Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional Cre-lox Mausmodelle

Zusammenfassung

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Zusammenfassung

Die epitheliale Oberfläche der Säugerdarm ein dynamisches Gewebe, das alle 3 erneuert - 7 Tagen. Das Verständnis dieser Erneuerungsprozess identifizierten eine Population rasch proliferierender Darm-Stammzellen (ISCs), gekennzeichnet durch ihre Expression des Gens Lgr5. Diese werden von einem ruhenden Stammzellpopulation, von der BMI-1-Expression gekennzeichnet ist, in der Lage, im Falle einer Verletzung ersetzen unterstützt. Die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Rolle in Erkrankungen und Krebs. Die ISCs existieren innerhalb Krypten auf der Darmoberfläche, diese Nischen unterstützen die ISC in Auffüllen der Epithelien. Die Wechselwirkung zwischen den aktiven und ruhenden ISCs wahrscheinlich mit anderen differenzierten Zellen innerhalb der Nische, wie es zuvor gezeigt worden ist, dass die '' stemness '' der Lgr5 ISC ist eng mit der Gegenwart ihrer benachbarten Panethzellen gebunden. Bedingte cre-lox-MausModelle, die wir untersucht den Effekt des Löschens der Mehrzahl der aktiven ISCs in Gegenwart oder Abwesenheit von Paneth-Zellen. Hier beschreiben wir die Techniken und Analysen durchgeführt, um den Darm zu charakterisieren und zu zeigen, dass die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der ISC Nische bei der Unterstützung Erholung nach erheblichen Beleidigung.

Einleitung

Die luminale Oberfläche der Säugerdarm Merkmale Repetiereinheiten der Krypten und fingerartigen Vorsprüngen, bezeichnet Zotten, die in das Lumen ragen. Diese Oberfläche ist eine kontinuierliche Bahn von Epithelien, die komplette Selbsterneuerung etwa alle 3 unterzogen - 4 Tage ^1. Diese dynamische Gewebe wird durch eine Population rasch proliferierender Stammzellen unterstützt (ISCs; auch als Krypta Basis Cylinderzelle bekannt), die zunächst durch ihre Expression des Gens Lgr5 ^2,3 identifiziert wurden. Diese Zellen existieren in einer spezialisierten Nischen am Boden der Krypten der Lieberkühn. Zunächst wird die Feststellung, daß ISCs wurden rasch proliferierender war diskordanten mit der herrschenden Vorstellung, daß eine Stammzelle war Ruhe Natur. Vor der Identifizierung des Lgr5 ⁺ ISC wurde postuliert, dass eine Population von Ruheetikettenhaltende Zellen auf der + 4-Position, relativ zu der Basis der Krypta waren die ISCs ^1. Neuere Forschungen hwie jetzt durch den Nachweis, dass in erster Linie gibt es einen Pool von äquipotent Radfahren ISCs in jeder Krypta, deren Schicksal durch seine Nachbarn ^4,5 reguliert versöhnt diese Beobachtungen. Für den Fall, sie verloren sind diese durch ruhende Zellen, die normalerweise an den sekretorischen Linie verpflichtet, sondern kann auf ISCs zurück, wenn das ISC Bevölkerung beschädigt ⁶ ersetzt werden.

ISC Nachbarn können entweder ISCs oder deren Tochterzellen. Die ISCs produzieren naiv Tochterzellen, die sich vermehren und differenzieren sich in den spezialisierten Zelltypen, die die epithelialen Blatt, Linien Darmlumen ¹ umfassen. Der Kelch, enteroendokrinen, Enterozyten, Büschel und M Zellen wandern nach oben, um die luminale Oberfläche, wo sie bieten verschiedene Absorptions- und Regulierungsfunktionen bleiben jedoch die Paneth Zellen am Boden der Krypta, wo sie existieren, mit der ISCs vermischt. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass ein Anteil des naiven daughtER-Zellen für einen sekretorischen Linie dazu bestimmt sind Ruheetiketthalte Lgr5 ^lo Zellen, die Rückkehr zu einer ISC auf Verletzungen ^6,7.

Aufgrund ihrer Bedeutung in Krypta Regeneration eine Priorität auf das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen der ISCs und seinen Nachbarn, insbesondere der Panethzellen platziert. Die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Nische, die die ISCs ^{8 unterstützt.} Neben bakterizide Produkte die Paneth Zellen Signalmoleküle, die Wege, die ISC Erneuerung oder Differenzierung regieren zu aktivieren. Frühere Studien zeigten, dass die Lgr5 ⁺ ISCs könnte nur dann verbindlich, wenn sie für wesentliche Nische Signale durch ihre Tochter Panethzellen ⁸ vorgesehen konkurrieren könnte. Diese Studien untersuchten die Rolle von Paneth-Zellen an normalen Lgr5 ⁺ ISCs und nicht in einer Situation, wo sie beschädigt sind und Nachschub von einer Lgr5 ^lo Bevölkerung.

Um zu verstehen, Darm Biologie und Modellerkrankung untersuchen wir die funktionelle Rolle der Zellen und / oder Gene mit transgenen Mausmodellen ^9,10. Häufig sind diese Modelle verwenden cre-lox-Technologie, um Gen (e) ^9,10 bedingt zu ändern. Cre (Ursachen Rekombination) Rekombinase ist eine ortsspezifische Rekombinase des Integrase-Familie, isoliert aus dem Bakteriophagen P1. Cre katalysiert ortsspezifische Rekombination zwischen definierten 34 bp ' Lox P '(Locus χ der Crossover-P1) Websites. Mäuse gentechnisch so verändert LoxP Websites, die interessierenden Bereiche, die bei der Expression der Cre-Rekombinase ausgeschnitten flankieren, enthalten. Verknüpfung der Expression der Cre-Gens in eine Zelle oder entwicklungsspezifischen Promotors ermöglicht die Änderung in einer räumlichen Mode ^9,10 hergestellt werden, ist dies besonders nützlich bei der Überwindung embryonale letale Mutationen. Weitere Verknüpfung des Cre-Expression zu einem Rezeptor-Weg,daß künstlich aktiviert werden, erlaubt zeitlichen Veränderungen.

Mit dieser Technologie haben wir inaktiviert die CatnB Gen ¹¹ in den Darmepithelien. β-Catenin, das CatnB Genprodukt ist ein wichtiger Regulator des Wnt-Signalwegs, der ISC-Homöostase regelt. Zwei frühere Studien mit dieser Strategie erzeugt widersprüchlichen Ergebnissen ^12,13. Die Studie von FEVR et ^al. 12 gezeigt Verlust von Stammzellen und Darm Homöostase. Während die Ireland et al. ¹⁴ Studie berichtet, dass im Anschluss an eine Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen die Krypta-villus Achse wurde aus Wildtyp-Zellen, die CatnB neu besiedelt. Der Hauptunterschied in diesen Studien war der Promotor verwendet werden, um Cre in Darmepithelien auszudrücken. Die FEVR et al., Verwendet Studie die Villin-Gen-Promotor an den Östrogenrezeptor verbunden, die durch die Verabreichung von t aktiviert werden kannamoxifen (vil-Cre-ER ^{T2) 15,16.} Im Gegensatz Ireland et al., Verwendet das Promotorelement des Ratten-Cytochrom P450A1 (CYP1A1) Gens Cre-Expression in Reaktion auf die xenobiotischen β-Naphthoflavon (Ah-cre) anzutreiben. Die Eigenschaften dieser verschiedenen Systemen erzeugten zwei Hypothesen für diese verschiedenen Beobachtungen erklären. Das erste, das CatnB effizienter im ISC mit der vil-Cre-ER ^T2 System im Vergleich zu den Ah-cre gelöscht wird, wodurch die Anzahl der ISCs, um Unter Repopulation Niveaus verringert wird. Alternativ war es aufgrund CatnB Deletion Differenz in der differenzierten Zellpopulation. Die vil-Cre-ER ^T2-System richtet sich an alle Epithelzellen der Krypta und Zotten während die Ah-cre-System zielt nur die nicht-Panethzellen des ISC-Nische und Krypta. Diese Systeme bereitgestellt ideale Werkzeuge für die Prüfung des Behavior der ISCs und ihrer Wechselwirkung mit den Paneth-Zellen. Hier stellen wir verschiedene ausführliche Protokolle auf, wie wir früher, diese Systeme zu bestimmen, dass Panethzellen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der intestinalen Reaktion auf eine Verletzung ¹⁷ zu spielen.

