, Arbeiten unter dem Abzug. In 30 ml Extraktionspuffer 1 (ExB 1), und gut mischen, um das Gewebepulver einweichen. Von diesem Schritt an, behalten die Proben bei 4 ° C zu allen Zeiten. Gefrorenes Gewebe und flüssigen Stickstoffreste bewirkt, dass der Puffer zu frieren. Achten Sie auf die gefrorene Gewebe vollständig durch Umdrehen der Röhrchen 4-5 mal alle 2 min auftauen.
  3. Beseitigen Sie den Brei, indem es durch eine Filtergewebe mit einer Porengröße von 22 bis 25 & mgr; m in ein neues 50 ml Zentrifugenrohr und es bei 1.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden die Kerne und alle Organellen zu pelletieren. ExB 1 enthält genügend Saccharose in hoher Dichte und die Verhinderung einer Unterbrechung der Organellen-Struktur.
  4. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Dekantieren. Zu diesem stage, beobachten einen grünen Pellets von etwa 2 ml.
  5. Das Pellet in 5 ml ExB 2. Resuspension des Pellets wird schwierig sein, an dieser Stelle. Zentrifuge bei 1000 × g für 10 min bei 4 ° C.
    HINWEIS: ExB 2 enthält 1% Triton X-100 zu platzen helfen, das Chloroplasten öffnen und entfernen Chlorophyll.
  6. Das Pellet in 300 ul Extraktionspuffer 3 (ExB 3).
  7. In einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 600 ul des ExB 3. Nehmen Sie das resuspendierte Pellet aus Schritt 3.6 und sorgfältig Schicht ist auf der Oberseite des sauberen ExB 3.
  8. Spin für 1 Stunde bei 16.000 × g bei 4 ° C.
    Hinweis: Dieser Schritt hilft Entfernen des Detergens aus der Probe.
  9. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen mit einer Pipette. Resuspendieren Kernpellet in 300 ul Beschallungspuffer durch langsames Auf- und Abpipettieren um eine Blasenbildung zu vermeiden, die Beschallung Leistungsfähigkeit beeinflussen können. Sorgfältig pipettieren ganze Suspension heraus und überträgt es auf ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: DiesePuffer enthält SDS, um die Kerne zu lysieren und lassen Sie die Chromatin.
  10. Beschallen der Suspension, um die Kerne zu lysieren und nach dem Zufallsprinzip scheren die Chromatinstruktur in kleine Fragmente. Verwenden Beschallung Bedingungen, die Chromatin in Fragmenten zwischen 200-800 bp angereichert (20-30 Zyklen mit den Einstellungen 30 s ON / OFF 30 Sekunden bei 4 ° C für die Beschallungsgerät in der Tabelle von Materialien / Reagenzien beschrieben) zu rendern. Die Funktionstüchtigkeit der Beschallung durch elektrophoretische Auftrennung der erhaltenen DNA-Fragmente auf einem Agarosegel 13, Beladung 2 ul beschallt Chromatin (Abbildung 3).
    VORSICHT! Achten Sie darauf, Gehörschutzausrüstung während der Beschallungsschritt bei der Ultraschall-Gerät nicht in einem schalldichten Gehäuse enthalten tragen.
    Entscheidenden Schritt! Das Chromatin Fragmentierung hängt weitgehend von der Beschallungstechnik. Die Beschallung Bedingungen sollten angepasst werden, um die Anreicherung in den entsprechenden DNA-Größen zu erreichen. SehenFigur 3 für ein Beispiel dafür, wie Chromatin-Fragmentierung zu optimieren.
  11. Drehen die Lösung einmal bei 12.000 g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand mit einer Pipette in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie das Pellet. Nehmen 1/10 der Überstand in ein neues 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, markieren ihn als Eingabe und Einfrieren bei -20 ° C.
  12. Verdünnen Sie die Chromatin 10x mit Chip Verdünnungspuffer, um SDS zu Endkonzentration von 0,1% zu verdünnen.
    Bemerkung: Die Proben können eingefroren und bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.

