Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von zwei monoklonalen Antikörpern (mAbs) der IgG-Klasse, die stark auf Myoglobin von Walen reagieren. Diese mAbs werden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen aufgebracht, der auf dem Sandwichformat basiert, um das Mb von Walen und Delfinen von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifens auf der Grundlage des Sandwich-Formats, der zur Unterscheidung des Myoglobins (Mb) von Walen und Delfinen von dem von Robben und anderen Tieren verwendet werden kann. Der Streifen ermöglicht ein schnelles und sofortiges Screening auf Walfleisch und schränkt so den illegalen Handel und Verzehr ein. Es wurden zwei monoklonale Antikörper (mAbs) mit Reaktivität gegenüber dem Mb von Walen entwickelt. Die Aminosäuresequenzen von Mb-antigen-reaktiven Regionen aus verschiedenen Tieren wurden analysiert, um zwei synthetische Peptide (ein allgemeines Peptid und ein spezifisches Peptid) zu entwerfen und danach die mAbs (Unterklasse IgG₁) zu erhöhen. Die mAbs wurden aus Hybridomen ausgewählt, die mittels indirektem ELISA, Western Blot und Dot Blot gescreent wurden. CGF5H9 war spezifisch für die Mbs von Kaninchen, Hunden, Schweinen, Kühen, Ziegen und Walen, während es eine schwache bis keine Affinität zu den Mbs von Hühnern, Thunfisch und Robben zeigte. CSF1H13 kann Robben und Wale mit starker Affinität binden, zeigte aber keine Affinität zu anderen Tieren. Walproben aus vier Familien (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae und Kogiidae) wurden in dieser Studie verwendet, und die Ergebnisse zeigten, dass diese beiden mAbs eine breite Bindungsfähigkeit an Mbs von verschiedenen Walen aufweisen. Diese mAbs wurden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen vom Sandwich-Typ aufgebracht. CGF5H9, das viele Spezies erkennt, wurde kolloidisiert mit Gold markiert und als Nachweisantikörper verwendet. CSF1H13, das auf der Testzone beschichtet war, wies das Vorhandensein von Walen und Robben Mbs nach. Muskelproben von Thunfisch, Huhn, Robben, fünf Arten von Landsäugetieren und 15 Arten von Walen wurden in dreifacher Ausfertigung untersucht. Alle Walproben zeigten positive Ergebnisse und alle anderen Proben zeigten negative Ergebnisse.

Introduction

Historisch gesehen wurde Walfleisch in vielen Teilen der Welt konsumiert und dieser Verzehr setzt sich auch heute noch fort¹. Aufgrund des trophischen Gehalts an Walen ist bekannt, dass ihr Fleisch einen hohen Gehalt an Quecksilber und anderen Giftstoffen aufweist². Daher könnte der Verzehr von Walfleisch nicht nur für Hochrisikogruppen wie Schwangere, sondern auch für die Allgemeinbevölkerung zu einem gesundheitlichen Problem führen³. Darüber hinaus kann es auch während der Verarbeitung und Lagerung zu einer Kontamination von Walfleisch mit zoonotischen oder potenziell zoonotischen Erregern kommen⁴. Selbst für erfahrene Agenten ist es schwierig, Walfleisch allein anhand seines Aussehens zu identifizieren. Daher ist eine zuverlässige wissenschaftliche Identifizierungsmethode erforderlich, um Walfleisch von anderen Fleischsorten unterscheiden zu können. Dies würde dazu beitragen, den Verzehr von Walfleisch einzuschränken.

Derzeitige Methoden zur Speziesbestimmung umfassen molekulare Techniken und immunologische Methoden. Molekulare Techniken wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die DNA-Sequenzierung können verwendet werden, um Proben nicht nur von rohem Fleisch⁵ und zersetzten Proben⁶, sondern auch von verarbeiteten Lebensmitteln wie Kochwurst und Futtermitteln^7,8 zu identifizieren. Immunologische Methoden, wie z. B. der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), werden in der Lebensmittelproduktion häufig eingesetzt, um den Fleischgehalt von z. B. Schweinefleisch⁹, Rindfleisch¹⁰ und Wels¹¹ nachzuweisen. PCR-basierte DNA-Analysen zur Identifizierung von Walfleisch sind verfügbar¹² und haben dazu beigetragen, den illegalen internationalen Handel mit Walfleisch in Japan, Südkorea, den Philippinen, Taiwan, Hongkong, Russland, Norwegen und den Vereinigten Staaten zu verhindern¹. Diese Methoden sind effektiv und zuverlässig, aber sie können Stunden oder Tage in Anspruch nehmen und erfordern mühsame Schritte. Die Identifizierung von Walfleisch basiert in der Regel auf molekularen Techniken, und es gibt derzeit keine immunologische Methode. Für die Regulierungsbehörden ist es sehr wünschenswert, eine zuverlässige und schnelle Technik zu entwickeln, die vor Ort zur Identifizierung von Walfleisch eingesetzt werden kann.