Protokoll

Informationen zu allen verwendeten Materials ist in Tabelle 1 angegeben. Alle Tierversuche wurden unter der Aufsicht eines britischen Innenministeriums Projektlizenz durchgeführt.

1. CatnB Deletion mit dem Ah-cre und vil-Cre-ER ^T2 Systeme

1. Überqueren Sie die Mausstämme bis 10 zu erzeugen - 14 Wochen alten Kohorten von Ah-cre ⁺ CatnB ^{+ / +,} Ah-cre ⁺ CatnB ^{flox / flox,} vil-Cre-ER ^T2 CatnB ^{+ / +} und vil-Cre-ER ^T2 CatnB ^{flox / flox.} Für die visuelle Analyse der Rekombination über eine β-gal-Färbung, sollte Kohorten die Rosa26R-lacZ-Reporter ¹⁷ enthalten. Kohorten sollte auf das Vorhandensein von veränderten Genen, und die Verwendung von Induktionsmittel zu steuern, sollte die Größe der Jahrgänge erforderlich unter Verwendung eines Leistungsanalyse abgeschätzt werden.
2. Um die Ah-cre Transgen induziert vorzubereiten β; -Naphthoflavone (BNF) oder für das vIL-Cre-ER ^T2 Transgen Tamoxifen (TAM) in Maisöl, um eine Arbeitslösung von 10 mg / ml zu ergeben. HINWEIS: Die Mittel sollten in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutz abgewogen werden.
3. Wärmelösungen in einer Braunglasflasche (BNF ist lichtempfindlich) entweder auf 99,9 ° C für BNF oder 80 ° C für TAM in einem Wasserbad.
4. Transfer in ein beheiztes Rührwerk bei 100 ° C für BNF gesetzt oder 80ºC TAM, und rühre 10 min.
5. Für BNF wiederholen 1,3-1,4, bis es gelöst (kann> 1 Stunde dauern).
6. Aliquots in kleine bernsteinfarbenen Flaschen (~ 5 ml) und dann bei -20 ° C. Die Flaschen sollten nach 3 Gefrier / Tau-Zyklen verworfen werden. Vor dem Tauwetter Mittel zu verwenden und erneut erhitzen, um geeignete Temperatur, wenn sie aus der Lösung gefallen. Lasse auf <37 ° C vor der Injektion zu kühlen.
7. Spritzen den Mäusen intraperitoneal (IP) mit einer Dosis von 80 mg / kg, zum Beispiel eine 25 g-Maus erhält 0,2 ml der geeignet friate Induktionsmittel. Für Ah-cre liefern drei Injektionen innerhalb von 24 Stunden-Zeitraum, für vil-Cre-ER ^T2 geben eine Injektion pro Tag für 4 Tage.

2. Präparation der Darm für Reporter Visualisierung und Immunhistochemie (IHC)

1. Euthanize die Maus mit Genickbruch ohne vorherige Betäubung im Einklang mit ethischen Zulassung. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage und nass das Fell mit 70% EtOH, öffnen Sie den intraperitonealen Hohlraum in Längsrichtung entlang der Mittellinie mit einer Schere.
2. Sichern Sie den Magen mit einer Pinzette und trennen Sie die Verbindung zum Speiseröhre. Entfernen Sie den Dünndarm bis zum Blinddarm durch leichtes Ziehen auf den Magen. Entfernen Sie den Dickdarm bis zum Anus durch leichtes Ziehen an der Anlage.
3. Sobald der Darm wurden isoliert entfernen Sie den Magen und Anhang. Flush Darm mit 1x PBS unter Verwendung einer Spritze mit einer stumpfen ended Pipettenspitze. HINWEIS: Jeder Darm sollte ichnmittelbar für eine der unten beschriebenen nachfolgenden Anwendungen verarbeitet.

3. Formalinfixierung der Darm

1. Schneiden Sie die gespülten Darm in 3 gleich große Abschnitte und Label proximalen, mittleren und distalen. Schneiden Sie jeden Abschnitt in 1 cm Stücke schneiden. Nehmen Sie einen kleinen Streifen des chirurgischen Band 2 cm x 2 cm. Stellen drei bis fünf 1 cm Stücke an der Mitte der chirurgischen Band in Pyramidenform.
2. Schließen und verschließen Sie das Band um die Stücke in Längsrichtung, um einen "Protokollstapel" Effekt. Platzieren Gewebe in einem Flachbodenbehälter das Volumen der Fixierlösung zu dem Volumen des Gewebes, die einen großen Überschuss an neutral gepuffertem Formalin Fixiermittel mindestens 10x. HINWEIS: Vermeiden Sie es, überschüssige Mengen von Gewebe innerhalb eines Rohres zur Fixierung, teilen sie in mehrere Container.
3. Platz Proben bei 4 ° C für mindestens 18 bis 24 Stunden vor dem Einbetten und Schneiden. Um den Verlust von Kern β-Catenin zu vermeiden, darf nicht über 24 Stunden zu beheben.Nach der Fixierung Übertragungsgewebe zu einem Flachbodenbehälter mit einer großen Überschuß von 70% EtOH, mindestens 10-fache Volumen des Gewebes.

4. Methacarn Fixierung Darm

1. Vor der Sektion vorbereitet Methacarn Fixiermittel durch Kombinieren von 300 ml MeOH, 150 ml Chloroform und 75 ml Eisessig (4: 2: 1). Schneiden Sie die gespülten Darm in 3 gleich große Abschnitte proximalen, mittleren und distalen.
2. Legen Sie jedes Stück des Darms nebeneinander auf einem Stück Filterpapier (15 cm x 15 cm) und mit einem Springbow Schere öffnen Sie es "en face". Setzen Sie den Darm und Filterpapier in eine Glasschale mit Methacarn für 3-24 h bei RT. Nach der Fixierung abholen das Ende einer Darmabschnitt mit einer Pinzette.
3. Wickeln Sie das Darms um die Zange, um ein "Swiss Roll" zu bilden, und sichern Sie die Rolle durch leichtes Öffnen der Zange und setzen eine 25 G-Nadel durch sie. Zeigen Gewebe in einem Flachbodenbehälter mit einer laRGE Schuß neutral gepuffertem Formalin Fixiermittels, mindestens 10-fache Volumen der Fixierlösung zu dem Volumen des Gewebes und Speicher für mindestens 1 Stunde, bevor die Verarbeitung.