4. Immunpräzipitation des Proteins von Interesse und Rettung von DNA (1 Tag, 3 Stunden)

  1. 2.4 dreimal Waschen Sie die mit dem Ab-beschichteten Kügelchen aus Schritt mit 1 ml ChIP Verdünnungspuffer, um Überschuß an Antikörper zu entfernen, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Resuspendieren in 200 ul Verdünnungspuffer ChIP. In 50 ul isolierten Chromatin. Inkubieren O / N auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die concentratiauf der Chromatinstruktur in Mikrovolumen UV-Vis-Spektralphotometer. 50 ul von isolierten Chromatin sollte mehr als 10 & mgr; g DNA enthalten.
  2. Für die Schritte 4,2-4,5 Arbeit in 4 ° C. Zweimaliges Waschen der Kügelchen in 1 ml salzarmen Waschpuffer wie in Schritt 2.2 beschrieben.
  3. Einmal in 1 ml High Salt Waschpuffer Waschen der Kügelchen.
  4. Einmal in 1 ml LiCl Waschpuffer Waschen der Kügelchen.
  5. Zweimal in 1 ml TE-Puffer Waschen der Kügelchen. Nach dem letzten Wasch, stellen Sie sicher, vollständig zu entfernen die TE-Puffer in der Röhre nach links durch Absaugen mit einer Pipette.
  6. Nehmen Sie die INPUT-Proben (Schritt 3.9). Transfer 5 ul der Eingabe in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und weiter wie mit dem Chip-Proben. Reverse-Vernetzung durch Zugabe von 200 ul 5% chelatbildenden Ionenaustauscherharzes, und Inkubation für 10 min bei 95 ° C, alle 2-3 min schütteln. Spin down bei 16.000 × g für 30 Sekunden und der Überstand vorsichtig übertragen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen durch Pipettieren.
    HINWEIS: Während der trasätzliche Verfahren zum Vernetzen Umkehr beinhaltet eine O / N Inkubation mit NaCl, die Inkubation mit einem chelatbildenden Ionenharz bei 95 ° C ermöglicht eine effiziente Entnetzung und Elution der DNA in 10 min, daher macht das Protokoll einen Tag kürzer.
  7. Add 2 ul Proteinase K (10 mg / ml) und bei 37 ° C für 30 min, um Proteine ​​zu verdauen und zu lösen DNA.
  8. Die Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min.
  9. Schnell Spin bei 16.000 × g für 30 Sekunden und Überstand in ein neues Röhrchen durch Pipettieren.
  10. Reinigen Sie die DNA mit einem Standard-DNA-Fragmente Purification Kit isoliert.
    HINWEIS: Gehen Sie nach den Anweisungen des Herstellers.
  11. Übertragen Sie die DNA-Bindungssäule aus dem Kit in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Elution der gereinigten DNA durch Zugabe von 20 ul DNase-freiem Wasser zum Zentrum der Säule und Zentrifugieren bei 16.000 xg für 60 sec. Haltepunkt: Die Proben können bei -80 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.

5. Mess Fülle von Bindungsstellen in der immunpräzipitierten DNA durch qPCR (4 h)

HINWEIS: DNA vom ausgefallenen Chromatin isoliert muss analysiert werden, um zu bestimmen, welche DNA-Fragmente aus der Gesamt Chromatin gewesen ChIP-ED, aufgrund ihrer Bindung an das Protein von Interesse.