Immunchromatographische Streifen werden als Nachweiswerkzeuge verwendet, mit dem Vorteil, dass sie über ein einfaches Protokoll, das für den Einsatz im Feld geeignet ist, schnelle Ergebnisse liefern. Die Prinzipien des immunchromatographischen Streifens und des ELISA sind sehr ähnlich und umfassen Antikörper, Antigene und Markierungen. Viele verschiedene Markierungen wie kolloidales Gold, Kohlenstoff und Latex wurden bei der Entwicklung von immunchromatographischen Streifen verwendet. Gegenwärtig wird diese Methode häufig zum Nachweis von Antibiotika, Toxinen, Bakterien und Viren verwendet¹³, aber sie wird selten zur Identifizierung von Proteinen in Fleisch verwendet^14,15. In dieser Arbeit schlagen wir einen Lateral-Flow-chromatographischen Enzymimmunoassay für den schnellen Nachweis von Walmyoglobin (Mb) vor.

Protocol

Ethik - Statement: Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien durchgeführt und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Nationalen Chiayi University, Zulassung ID: 99022. Die cetacean Probe Verwendung durch den Rat für Landwirtschaft von Taiwan (Research Erlaubnis erlaubt wurde 100M-02.1-C-99).

1. Muskel-Probenvorbereitung und SDS-PAGE

Hinweis: Muskelproben von 23 Arten , darunter 16 Arten von Meeressäugetieren, 5 Arten von Landsäugetieren, Thunfisch und Huhn wurden in dieser Studie (Tabelle 1). Die cetacean Muskelproben wurden aus gestrandeten Personen, Fischerei Beifang und die Einziehung erhalten. Kaninchen, Ratte, Hund und Huhn Muskelgewebe wurden von Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi Universität erhalten. Proben von Rind, Schwein, Lamm und Thunfisch wurden von einem lokalen Supermarkt gekauft. Die Muskelprobe der Seehund (Phoca vitulina ) wurde von Farglory Ocean Park zur Verfügung gestellt. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde verwendet, um lösliche Proteine ​​mit unterschiedlichen Molekulargewichten in Muskelproben zu trennen.

1. Speichern Sie alle Proben bei -20 ° C bis zur Verwendung.
2. Pre-kühlen Mörtel bei -20 ° C. Dann legte 3 g gefrorene Muskelprobe hinein.
3. Homogenisieren der Probe mit 10 ml kaltem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einem Gewebe-Homogenisator.
4. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Probe bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie die Überstände und lagern Sie es bei -20 ° C bis zur Verwendung.
5. Bereiten 5 ml 5% Sammelgel (3,07 ml destilliertes Wasser, 1,25 ml 4x oberen Gel Puffer von pH 6,8, 625 & mgr; l 40% -iges Acrylamid, 50 ul 10% Ammoniumpersulfat (APS) und 5 ul Tetramethylethylendiamin ( TEMED)) und 10 ml 15% Trenngel (3,65 ml destilliertem Wasser, 2,5 ml 4-fach niedriger Gel Puffer von pH 8,8, 3,75 ml 40% Acrylamid, 100 & mgr; l 10% APS,und 4 & mgr; l TEMED).
   1. In der Elektrophorese-Zelle, gieße Sammelgel (5% Acrylamid) auf der Oberseite des Trenn Gel (15% Acrylamid), nachdem diese erstarrt ist. Legen Sie eine Gelkamm in Stapel Gel.
6. Führen Sie PAGE gemäß den folgenden Bedingungen: Anfangslaufzustand: 100 Volt, 20 min und Endzustand: 120 Volt, 40 min.
7. Stain das Gel mit Coomassie-Brilliantblau bei Raumtemperatur für 30 Minuten, bis das Gel in der Farbe gleichmäßig blau ist.
   Anmerkung: Die Färbung abgeschlossen ist, wenn das Gel in der Farbstofflösung nicht mehr sichtbar ist.
8. Entfärben sie mit der Lösung Essigsäure (10%) bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Bands beginnen zu erscheinen. Weiter bei 4 ° C über Nacht Entfärben bis Hintergrund ist klar.