5. Ganze Berge LacZ Visualisierung (Geändert von El Marjou et al. ¹⁸⁾

1. Wachsplatten herzustellen, indem geschmolzenes ralwax mit Mineralöl bei 10: 1. Gießen Sie in 15 cm Petrischalen und abkühlen lassen. Bereiten Sie X-gal Fixiermittel gemäß Tabelle 1 und speichern Sie auf dem Eis.
2. Entfernen ganzen Darm und durch Spülen mit eiskaltem 1x PBS, gemäß Abschnitt 2. Fix Darm durch Spülen mit 25 ml eiskaltem X-gal Fixiermittel.
3. Mit einer Schere schneiden Sie den Darm in 3-5 gleiche Abschnitte (maximal 5 pro Platte). Setzen Sie jeden Abschnitt auf Wachsplatte und festzunageln jedes Ende so der Abschnitt leicht mit der mesenterialen Linie obersten gestreckt; Trim überschüssige Mesenterium. Mit ein Springbow Schere den Darm in Längsrichtung und Anschlussbelegung auf dem Weg.60;
4. Fluten die Platte mit X-gal Fixativ, um die Abschnitte behandeln und lassen Sie für mindestens 1 Stunde bei 4 ° C. Entfernen X-gal Fixiermittel unter Verwendung einer 25 ml Pipette und einmal mit 30 ml 1X PBS zu waschen. Deckprofile mit 30 ml DTT demucifying Lösung für 30 - 60 min bei RT, idealerweise auf einem Wippschüttler.
5. Entfernen demucifiying Lösung unter Verwendung einer 25 ml Pipette und überfluten die Platte mit 30 ml 1x PBS. Mit einer Pasteurpipette waschen die Darmabschnitten mit 1x PBS in der Platte, um Schleim zu entfernen.
6. Entfernen 1x PBS mit einer 25 ml Pipette und Flut mit 30 ml X-Gal-Färbung. Inkubieren über Nacht bei RT im Dunkeln unter leichtem Schütteln auf einem Wippschüttler.
7. Nach der Inkubation über Nacht Check, dass die Abschnitte haben eine blau / grün-Färbung entwickelt, wenn die Hintergrundfarbe ist immer noch weiß, frische Farblösung hinzugefügt und überwacht bis Färbung entwickelt werden. HINWEIS: Sobald Abschnitte dann gefärbt keine weitere Färbung kann versucht werden.
8. Entfernen Sie die X-gal-FärbungVerwendung einer 25 ml Pipette und Flutplatte mit 30 ml 1x PBS und lassen für 3 min unter leichtem Schütteln. Stifte entfernen und abholen, mit einer Pinzette, das Ende einer Darmabschnitt. Wickeln Sie das Darms um die Zange, um ein "Swiss roll" bilden, sichern Sie die Rolle durch leichtes Öffnen der Zange und setzen eine 25 G-Nadel durch sie.
9. Platzieren Gewebe in einem weiten Mund Flachbodenbehälter mit einer großen Überschuß neutral gepuffertem Formalin Fixiermittels, mindestens 10-fache Volumen der Fixierlösung zu dem Volumen des Gewebes. Platz Proben bei 4 ° C für mindestens 24 Stunden vor dem Einbetten und Schneiden.

6. Extraktion von Krypten aus Darm

1. Isolieren Sie die ersten 20 cm des Dünndarms, gemäß Abschnitt 2. Legen Sie den Darm auf eine saubere Sezieren Oberfläche und mit einer Pinzette und Schere entfernen Sie alle angeschlossenen Fett / Mesenterium. Verwendung eines Springbow Schere öffnen Sie die gut in Längsrichtung.
2. Mit einem Mikroskop Deckglas, firmly kratzen die Darmlumen zu Zotten und Schleim zu entfernen. Mit einer Schere schneiden Sie den Darm in ~ 5 mm Stücke und Überführung in ein 50 ml Röhrchen mit 25 ml 1x HBSS ergänzt mit Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 U / ml).
3. Inkubation für 10 min bei RT. Entfernen Sie das Antibiotikum enthaltenden Medien, indem die Proben durch einen 70 & mgr; m Zellsieb.
4. Zeigen Darmabschnitte in ein frisches 50 ml Röhrchen mit 10 ml 1x HBSS und ersetzen Sie die Kappe.
5. Vorsichtig umdrehen zweimal und entfernen Sie die 1x HBSS indem sie durch ein 70 & mgr; m Zellsieb. Weitere waschen die Darmstücke durch Wiederholung 6.4 & 6.5 dreimal und sicherzustellen, dass die letzte Fraktion ist relativ klar.
6. Bringen Gewebe in ein frisches 50 ml Röhrchen mit 10 ml EDTA (8 mm) / 1x HBSS und lassen bei Raumtemperatur für 5 min. Durch kräftiges Schütteln (20 - 30x) oder Wirbel, durch ein 70 & mgr; m Zellsieb und Transfergewebestücke übergeben, um ein frisches 50 ml Röhrchen mit EDTA (8 mm) / 1x HBSS. HINWEIS:Die Strömung durch kann entweder verworfen oder beibehalten werden, sofern Analyse der Zotten Epithelien erforderlich ist.
7. Die Gewebestücke auf Eis für 30 min inkubieren, schütteln Sie die Probe kräftig (20 - 30x) oder Wirbel. Übergeben Sie die Proben durch eine 70 um Zellsieb und bewahren die Durchströmung, da dies enthält die Krypten.
8. Übertragen Sie die Gewebestücke in ein frisches 50 ml Röhrchen mit 10 ml 1x HBSS. Durch kräftiges Schütteln (20 - 30x) oder Wirbel, durchlaufen ein 70 & mgr; m Zellsieb und die Durchströmung zu behalten. Wiederholen Sie noch einmal, um eine maximale Rückgewinnung von Krypten von Darmstücke zu gewährleisten. Kombinieren Sie die Durchflussfraktionen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Gießen Sie den Überstand und behalten die Krypta Pellet. HINWEIS: Die Pellets können direkt für die Kultivierung verwendet werden (falls vorhanden) oder bei -80 ° C vor der Standard-DNA / RNA / Protein-Extraktionsverfahren gespeichert.

7. Standard immunhistochemische Visualisierung

1. Schneiden 5 μm Abschnitte in Paraffin eingebetteten Gewebe auf mit Poly-L-Lysin (PLL) gleitet. Hinweis: Ein Standard-Protokoll für die Färbung mit einem B-Catenin-Antikörpers wird nachstehend angegeben, werden die Parameter für andere Antikörper in Tabelle 2 angegeben.
2. De-Wachs mit 2x 3 min Waschen in Rutsche Bäder mit frischem Xylol. Rehydrieren, indem Folien für 3 Minuten durch Schiebe Bäder frischen enthält: 100% EtOH (2x), 95% EtOH und 70% EtOH und schließlich in 1x PBS.
3. Die Objektträger in eine Folie enthaltendes Bad Citratpuffer (pH 6) und Wärme 99,9 ° C für 20 min, um Antigene zu erhalten. Lassen Sie Folien zu kühlen und dann waschen 3x 5 min in einer Dia-Bad, das 1xTBS / T für 5 min. Objektträger aus der letzten Wäsche sofort um Gewebe zu ziehen mit einem PAP Pen und Deckelabschnitt mit einem kommerziellen Peroxidase Block oder 1,5% _H 2 O 2 (in destilliertem _H 2 O).
4. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) dann waschen 3x in Rutsche Bäder mit frischem 1x TBS / T für 5 min. Nach dem Waschening Deckelabschnitte, mit einer Pipette, in 5% normalem Kaninchenserum (NRS) / 1xTBS / T für 30 min bei RT unspezifische hydrophobe Bindungs ​​Ihrer primären Antikörpers zu blockieren.
   1. Entfernen NRS Block mit einer Pasteurpipette und Deckelabschnitt in B-Catenin primäre Antikörper verdünnt 1: 200 mit 5% NRS. Wash gleitet für 3x 5 Minuten in der Folien Bäder mit frischen 1xTBS / T. Hinweis - andere Antikörper-Optimierung zur Verdünnung und Spezifität erfordern. Um die Spezifität eines Antikörpers zu gewährleisten, sollten geeignete keine Antikörper und Isotypkontrolle Flecken durchgeführt werden. Ein Isotyp-Kontrolle wird auf der Wirtsspezies und Isotyp des primären Antikörpers abgestimmt.
5. Visualisieren entweder mit einem kommerziellen HRP-Nachweis-Kit oder mit einem geeigneten Fluoreszenz-markierten sekundären Antikörper (Tabelle 2). Anmerkung: Die Länge des Entwicklungs unterscheidet sich für jeden Antikörper, der für β-Catenin 10-15 sec in der Regel ausreichend. Die Entwicklung für einen Antikörper ersten est optimierenablish die Länge der Zeit, die zum positiven Zellen unter Verwendung eines positiven Steuerschieber zu visualisieren und dann gilt dies auch für alle nachfolgenden Dias.
6. Wash gleitet für 3x 5 Minuten in der Folien Bäder mit frischen TBS / T. Gegenfärbung Objektträger durch in einer Diashow Bad mit Hämatoxylin für ~ 45 Sekunden Eintauchen (nicht erforderlich, wenn mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper). Legen Sie Folien in einen sauberen Objektträger Bad und spülen Sie mit fließendem Leitungswasser für ~ 1 min, die Gewährleistung der Hämatoxylin nicht vollständig ausgewaschen.
7. Dehydrieren gleitet, indem sie durch Schiebe Bäder mit steigenden Konzentrationen von Alkoholen; 1x 30 Sekunden in 70% EtOH, 1x 30 Sekunden in 95% EtOH, 2 x 30 s Waschen in 100% EtOH, 2 x 2 min in Xylol.
8. Berg rutscht unter einem Deckglas mit einem handelsüblichen Montage Medien. HINWEIS: Bei Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörper Halterung mit einem Medium, das DAPI, den Kern zu beschriften.