  1. Design von Primern für die genomischen Regionen von Interesse mit einer Schmelztemperatur (Tm) von 60 ° C und einem GC-Gehalt von 30% -80%. Chromatin ist durch Beschallung fragmentiert, sollte die Länge der amplifizierten Sequenz von nicht mehr als 150-200 Nukleotiden (Tabelle 1).
    HINWEIS: Ein nützliches Werkzeug für die Primer-Design ist Primer-3-Programm (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Zusätzliche Leitlinien für die Primer-Design sind in früheren Berichten 8 verfügbar, 14,15.
  2. Verwenden Sie einen BLAST-Programm, um sicherzustellen, dass die Primer spezifisch sind (insbesondere Promotoren können ähnliche TF Bindungssequenzen zu teilen) und testen Sie die Primereffizienz using 1:10 Verdünnungen in der Wasser der eingesetzten DNA (Schritt 4.9). Bestimmte Bereiche des Genoms wird besser als andere gereinigt werden. Es ist daher wichtig, um PCR-Primer zu entwerfen und überprüfen sie auf das verdünnte Eingangs DNA.
  3. Verdünnen der gereinigten DNA 1:10 mit Wasser und Pipetten 5 ul der verdünnten DNA in einem PCR-Röhrchen für jede Reaktion.
    HINWEIS: Verdünnen nur die benötigte Menge, da DNA an den Wänden der 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu befestigen. Mehrere Auftauen Gefrierzyklen erhöhen die Anzahl der DNA-Moleküle gebunden. Für jedes Primerpaar, Verstärkung in der Eingangs hat Ab-Chip und No-Ab ChIP analysiert werden.
  4. Um die PCR-Mix abzuschließen, ergänzen SYBR Green PCR Master-Mix zu einer Endkonzentration von 1X, und 0,5 & mgr; M von jedem Primer. Füllen Sie bis zu 20 & mgr; l mit DNase-freiem Wasser.
  5. Führen Sie die qPCR Reaktion nach den Anweisungen des SYBR Green PCR Master-Mix-Hersteller.

6. Datenanalyse

HINWEIS: Unter dem Exbestehenden Möglichkeiten der Analyse ChIP-Daten, zwei am häufigsten verwendet werden. Der erste von ihnen ist die Falte Anreicherungsmethode, die auch als "relative Anreicherung", "Signal über Hintergrund" oder "gegenüber dem Nicht-Antikörper-Kontrolle" bezeichnet. Das zweite Verfahren wird als "% der Eingang" benannt.

  1. Datenanalyse durch fache Anreicherung Methode.
    1. Erstellen Sie eine Tabelle mit den Proben Namen und raw Ct-Werte, die nach der qPCR Reaktion erhalten wurden.
    2. Für jede Probe subtrahieren seiner rohen Ct-Wert der rohen Ct-Wert für den entsprechenden No-Ab Steuerung erhalten. HINWEIS: Nach dieser mathematischen Operation wird Ct Wert für No-Ab Proben 0 entsprechen.
    3. Berechnen fache Anreicherung durch Potenzierung mit Basis 2 und Exponenten (Leistung) gleich der negativen Rest im Schritt 6.1.2 (Tabelle 2) erhalten.
      fache Anreicherung = 2 - (Ct (Probe) - Ct (No-Ab))
      HINWEIS: In dieser method die Abundanz eines bestimmten DNA-Fragments in dem Chip-ed Probe wird mit der Häufigkeit dieses Fragment in No-Ab Kontrolle verglichen. Die Übernahme dieser Verfahren ist, dass der Pegel des Hintergrundsignals ist reproduzierbar zwischen verschiedenen Primer-Sets, Beispiele und Wiederholungsversuchen. Allerdings tun dies'noise' Signalpegel zwischen Primer-Sets, Proben und Experimente variieren.
  2. Datenanalyse durch% der Eingabemethode.
    1. Erstellen Sie eine Tabelle mit den Proben Namen und raw Ct-Werte, die für sie nach der qPCR Reaktion erhalten wurden.
    2. Einstellen rohen Ct-Werte für Eingangsabtastwerte durch Subtrahieren eines Wertes, der Logarithmus zur Basis 2 aus dem Bruchteil der gesamten extrahierten Chromatin die als Eingabe genommen wurde.
      HINWEIS: In diesem Protokoll der subtrahierte Wert gleich 3,32, als 10% der Gesamt Chromatin als Eingang in dieses Protokoll gemacht. Log 2 (10) ist gleich 3,32.
    3. Berechnen% der Eingangs durch Multiplikation mit 100 den Wert der Potenzierung Betrieb mit base 2 und Exponenten (Leistung) gleich Rest des eingestellten Eingangswerte aus rohen Ct-Werte der Probe (Tabelle 3) subtrahiert.
      % Der Eingangs = 100 * 2 (bereinigtes Eingangs - Ct (Probe))
      HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird das Verhältnis zwischen den spezifischen DNA Fluss in dem Chip-ed Probe zu der Gesamt isolierten Chromatin (Eingangsabtastwert) berechnet. Weitere Einzelheiten zur Chip-Daten-Analyse kann in Haring et al. 8 gefunden werden.