2. Peptid-Synthese und die Produktion monoklonaler Antikörper

1. Rufen Sie die Aminosäuresequenzen von Mb von GenBank einschließlich Thunfisch, Huhn, Strauß, Haussäugetiere, Dichtung und 18 Artenvon Walen (Tabelle 2).
2. Richten Sie die Sequenzen unter Verwendung geeigneter Software ^16:
   1. Starten Sie den Alignment Explorer , indem Sie das Ausrichten: Bearbeiten / Build Ausrichtung in der Startleiste; wählen Sie Neue Ausrichtung erstellen und klicken Sie auf OK. Es erscheint ein Dialog zu fragen: "Sind Sie mit der Erstellung eines DNA-oder Protein-Ausrichtungs-Sequenz?"
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung "Protein"; wählen Sie Daten: Open: Abrufen von Sequenzen aus Datei , und wählen Sie Sequenzdatei; Bearbeiten: Alles Menübefehl Alle Site wählen für jede Folge in den Daten für die Erstellung eines multiplen Sequenz - Alignment - Set auszuwählen.
   3. Wählen Sie Ausrichtung: Richten von ClustalW aus dem Hauptmenü die ausgewählten Sequenzen Daten unter Verwendung des ClustalW Algorithmus auszurichten; wählen Sie "BLOSUM" als Protein Gewicht Matrix dann auf die Schaltfläche OK klicken.
3. Analysieren Sie den Sequenzabgleich:
   1. Konzentrieren Sie sich auf 5 Antigen-reaktiven sites ^17: Seite 1 (AKVEADVA, 15-22), Seite 2 (KASEDLK, 56-62), Seite 3 (ATKHKI, 94-99), Seite 4 (HVLHSRH, 113-119) und Site - 5 (KYKELGY, 145- 151) und das Fragment unter Walen konserviert finden. Ein * (Sternchen; Konsens-Symbol in der Ausrichtung (Protokoll 2.2.3)) gibt an Positionen, die einen einzigen, vollständig konservierten Rest haben. Die folgenden konservierte Fragmente in Walen wurden gefunden: Sequenz KASEDLKKHG und Sequenz HVLHSRHP (die Seite 2 enthält) (einschließlich Standort 4).
4. Synthetisieren Kandidatensequenzfragmente nach der Sequenzanalyse und das Konjugat mit einem Protein Ovalbumin (OVA) als Trägerprotein unter Verwendung von kommerziellen Diensten.
   1. Hinzufügen hydrophoben Aminosäuren (zB Methionin) an das N-terminale antigener reaktiven Stelle zur Verhinderung der Zersetzung von Peptid (zB M-KASEDLKKHG).
   2. Verlängerung der C-terminalen antigener reaktive Stelle für die Kernantigenstelle an die Immunozyten auszusetzen. Des Weiteren conjuGate das Peptid mit OVA durch einen Cystein - Zugabe (Cys, C) an die C-terminale (zB M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. Emulgieren komplettem Freund'schem Adjuvans für Immunogen 1 oder unvollständiges Freund'sches Adjuvans für Immunogen 2 mit einem gleichen Volumen jedes synthetische Peptid in PBS (3 ml, Endkonzentration von 30-50 & mgr; g / 100 & mgr; l).
6. Beimpfen von Immunogen 1 (0,1 mg) subkutan in die jeweils 5 weiblichen BALB / c Mäusen.
7. Führen Sie subkutanen Booster-Injektionen fünfmal unter Verwendung von Immunogen 2 in zweiwöchigen Intervallen und sammeln Testseren durch Schwanzclip Probenahme aus den Mäusen vor jedem Booster.
8. Bestimmen Sie sera Titer für das erste Screening.
   1. Man löst 100 & mgr; g freies Peptid in 25 ml Reaktionspuffer und 50 & mgr; l Aliquot der Lösung in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen. In 10 ul Kupplungsreagenz Lösung in jede Vertiefung und die Platte mischen. Inkubiere die Platte für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
   2. Entfernen Sie den Inhalt des Brunnens,Waschen jeder Vertiefung 3 mal mit destilliertem Wasser, und blockieren die Platte durch Zugabe von 200 ul Lösung blockiert. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Inhalt und waschen jeder Vertiefung 3 mal mit destilliertem Wasser.