8. Die histologische Identifizierung spezifischer intestinal Epithelzellen

1. Enterozyten
   1. Bereiten Abschnitte mit Abschnitt 7 mit der Villin Antikörper und Bedingungen in Tabelle 2 beschrieben.
2. Entero-endokrine Zellen (Grimelius färben ^18,19).
   1. Bereiten Abschnitte durch folgende Schritte 7,1-7,2. Wash Bildern in einer Diashow Bad mit hochreinem Wasser für 3 min. Die Objektträger in einen Objektträger Bad, das vorgewärmt Silberlösung (Tabelle 1) und Inkubation bei 60 ° C für 3 Stunden.
   2. Entfernen Sie die Folien aus der Silberlösung und in eine Rutsche Bad, das frisch zubereitet vorgeheizten Reduktionslösung (Tabelle 2) bei 45 ° C für 3 min. Entfernen Sie die Folien und in einen Objektträger Bad mit frischem hochreinem Wasser für 3 min. Führen Sie die Schritte 7,6-7,8 aus dem Abschnitt 7.
3. Becherzellen (alcianblau).
   1. Bereiten Abschnitte durch folgende Schritte 7,1-7,2 .. Objektträger zu einer Folie Bad mit Alcian Blue pH 2,5 für 5 Minuten bei RT. Entfernen alcianblau mit einer Pipette und Ort Schiebe Bad unter fließendem Wasser für 3-5 min. Führen Sie die Schritte 7,6-7,8. HINWEIS: Alcianblau-Lösung kann zur weiteren Verwendung beibehalten werden.
4. ISCs.
   1. Um festzustellen, die ISCs folgen Abschnitt 9.
5. Paneth-Zellen.
   1. Bereiten Abschnitten folgende Abschnitt 7 mit der Lysozym-Antikörpers und die Bedingungen in Tabelle 2 beschrieben.

9. In-situ-RNA-Detektion mit dem murinen Darm ^19-21

1. Zeigen 5 um Abschnitte von Formalin fixiert Darm (Abschnitt 3) auf PLL Rutschen. Bereiten Sie eine linearisiert Digoxigenin markierten RNA-Sonde zum Nachweis Olfm4 Ausdruck ^21. Entwachsen und rehydrieren Abschnitten gemäß Abschnitt 7. Hinweis: Dieses Protokoll sollte in einem RNAse freien Umgebung durchgeführt, um den Abbau des RNA-Sonde zu verhindern.
2. Zeichnen Sie in der Umgebung von tProblem mit einem PAP Pen Reagenzien zu minimieren. Inkubieren Abschnitte in einer Dia-Bad mit 6% H _{2 O 2 (in} destilliertem H _{2 O)} für 30 min. Zweimal waschen in einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS für 3 min. Entsorgen Sie 1x PBS und mit einer Pipette, Deckabschnitt mit 4% Paraformaldehyd für 20 min auf Eis.
3. Zweimal waschen in einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS für 3 min. Mit einer Pipette Deckelabschnitte mit Proteinase K-Lösung für 5 min Waschen in einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS für 3 min. Mit einer Pipette Postfix-Abschnitte durch Abdecken in 4% Paraformaldehyd für 5 min bei RT.
4. In einer Dia-Bad mit DEPC waschen behandelten _H 2 0 2 min. Mit einer Pipette Deckelabschnitte in Essigsäureanhydrid-Lösung für 10 Minuten unter Rühren. In einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS / 3 min, gefolgt von Kochsalzlösung 1x / 3 min waschen. Übergeben Sie gleitet durch Bäder mit steigenden Konzentrationen von Alkoholen; 1x 30 s in 70% EtOH, 1x 30 s in 95% EtOH, 2x 30 s Waschen in frischem 100% EtOH,2x 2 min in frischem Xylol und an der Luft trocknen.
5. Verdünnter Olfm4 Sonde 1: 100 in Hybridisierungspuffer und denaturieren Sonde durch Erhitzen auf 80 ° C für 3 min. Apply 100 ul Sonde an jedem Abschnitt und decken mit Parafilm zu Austrocknung des Schlittens zu verhindern. Inkubieren über Nacht in einem dunklen, feuchten Kammer bei 65 ° C.
6. Waschen Sie in einer Diashow Bad mit 5 x SSC bei 65 ° C für 15 min. Waschen in einer Reiß Bad zweimal mit frischem 50% Formamid / 5 x SSC / 1% SDS für 30 min bei 65 ° C. Zweimaliges Waschen in einer Reiß Bad in frisches PBT für 10 min, das erste bei 65 ° C und die zweite bei RT. Mit einer Pipette Deckelabschnitte mit PBT, enthaltend 25 & mgr; g RNAse für 45 min bei 37 ° C. Waschen in einer Reiß Bad in PBT für 5 min bei RT.
7. Waschen in einer Reiß Bad zweimal mit frischem 50% Formamid / 5 x SSC für 30 min bei 65 ° C. Zu blockieren, Deckelabschnitte mit einer Pipette mit 10% Schafserum in PBT und an einem dunklen, moist Kammer bei RT für 2 - 3 Stunden.
8. Vorbereitung Antikörper durch Verdünnung anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-konjugierter Antikörper bei 1: 500 mit 10% Schafsserum in PBT, enthaltend 5 mg / ml Maus-Darm-Pulver. Inkubation für 3 Stunden bei 4 ° C im Dunkeln auf einer Schwingplattform. Spin down, um überschüssige Darmpulver entfernen und 3x Volumina von 1% Schafserum in PBT zu dem Überstand.
9. Entfernen Block von Folien mit einer Pipette und fügen Sie 100 ul der Antikörperlösung zu jedem Abschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation in einem dunklen, feuchten Kammer bei 4 ° C über Nacht. Waschen in einer Reiß Bades 3 × mit frischem PBT für 5 min. So blockieren Abschnitten waschen in einer Dia-Bad 3 x mit frischen NTMT Puffer für 5 min.
10. Um sichtbar zu machen, mit einer Pipette auf jedes Teil mit BM purple und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 bis 72 Stunden, bis eine ausreichend starke Farbe entwickelt. Waschen in einer Reiß Bad einmal in PBT und in Eosin für 1 min Eintauchen gegenfärben. Remove überschüssige Eosin durch Waschen in einer Reiß Bad unter einen Wasser für 3-5 min. Tauchen Sie Folien in Xylol und an der Luft trocknen. Montieren Sie unter einem Deckglas mit kommerziellen Medien.

10. Die histologische Charakterisierung Darmepithelien

1. Zeigen 5 um Abschnitte aus dem festen Gewebe (Abschnitt 3 und 4) auf PLL Rutschen. Analysieren ≥25 zufälligen ganzen (oder halben ≥50) Krypten von ≥4 Mäusen jeder Kohorte für jeden der folgenden Parameter. HINWEIS: Um die Konsistenz zu analysieren Krypten aus dem gleichen Ort jedes Darm (nur das proximale Ende).
2. Zellparameter von Standard H & E gefärbte Schnitte (wenn nicht anders angegeben): Crypt Zahl, Höhe, Apoptose und Mitose.
   1. Crypt-Nummer.
      1. Verwenden Sie eine niedrige Energievergrößerung (zB 4X oder 10X), die Anzahl der Krypten in Kontakt mit der basalen Schicht von Hand zählen. Graf ≥10 quer proximalen Darm-SekteIonen von mindestens 4 Mäusen.
   2. Crypt Höhe.
      1. Verwenden Sie eine hohe Leistung Vergrößerung (zB 20X oder 40X), die Anzahl der Zellen vom Boden der Krypta in die Krypta / villus Achse (Abbildung 3b) manuell zu zählen.
   3. Apoptose ^{22, 23.}
      1. Methode 1: Verwenden Sie eine hohe Leistung Vergrößerung (zB 20X oder 40X.), Die Zahl der apoptotischen Zellen in jeder Krypta von Hand zählen. Apoptotische Zellen durch Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, die Bildung von Bläschen und zytoplasmatischen apoptotischen Körpern (3a) identifiziert werden.
      2. Methode 2: Führen Sie eine IHC-Färbung (Abschnitt 7) für die Caspase-3 unter Verwendung von in Tabelle 2 beschriebenen Bedingungen unter Verwendung eines Hochleistungsvergrößerung (zB 20X oder 40X.) Die Anzahl der positiven Zellen manuell zählen in jedem Krypta, um die Zellen in der zu quantifizieren. Ausführungsphase der Apoptose.
   4. Mitose.
      1. Verwenden Sie eine hohe Leistung Vergrößerung (zB 20X oder 40X), die Zahlen von mitotischen Zellen in jeder Krypta von Hand zählen. Mitotischen Zellen enthalten kondensierte DNA-Material und sind typischerweise symmetrisch und gut geformt (Figur 3b).
   5. Proliferation.
      1. Führen Sie eine IHC (Abschnitt 7) Fleck für Ki-67 unter Verwendung von in Tabelle 2 beschriebenen Bedingungen. Manuelles zählen positiven Zellen, den Anteil der Krypta-Zellen vermehren zu quantifizieren.