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Ergebnisse

Acht Hauptschritte in diesem Chip-Protokoll zur Identifizierung von in vivo-Protein-DNA-Wechselwirkungen, umfassend das Züchten und Ernten von Pflanzenmaterial, Vernetzen der Chromatin Chromatin Isolierung Chromatin Fragmentierung selektive Isolierung der Komplexe zwischen DNA und vereinzelt werden, das interessierende Protein durch Immunfällung, Proteinverdauung, DNA-Reinigung und qPCR-Analyse (Abbildung 1). Ein entscheidender Schritt in dem Chip-Protokoll ist die Fixierung von DNA-Protein-Int...

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Diskussion

Die hier beschriebene ChIP-Protokoll ist eine reproduzierbare und leistungsfähige Technik, um Wechselwirkungen zwischen Proteinen und spezifischen DNA-Sequenzen in vivo in Arabidopsis-Pflanzen zu analysieren. Eine erfolgreiche Identifizierung von Bindungsstellen für die Proteine ​​von Interesse erfordert eine angemessene Auswahl der Pflanzenorgane oder Entwicklungsstadien, wo die relevanten Wechselwirkungen tatsächlich stattfindet. Darüber hinaus ist es wichtig, eine geeignete Fixierung des Pflanzenmaterials un...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren möchten The Plant Cell dafür danken, dass sie die Verwendung einiger in dieser Zeitschrift veröffentlichter Daten zur Ausarbeitung der hier in Abbildung 4 beschriebenen repräsentativen Ergebnisse gestattet haben. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Marie-Curie-Erstausbildungsnetzwerk EpiTRAITS (Finanzhilfevereinbarung 316965) des 7RP der EU und durch das spanische Ministerio de Economìa y Competitividad (Zuschüsse BIO2010-15589 und BIO2013-43098-R).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MESSigmaM8250
MS (Murashige und Skoog Basalsalzmischung)SigmaM5524
Formaldehyd 37% SigmaF8775-25Unter dem Abzug verwenden
Protease-Inhibitor-Mix cOmplete ULTRA Tabletten, Mini, EDTA-frei, EASYpackRoche5892791001
Bioruptor Standard-BeschallungsgerätDiagenodeB01010002 (UCD200TO)
GlycinSigma50046
QIAquick PCR-AufreinigungskitQiagen28104
Dynabeads magnetische Kügelchen gekoppelt mit Protein A oder Protein GLife Technologies10003D/10001DHersteller prüfen Handbuch für Antikörper-Affinität
MiraclothMerck Millipore475855
Triton X-100 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies85112
(Maus, Ratte, Kaninchen & Hellip;)-IgGDiagenodeC15400001, C15420001, C15410206
Magnetgestell - DynaMag-2Life Technologies12321D
H3K9/14ac polyklonaler Antikörper - Premium DiagenodeC15410200-10
Chelex 100Resin Bio-Rad142-2832
Proteinase KLife Technologies17916
Anti-Myc Tag Antikörper, Klon 4A6Millipore05-724
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001

Referenzen

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