   3. Führen indirekte ELISA (Protokoll 5,1-5,7) für sera Titer für das erste Screening zu bestimmen. Wählen Sie die Maus mit dem höchsten Titer (höchste optische Dichte) für Milz Sammlung.
9. Drei Tage vor der Milz Sammlung, impfen 0,1 mg Immunogen 1 subkutan in die Maus, um den höchsten Titer präsentiert.
10. Sammle die Milzzellen aus den immunisierten Mäusen ausgewählt und verschmelzen mit murinen Myelomzellen F0 (sp2 / 0-Ag14) Hybridom - Zellen für die Erzeugung mAb ¹⁸ zu erhalten.
11. 14 Tage nach der Fusion, wählen Sie die positiven Klone durch die Reaktivität von Hybridomaüberständen Screening gegenüber freien synthetisches Peptid mit der indirekten ELISA (Protokoll 5,1-5,7).
12. Verdünne die Zellen zu einer entsprechenden Anzahl pro Vertiefung für maximizing der Anteil an Vertiefungen, die nur einen einzigen Klon (Verdünnungsklonierung) enthalten.
    1. 100 l Zellkulturmedium zu allen Vertiefungen in der 96-Well-Platte mit Ausnahme gut A1, die leer gelassen wird.
    2. In 200 ul der Zellsuspension zu gut A1. Dann Transfer schnell 100 ul von A1 bis B1 und mischen durch vorsichtiges Pipettieren. Wiederholen Sie diese 1: 2-Verdünnungen nach unten die gesamte Spalte, und dann wurden 100 & mgr; l von H1 zu verwerfen, so dass es mit dem gleichen Volumen wie die Vertiefungen darüber endet.
    3. Fügen Sie weitere 100 ul Medium zu Säule 1 mit einer 8-Kanal Mikropipette. Dann Transfer schnell 100 & mgr; l aus jeder der Vertiefungen in Spalte 1 zu den in Spalte 2 die gleiche Pipette und mischen durch vorsichtiges Pipettieren.
    4. Mit den gleichen Spitzen, wiederholen Sie diese 1: 2-Verdünnungen über die gesamte Platte. Verwerfen 100 ul aus jeder der Vertiefungen in der letzten Spalte.
    5. Bringt den Endvolumen von allen Vertiefungen zu 200 & mgr; l durch Zugabe von 100 & mgr; l Medium zu jeder Vertiefung. inkubieren plate ungestört bei 37 ° C in einem befeuchteten CO ₂ -Inkubator.
    6. Überprüfen Sie jede gut und markieren Sie alle Brunnen, die nur eine einzige Kolonie enthalten. Führen Sie zwei oder mehr Klonierungen bis> 90% der Vertiefungen, die einzelne Klone positiv sind für die Antikörperproduktion.
13. Bildschirm, um die Klone durch Western-Blot und Dot-Blot (Protokoll 3,1-4,6). Dann Subkultur Kolonien aus den Vertiefungen in größere Gefäße Zellen zur Gewinnung von mAb zu erweitern. Normalerweise jeder Klon in einem einzigen gut übertragen in einem 12- oder 24-Well-Platte.
14. Messen Sie die Affinität zwischen den mAb und den Muskelextrakten von Kuh, Ziege, Schwein, Hund, Kaninchen, Thunfisch, Huhn, Dichtung und vier repräsentative Walarten durch Western-Blot und Dot-Blot (Protokoll 3,1-4,6).
15. Beimpfen ausgewählten Hybridomzellen (bis zu 3 x 10 ⁶⁾ intraperitoneal in Mäuse - Aszites zu induzieren. Abdominal Schwellung ist in der Regel offensichtlich innerhalb von 7-10 Tagen Hybridom Injektion. Sammeln Flüssigkeit mit einer Injektionsnadel mit(Weniger als 20 gauge).
16. Zentrifuge Aszitesflüssigkeit (10.000 xg für 10 min) Zellen und Trümmer zu entfernen. Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter. Hinzufügen von 1 zu 20 ml der Probe, 15 ml Bindungspuffer, und 3 bis 5 ml Elutionspuffer in das Protein G-Sepharose-Säule. Sammeln Sie die Elutionsfraktion enthält gereinigter Antikörper aus den Mäusen Ascites-Flüssigkeit.
17. Bestimmen Sie den Antikörperisotyp durch Antikörper Isotypisierungskits der Verwendung der Herstelleranweisungen.