Ergebnisse

Vergleicht ISC Rekombinationseffizienz im Ah-cre und Vil-Cre-ER ^T2 Systeme

Verwendung dieser cre-lox-Systeme zur Bewertung der Rolle von Paneth-Zellen, in Repopulation des Darms nach einer Beschädigung, erforderliche Charakterisierung der Effizienz der Rekombination innerhalb der ISCs. Verwendung des Rosa26R-lacZ bedingten Reporter wir gezeigt, daß in beiden Systemen 3 Tagen nach der Induktion (dpi) ist ~ 100% Rekombination in den Dünndarm (Abbildung 1a). Quantifizieren der Anwesenheit von rekombinierten Allel durch qPCR wurde durch die Unterschiede der Cre-Expressionsmuster zwischen den Systemen verwechselt. Die vIL-Cre-ER ^T2 System zeigte eine 3,53 fachen Anstieg in der Gegenwart des rekombinierten Allel im Vergleich zum Ah-cre Systems sind wegen seiner Expression in einem größeren Anteil des epitheli^ein 16. Um dies zu überwinden wir nahm eine andere Strategie, die es uns ermöglicht, direkt zu vergleichen, die Systeme. Wir induzierte die Mäuse mit unterschiedlichen Induktionsregime und analysiert bei 30 dpi, an welcher Stelle LacZ positive Krypten und Zotten stellen eine ISC Rekombinationsereignis. Mit diesem Ansatz haben wir gezeigt, dass in beiden Systemen, 3 Injektionen von Induktionsmittel (geliefert IP bei 80 mg / kg in 24 h), trotz anfänglicher Rekombination Ebenen in der vil-Cre-ER ^T2 weit größer in eine äquivalente Anzahl von ISCs rekombiniert ^System 16 (Figur 1b-d). Ferner wurde unter Verwendung von rekombinierten DNA extrahiert Krypten, qPCR für rekombinierten Allele zeigten eine nicht-signifikante Erhöhung der Rekombination mit dem vil-Cre- ER ^T2 System potentiell aufgrund der Rekombination in den Panethzellen Verwendung des Ah-cre System nicht beobachtet (Abbildung 1d). Ferner Färbung für Epithelien Zelltypen nicht indiCate jede Veränderung Differenzierungsmuster wird repräsentative Bilder von jedem Zelltyp untersucht in 2e-2h gezeigt.

Charakterisierung von Darmepithelien folgenden CatnB Löschen

Die Quantifizierung der Crypt-Verlust

Charakterisierung der Kinetik der Rekombination in diesen Cre-Systeme konnten wir die Mausdarm zu analysieren, wenn äquivalente Anzahl von ISCs rekombiniert werden. Verwendung des lacZ-Reporter beide Systeme zeigte den vollständigen Verlust der rekombiniert (blau) Zellen bei 3 dpi (Abbildung 2a). Wie bereits drei Tage nach Löschung der CatnB berichteten die Ah-cre Mäuse zeigten Teil Krypta Verlust, während die vil-Cre-ER ^T2 Mäusen gezeigt vollständige Zerstörung der Krypta / villus Achse ^13,16,24 (Abbildung 2b-d).

Dynamik der Epithelial Wiederbelegung

Unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken befinden wir mehrere Parameter, damit wir diese Beobachtung zu verstehen. Repräsentative Bilder der Parameter und Zelltypen analysiert unter Verwendung von Protokollen 7-10 sind in (3a & 3b). Kurz gesagt, wurde der Verlust der Krypten, die mit den erhöhten Werten von Apoptose in beiden Systemen (Abbildung 3e) angezeigt. Allerdings ist die Mitose, Proliferation, Krypta Zellhöhe, Krypta und Ausdruck (nicht dargestellt) Daten zeigten die Ah-cre-System könnte zu erholen, was vermutlich auf Wiederbesiedlung durch un-rekombiniert ISCs (Abbildung 3c). Im krassen Vergleich die vil-Cre-ER ^T2 versäumt, trotz Beibehaltung epithelialen Krypta-Zellen (Abbildung 3d) zu erholen.

Charakterisierung zellulärer Phänotypen innerhalb Crypt

Um zu verstehen, warum die Krypten von Ah-cre Mäusen konnte wieder zu bevölkern, während die vil-Cre-ER ^T2 konnten wir dadurch die Epithelzellen drei Tage nach Löschung der CatnB. Verwendung in situ Hybridisierung (Abschnitt 9) und IHC-Analyse (Abschnitt 7, 8 und 10) haben wir gezeigt, dass die Krypta-Zellen in den vil-Cre-ER ^T2 CatnB ^{flox / flox} Mäuse waren nicht-proliferative und es fehlte die Expression des ISC Marker Olfm4 , im Gegensatz zu den Krypten in den Ah-cre-Mäuse (4c & f). Als anfängliche Charakterisierung hatten gezeigt, daß die Rekombination in Krypten entsprach wir fort, die Rolle der Panethzellen untersuchen. Wir führten eine duale Fluoreszenz-IHC gegen CatnB und Lyz1 zu identifizieren, welche Zellen β-Catenin verloren hatte und ob sie Paneth Zellen (5a bis 5c). Wie zuvor beschrieben wir demonstrated dass alle Krypta-Zellen werden mit Hilfe der vil-Cre-ER ^T2-System ausgerichtet. Im Vergleich verschont die Ah-cre System die Paneth-Zellen und die Zotten Epithelien. Weitere Paneth-Zellen wurden nur beobachtet, die einer Apoptose nach CatnB Löschen mit der vil-Cre-ER ^T2-System (Abbildung 5d & 5e).

Abbildung 1: Vergleich der Spezifität und Effizienz des Cre / lox-Rekombination im Darmepithelien mit dem Ah-cre und Vil-Cre-ER ^T2 Systems (a):. Visualisierung von Ah-cre LacZ Reporterexpression in wholemount kleinen (SI; * distalen Ende) und große (LI; * distalen Ende) von einer Wildtyp-Maus. (b): Die Ergebnisse der qPCR zeigt fache Veränderung für die rekombiniert CatnB ^flox Allel in 1 dpi zu unterschiedlichen Induktionsregime in Ah-cre CatnB ^{flox / flox} (BNF induziert) zu vergleichen und vil-Cre-ER ^T2 CatnB ^{flox / flox} (TAM induzierte ); * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] im Vergleich zur Kontrolle). (c) - (e):.. Wholemount Dünndarms, die LacZ positive Krypta 30 dpi Panel (b) - (e) von Parry et al ¹⁶ modifiziert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Vergleich der Ah-cre und Vil-Cre-ER ^T2 CatnB im Dünndarm Epithelien (a):. Wholemount Dünndarm zeigt Verlust der rekombinierten Zellen in Ah-cre CatnB ^{flox / flox} LacZ ⁺ Mäusen über 3 Tage. (b): Die Quantifizierung der Krypta Verlust von 3 Tagen nach Löschung der CatnB; * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] im Vergleich zur Kontrolle). (C und D): Quer H & E Abschnitten Formalin fixiert Darm demonstrieren Verlust der Krypten nach CatnB Löschen. (e) - (h) Beispiel von Zelltypen von Kontrollmäusen: (e) entero-endocriine Zellen, (f) den Becherzellen, (g) CatnB IHC Anzeigen eines ISC (→) mit Kern B-Catenin und (h) Paneth Zellen. Panel (b) von Parry et al. ¹⁶ modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Charakterisierung der Beginn der Phänotyp bei der Verwendung des Ah-cre und Vil-Cre-ER ^T2 Systeme für Bedingt Löschen CatnB in Ähnliche Zahlen von ISCs innerhalb der Dünndarm-Epithel (a & b) H & E gefärbten Formalin fixiert Abschnitte der Lage der Krypta. Höhe ([), eine apoptotische (←) und mitotischen Zelle (↓). Die Quantifizierung der durchschnittlichen Anzahl der Zellen pro crypt zwischen Wildtyp (blau) und CatnB ^flox (orange) Mäusen zu drei Zeitpunkten (dpi) (c) crypt Höhe, (d) die Mitose und (e) die Apoptose (Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung ). Tafel (c) - (e) von Parry et al ¹⁶ modifiziert.3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abb. 4: Vergleich der ISC Merkmale mit Ah-cre und Vil-Cre-ER ^T2 Systeme für Bedingt Löschen CatnB im Dünndarm Epithel Epitheliale Kryptenzellen 3 Tage nach dem Löschen von CatnB mit dem Ah-cre (ac) oder Villa Cre-ER ^{T2 (df)} System. (A & D), H & E Schnitt, der Bereiche der Krypta Verlust; (B & D), Ki-67 IHC demonstrieren Verlust der proliferativen Zellen unter Verwendung von vil-Cre-ER ^T2; (C & F) Olfm4 in situ Nachweis Anwesenheit von funktionellen ISCs mit Ah-cre. Panel (a.) - (f) von Parry et al ¹⁶ modifiziert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Charakterisierung der Paneth Zellen nach CatnB Deletion mit den Vil-Cre-ER ^{T2 und} Ah-cre-Systeme (AC):. Immunfluoreszenzbilder von Krypten, die Paneth Zellen (rot), B-Catenin (grün) und Kern (blau ), Pfeil entsprechend membrangebundenen β-Catenin; (de) IHC für die Caspase-3 anzeigt apoptotischen Paneth-Zellen fehlen in der Ah-cre (d), aber in der vorliegenden vil-Cre-ER ^T2-System (e). Tafel (a) - (e) aus modifiziertemParry et al ^16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Acetat-Puffer	*	*	Auf 100 ml 4,8 ml 0,2 M Essigsäure, 45,2 ml 0,2 M Natriumacetat und 50 ml destilliertem Wasser
Essigsäure	Fisher Scientific	C / 0400 / PB17
Essigsäureanhydrid	Sigma	A6404
Essigsäureanhydridlösung	*	*	2 M Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin-Hydrochlorid
Alcianblau	Sigma	A5268
Alcianblau pH 2,5	*	*
Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-konjugierter Antikörper	Abcam	ab119345
B (beta) -Naphthoflavone	Sigma	N3633	BNF, zu injizieren, ohne dass die Lösung zu sehr abkühlen als Verbindung aus der Lösung fallen zu lassen. Lösung kann wiederverwendet werden - bei -20 ° C zwischen den Anwendungen, nicht aufwärmen mehr als das Doppelte.
Bloxall	Vector Labs	SP-6000
BM purple	Roche	11442074001
BSA	Sigma	A4503	Rinderserumalbumin
Chloroform	Fisher Scientific	C / 4920/17
Citrat-Puffer / Antigen Demaskierung Lösung	Vector Labs	H-3300
Maisöl	Sigma	C8627
Demucifiying Lösung	*	*	Für 500 ml: 50 ml Glycerin, 50 ml Tris pH 8,8 0,1 M, 100 ml EtOH, 300 ml Salzlösung (0,9% NaCl in Wasser), 1,7 g DTT. Demucifying Lösung kann im Voraus gebucht werden und gespeichert, aber DTT sholud kurz vor Inkubation (340 mg / 100 ml) hinzugefügt werden.
DEPC behandeltem Wasser	Life Technologies	750.023
DTT	Sigma	101509944
EDTA	Sigma	O3690	0,5 M
Ethanol	Fisher Scientific	E / 0650DF / 17
Filterpapier	Welcher Mann	3000917
Formaldehyd	Sigma	F8775
Formalin	Sigma	SLBL11382V	Neutral gepuffertem Formalin
Formamid	Sigma	F5786
Glutaraldehyd	Sigma	G6257
H 2 O 2	Sigma	216.763
HE	Raymond A Lamb	12698616
HBSS	Gibco	14175-053	HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2)
Hybridisierungspuffer	*	*	5 × SSC, 50% Formamid, 5% SDS, 1 mg / ml Heparin, 1 mg / ml Kalbsleber-tRNA
Hydrochinon	Sigma	H9003
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Labs	SK-4105
Vector Labs	MP-7402
Immpress HRP-Anti-Kaninchen-IgG-Kit	Vector Labs	MP-7401
Darmgewebe Pulver	*	*	Dünndarm von 5 erwachsenen Mäusen wurden vereinigt und homogenisiert in einem minimalen Volumen eiskaltem PBS. 4 Volumina eiskaltem Aceton wurden zu der homogenisierten Darm, die gründlich gemischt und auf Eis für 30 min inkubiert wurde. Dieses wurde zentrifugiert, und das Pellet wurde mit eiskaltem Aceton gewaschen. Dies wurde weiter zentrifugiert und das resultierende Pellet auf Filterpapier ausgebreitet und trocknen gelassen. Sobald gründlich trocknen das Material wurde zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel gemahlen.
K-Ferricyanid	Sigma	P-3667
K-Ferrocyanid	Sigma	P3289
Levamisol	Sigma	L0380000
Methacarn	*	*	60% Methanol: 30% Chloroform: 10% iger Essigsäure
Methanol	Fisher Scientific	M / 4000/17
MgCl2	Sigma	M8266
Normales Ziegenserum	Vector Labs	S-1012	NGS
Normales Kaninchenserum	Dako	X0902	NRS
NTMT	*	*	100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl 2, 0,1% Tween 20, 2 mM Levamisol
PAP Pen	Vektor	H-400
Para	Sigma	P6148
PBT	*	*	0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140-122	100x solutiuon.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)	Fisher Scientific	BP3994	Verdünnte 1:10 mit destilliertem Wasser auf 1x machen
PLL Dias	Sigma	P0425-72EA	Poly-L-Lysin-Objektträger
Proteinase K	Sigma	P2308
Proteinase K-Lösung	*	*	Verdünnter Proteinase K bei 200 ug / ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax	BDH	36154 7N
Reducer Lösung	*	*	1 g Hydrochinon, 5 g Natriumsulfit und 100 ml destilliertem Wasser: auf 100 ml
RNaseA	Sigma	R6148
Salzig	*	*	0,9% NaCl in destilliertem Wasser
SDS	Sigma	I3771
Schafserum	Sigma	S3772
Silber Nitrat	Sigma	S / 1240/46
Silberlösung	*	*	10 ml Acetatpuffer, 87 ml destilliertem Wasser, 3 ml 1% Silbernitrat: auf 100 ml
Natriumacetat	Fisher Scientific	S / 2120/53
Natriumchlorid	Sigma	S6753	NaCl
Natriumsulfit	Sigma	239.321
SSC	Sigma	93.017	20x Kochsalzlösung Natriumcitrat
Chirurgischen Band	Fisher Scientific	12960495
Tamoxifen	Sigma	T5648	TAM, zu injizieren, ohne dass die Lösung zu sehr abkühlen als Verbindung aus der Lösung fallen zu lassen. Lösung kann wiederverwendet werden - bei -20 ° C zwischen den Anwendungen, nicht aufwärmen mehr als das Doppelte.
TBS / T	Zelluläre Signaltransduktion	# 9997
Triethanolaminhydrochlorid	Sigma	T1502
Tris-HCl	Invitrogen	15567-027
Tween20	Sigma	TP9416
VectaMount	Vector Labs	H-5000
Vectashield Hardset Eindeckmedium mit DAPI	Vector Labs	H-1500
Vectastain ABC Kit	Vectoder Labs	PK-4001
X-gal	Promega	V3941
X-gal Fixiermittel	*	*	2% Formaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd in 1xPBS
X-Gal-Färbung	*	*	X-Gal-Färbung; 200 & mgr; l X-gal (A) in 50 ml Lösung B (0,214 g MgCl 2, 0,48 g K-Ferricyanid, 0,734 g K-Ferrocyanid in 500 ml PBS). Lösung B kann bis oin Voraus bei 4 ° C vorgenommen und gespeichert werden
Xylol	Fisher Scientific	X / 0200/21

Auf 500 ml zu machen: 15 ml Essigsäure, 5 g Alcianblau und 485 ml destilliertem Wasser, Immpress HRP Anti-Maus-IgG-Kit

Tabelle 1: Materialien und Methoden

d> 1/200, 30 min bei RT

Ziel	beta-Catenin	Lysozym	Ki67	Caspase-3	Villin
Kommerzielle Quelle für Primär Ab	Transduction Labs	NeoMarkers	Vector Labs	R & D Systems	Santa Cruz
Art.Nr.	610.154	RB-372	VP-K452	AF835	SC-7672
Primäre Ab hob in	Mouse (mAb)	Kaninchen (PAB)	Mouse (mAb)	Kaninchen (PAB)	Goat (PAB)
Antigen-Retrieval	Siedenden Wasserbad / Citratpuffer	Siedenden Wasserbad / Citratpuffer	Siedenden Wasserbad / Citratpuffer	Siedenden Wasserbad / Citratpuffer	Siedenden Wasserbad / Citratpuffer
Peroxidase Block	Bloxall oder 2% H 2 O 2, 45 sec	Bloxall oder 1,5% H 2 O 2, 30 min	Bloxall oder 0,5% H 2 O 2, 20 min	Bloxall oder 2%H 2 O 2, 45 sec	Bloxall oder 3% H 2 O 2, 20 min
Serum-Block	1% BSA, 30 min	10% NGS, 30min	20% NRS, 20 min	10% NGS, 45 min	10% NRS, 30 min
Waschpuffer	PBS	TBS / T	TBS / T	PBS	TBS / T
Bedingungen für Primär Ab	1/300, 2 h bei RT	1/100, 1 h bei RT	1/50, 1 h bei RT	1/750, O / N bei 4 ° C	1/500, 1 h bei RT
Sekundär Ab	Immpress HRP Anti-Maus-IgG-Kit	Immpress HRP-Anti-Kaninchen-IgG-Kit	Biotinylierten Kaninchen-Antimaus	Biotinylierten Ziege anti-Kaninchen	Biotinylierten Kaninchen anti-Ziege
Bedingungen für Sekundär Ab	1 h bei RT	30 min bei RT	1/200, 30 min bei RT	1/200, 30 min bei RT
Signalverstärkung	N / A	N / A	ABC-Kit	ABC-Kit	ABC-Kit
Signalerkennung	ImmPACT DAB Peroxidase	ImmPACT DAB Peroxidase	ImmPACT DAB Peroxidase	ImmPACT DAB Peroxidase	ImmPACT DAB Peroxidase
Immunfluoreszenz-Antikörper	AlexaFluor 488	AlexaFluor 594	N / A	N / A	N / A
Immunfluoreszenz-Eigenschaften	Anregungs Max 488 / Emissions-Max 525	Anregungs Max 595 / Emissions-Max 617
Gemeinsame Filter-Set	FITC	Texas Red

Inhalt "> Tabelle 2: IHC Antikörper Bedingungen

Diskussion

Verwendung bedingter cre-lox-transgenen Mäusen, die Funktion der Gene und Zellen zu zerlegen ist ein häufig verwendeter Ansatz. Diese Modelle sind mit großem Erfolg im Darm verwendet worden, um zu identifizieren und zu charakterisieren, die Stammzellen ^2,4-6 und zu verstehen, ihre Rolle bei der Krankheit ^25. Diese Modelle voll auszuschöpfen erfordert eine umfassende Charakterisierung des Systems zu ermöglichen, dass Daten richtig interpretiert werden. Ein vollständiges Verständnis dieser Systeme ist schwierig zu erreichen, aufgrund von Genen nur selten spezifisch für eine Einzelzelle Typ oder Ort, einer geringen biologischen Erkenntnisse und Ineffizienz der verwendet wird, um Cre Expression zu induzieren Systeme. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, wie wir diese Probleme durch experimentelle Gestaltung und Anwendung des vorhandenen Wissens zu überwinden. Obwohl wir diese Methoden verwendet werden, um eine spezifische Fragestellung der hier vorgestellten Techniken sind generisch und kann für jede Forschung Untersuchung der Muri ausgenutzt werden, zu beantwortenne Darm.

Vorbereitung der Darmgewebe

Der entscheidende Schritt für die Gewährleistung robustere Ergebnisse ist die Ernte und Verarbeitung des Gewebes, die zeitnah und Fixierung Protokolle genau eingehalten verarbeitet werden muss. Da fast alle wichtigen Fragen können stromabwärts zu Artefakten mit dem Gewebe Austrocknen und / oder unvollständige Fixierung zugeordnet zurückzuführen. Timing ist entscheidend, um eine Verschlechterung der Gewebearchitektur und / oder Nukleinsäuren und Proteinen zu verhindern. Unvollständige oder übereifrigen Fixierung kann zum Verlust der histochemischen Auflösung führen. Unvollständige Fixierung aufgrund unzureichender Zeit oder Abschnitte zu dick, um zu ermöglichen Fixiermittel Penetration kann zu einem Verlust der Auflösung innerhalb der Darmkrypten, die als "Wassermarke" auf IHC-Analyse beobachtet werden kann, führen. Weiterhin ist es wichtig, dass Fixierung nicht zu lange zu verlängern, wie kern β-Catenin aus dem Zellkern, sofern nicht sofort pro diffundierenbeitet und Wachs eingebettet folgenden Formalinfixierung.

Rolle der Paneth-Zellen in der ISC-Nischen-

Die hier vorgestellten Daten effektiv zu zeigen, wie wichtig die Paneth-Zellen in Krypta Regeneration im adulten Darm folgenden ISC Verlust. Allerdings blieb die Möglichkeit, dass Ah-cre erspart eine Bevölkerung von ISCs dass vil-Cre-ER ^T2 Ziele. Tian et al. ²⁶ elegant gezeigt, dass die Lgr5 ^hallo ISCs werden von einer Bevölkerung von Lgr5 ^lo Reserve ISCs ersetzt. Es scheint nun wahrscheinlich, dass diese ISCs in der Ah-cre-System aufgrund der Reservepopulation, die als sekretorischen Zellvorläufer ^6,7 identifiziert verschont. Die Bedeutung des reifen Paneth Zelle bei der Unterstützung dieser sekretorischen Zellvorläufer bei Bedarf zu einem ISC Zustand zurück bleibt unbeantwortet. Wie Paneth-Zellen bilden die ISC Nischen ^{8 und} spielen eine Rolle bei der Regulierung der ISC-Antworten, die Kalorienaufnahme ²⁷ und Entzündung ²⁸ bleibt es wahrscheinlich, dass ihre Pflegefunktionen, um ihre eigenen Vorprodukte zu verlängern.

Neue Konzepte und Technologien zur effektiven Modell Menschen Darmkrebs

Die Entdeckung des ISC führte zur Identifizierung von Genen, die nun verwendet werden, um neue Mausmodelle für die Untersuchung der Rolle der Gene und Zellen in Darm-Biologie und Erkrankung durch Clarke et al ⁹ Bewertung zu erzeugen. Die einzigen Einschränkungen dieser Technik ist die Identifizierung von Genen, die Cre-Protein zu exprimieren. Derzeit ISCs werden routinemäßig untersucht mit Hilfe von bedingten transgenen Mäusen auf der Grundlage der Lgr5 Genexpressionsmuster. Mäuse, die Cre vom Lgr5 Promotors exprimieren, wurden verwendet, um APC, das Gen am häufigsten bei Darmkrebs mutiert (CRC zu löschen), Was die ISC als Ursprungszelle ^25. Selektiven Löschen anderer CRC-Gene in diesen Zellen wird einen Einblick in den Krankheitsverlauf und die Ausbreitung z. PTEN ^29. Weitere Einblicke in ISC-Funktion wird von speziell Abtragen Lgr5 exprimierenden Zellen in Mäusen mit einem menschlichen Diphtherie-Toxin-Rezeptor abgerufen (DTR) Gen klopfte in die Lgr5 Locus ^26. Andere Strategien nutzen die Tet-A-System, das laufende reversible Expression der mutierten Proteine ^​​30 ermöglicht. Mit Hilfe dieser Werkzeuge, um Gen (en) in verschiedenen Zellen ³¹ und Standorte ^32,33 ändern wird verwendet, um zu verstehen, wie Krebs auslösen, Fortschritt und metastasieren ^34. Alternativ Mutagenese mit dem Transposon Sleeping Beauty System ist die Identifizierung neuer Fahrer von CRC. Die Weiterentwicklung von Mäusen, Techniken und genetische Veränderung Strategien weiterhin mehr Patienten relevanten Modelle zu entwickeln.

New methoden wurden zur Charakterisierung der Darmepithelien und ISCs entwickelt. Charakterisierung des Verhältnisses der epithelialen Zelltypen können mit Strömung erreicht werden Zytometrie auf die differentielle Expression von Lectin und CD24 ^{35 basierend.} Möglicherweise der größte Fortschritt in der ISC Verständnis der Biologie und ihre Rolle bei der Krankheit mit der ex vivo organoiden Kultursystem ³⁶ durchgeführt werden. Dieses System erlaubt es normalen und malignen ISCs zu Kultur in 3D, wo sie zu replizieren und zu differenzieren in einem physiologisch relevanten Art und Weise. Es ist zu hoffen, dass diese direkte Prüfung von Arzneimitteln am Patientenproben in vitro zu ermöglichen und damit den Weg für die personalisierte Medizin ^37.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetatpuffer	*	*	Zur Herstellung von 100 ml: 4,8 ml 0,2 M Essigsäure, 45,2 ml 0,2 M Natriumacetat & 50 ml destilliertes Wasser
	Essigsäure Fisher Scientific	C/0400/PB17
Essigsäureanhydrid	Sigma	A6404
Essigsäureanhydridlösung	*	*	2 M Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolaminhydrochlorid
Alcianblau	Sigma	A5268
Alcian Blue pH 2,5	*	*Zur	Herstellung von 500 ml: 15 ml Essigsäure, 5 g Alcian Blue & 485 ml destilliertes Wasser
Anti-Digoxigenin alkalische Phosphatase konjugierter Antikörper	Abcam	ab119345
B(beta)-Naphthoflavon	Sigma	N3633	BNF, injizieren, ohne die Lösung zu stark abkühlen zu lassen, da die Verbindung aus der Lösung fällt. Die Lösung kann wiederverwendet werden – Lagerung bei -20 °; C zwischen den Anwendungen, nicht mehr als zweimal erhitzen.
Bloxall	Vector Labs	SP-6000
BM lila	Roche	11442074001
BSA	Sigma	A4503	Rinderserumalbumin
Chloroform	Fisher Scientific	C/4920/17
Citrat Puffer/Antigen Demaskierungslösung	Vector Labs	H-3300
Maisöl	Sigma	C8627
Entwässerungslösung	*	*	Für 500 ml: 50 ml Glycerin, 50 ml Tris 0,1 M pH8,8, 100 ml EtOH, 300 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl in Wasser), DTT 1,7 g. Die Entwässerungslösung kann im voraus hergestellt und gelagert werden, aber DTT-Schaum muss erst kurz vor der Inkubation (340 mg/100 ml) zugegeben werden.
DEPC aufbereitetes Wasser	Life Technologies	750023
DTT	Sigma	101509944
EDTA	Sigma	O3690	0,5M
Ethanol	Fisher Scientific	E/0650DF/17
Filterpapier	Whatman	3000917
Formaldehyd	Sigma	F8775
Formalin	Sigma	SLBL11382V	Neutral gepuffertes Formalin
Formamid	Sigma	F5786
Glutaraldehye	Sigma	G6257
H2O2	Sigma	216763
Hämatoxylin	Raymond A Lamm	12698616
HBSS	Gibco	14175-053	HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisierungspuffer	*	*	5& mal; SSC, 50% Formamid, 5% SDS, 1 mg/ml Heparin, 1 mg/ml Kälberleber
tRNA Hydrochinon	Sigma	H9003
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Labs	SK-4105
Immpress HRP Anti-Maus IgG Kit	Vector Labs	MP-7402
Immpress HRP Anti-Kaninchen IgG Kit	Vector Labs	MP-7401
Darmgewebepulver	*	*	Die Dünndärme von 5 adulten Mäusen wurden kombiniert und in einem minimalen Volumen an eiskaltem PBS homogenisiert. 4 Volumen eiskaltes Aceton wurden in den homogenisierten Darm gegeben, der gründlich gemischt und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert wurde. Dieses wurde zentrifugiert und das Pellet mit eiskaltem Aceton gewaschen. Dieses wurde weiter zentrifugiert und das entstandene Pellet auf Filterpapier verteilt und trocknen gelassen. Nach dem gründlichen Trocknen wurde das Material mit Stößel und Mörser zu einem feinen Pulver zerkleinert.
K-Ferricyanid	Sigma	P-3667
K-Ferrocyanid	Sigma	P3289
Levamisol	Sigma	L0380000
Methacarn	*	60	% Methanol:30% Chloroform:10% Essigsäure
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/17
MgCl2	Sigma	M8266
Normales Kaninchenserum	Vector	Labs S-1012	NGS
Normales Kaninchenserum	Dako	X0902	NRS
NTMT	*	*	100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 2 mM Levamisol
PAP Pen	Vector	H-400
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
PBT	*	*	0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7,5, 0,1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	100x Auflösung.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)	Fisher Scientific	BP3994	1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt, um 1x
PLL-Objektträger	Sigma	P0425-72EA	Poly-L-Lysin-Objektträger
Proteinase K	Sigma	P2308
Proteinase k-Lösung	*	*	Verdünnte Proteinase K bei 200 &; Mikro; g/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax	BDH	36154 7N
Reducer Solution	*	*	Zur Herstellung von 100 ml: 1 g Hydrochinon, 5 g Natriumsulfit & 100 ml destilliertes Wasser
RnaseA	Sigma	R6148
Kochsalzlösung	*	*	0,9% NaCl in destilliertem Wasser
SDS	Sigma	I3771
Schafserum	Sigma	S3772
Silbernitrat	Sigma	S/1240/46
Silberlösung	*	*	Zur Herstellung von 100 ml: 10 ml Acetatpuffer, 87 ml destilliertes Wasser, 3 ml 1% Silbernitrat
Natriumacetat	Fisher Scientific	S/2120/53
Natriumchlorid	Sigma	S6753	NaCl
Natriumsulfit	Sigma	239321
SSC	Sigma	93017	20x Kochsalzlösung Natriumcitrat
Chirurgisches Klebeband	Fisher Scientific	12960495
Tamoxifen	Sigma	T5648	TAM, injizieren, ohne die Lösung zu stark abkühlen zu lassen, da die Verbindung aus der Lösung fällt. Die Lösung kann wiederverwendet werden – Lagerung bei -20 °; C zwischen den Anwendungen, nicht mehr als zweimal erhitzen.
TBS/	T-Zell-Signalgebung	#9997
Triethanolaminhydrochlorid	Sigma	T1502
Tris-HCL	Invitrogen	15567-027
Tween20	Sigma	TP9416
VectaMount	Vector Labs	H-5000
VectaShield Hardset Einbettmedium mit DAPI	Vector Labs	H-1500
Vectastain ABC Kit	Vector Labs	PK-4001
X-Gal	Promega	V3941
X-Gal Fixiermittel	*	*	2% Formaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd in 1x PBS
X-Gal Fleck	*	*	X-Gal Fleck; 200 μ l X-Gal (A) in 50 ml Lösung B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-Ferricyanid, 0,734 g K-Ferrocyanid in 500 ml PBS).  Lösung B kann im voraus aufgefüllt und bei 4 μg gelagert werden; C
Xylol	Fisher Scientific	X/0200/21