3. Western Blot

1. Bereiten 2x Beladungspuffer, enthaltend β-Mercaptoethanol (BME), indem sie mit 50 ul BME 950 ul 2x Laemmli Probenpuffer vermischt werden. Verdünnen Sie die Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in Ladepuffer mit geeigneten Verhältnis zum Erhalt gute Signale: 1:50 (Walen und Dichtung) und 1: 5 (Haustieren und Thunfisch), wenn polyklonalen Kaninchen-Anti-Human-Mb Antikörper verwendet, und 1: 1 (Schwein, Kaninchen, Huhn und Thunfisch), 1: 5 (Kuh, Ziege und Hund) und 01.25 (Walen und Dichtung), wenn einntibody ist aus Hybridom-Überstand.
2. Wärme Probe bei 95 ° C für 5 min. Last Proben in die Vertiefungen von SDS-PAGE-Gel (4% Acrylamid Stapelung und 12% Acrylamid Trenn) zusammen mit Molekulargewichtsmarkern. Führen Sie das Gel für 5 min bei 50 V erhöhen Sie die Spannung bis 150 V, um den Lauf in etwa 1 Stunde zu beenden.
3. Legen Sie das Gel in 1x Transferpuffer für 15 min. Transfer des abgetrennten Protein auf Nitrocellulose (NC) -Membranen, nachdem sie durch PAGE getrennt. Transfer kann bei 100 V für 60 bis 90 min durchgeführt werden.
4. Bereiten Blockierungslösung: 1x PBS, enthaltend 0,1% Tween 20 mit 5% fettfreier Trockenmilch. Blockieren die NC-Membran in 25 ml für 1 Stunde Lösung bei Raumtemperatur blockiert. Waschen dreimal 5 min mit je 15 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST).
5. Inkubieren der Membran und primärem Antikörper (Aszites-Flüssigkeit oder Hybridom-Überstand) in 10 ml Antikörperverdünnungspuffer über Nacht bei 4 ° C mit 5% Blockierungslösung verdünnt.
6. Waschen Sie die Membrane dreimal wieder mit PBST übermäßige Antikörper zu reinigen.
7. Inkubieren der Membran mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG bei 1: 1250 in Blockierlösung unter leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
8. Waschen der Membran wieder und inkubieren es in der 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat / p-Nitroblautetrazoliumchlorid (BCIP / NBT) Phosphatase-Substratmischung für 10 bis 20 min, bis die Farbentwicklung.
9. Die Reaktion durch die Membran in mehrere Änderungen von destilliertem Wasser zu waschen.

4. Dot Blot

1. Verdünnen Sie die Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST mit geeigneten Verhältnis zum Erhalt gute Signale: 1: 5 für Haustiere und Thunfisch und 01.25 für Walen und Dichtung. Spot 5 & mgr; l Proben auf Membran. Minimieren Sie den Bereich, dass die Lösung (in der Regel 3-4 mm Durchmesser) dringt durch sie langsam Anwendung.
2. Trocknen der Membran bei Raumtemperatur (zB </ Em> in einer laminaren Strömung für 30-60 min), blockieren Lösung in Petrischale für 1 Stunde bei Raumtemperatur, und waschen Sie es mit PBST mit blockieren.
3. Inkubieren der Membran mit primärem Antikörper (mAb aus Hybridom-Überstand bei 1: 10.000 oder Aszitesflüssigkeit bei 1: 100.000 in 5% Blockierungslösung verdünnt) für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Verwendung PBST die Membran dreimal 5 min jeweils zu waschen überschüssigen Antikörper zu entfernen, und dann (anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-konjugiertem Ziege auf 1: 1.250 in 5% Blockierungslösung) mit sekundärem Antikörper inkubiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur .
5. Waschen der Membran wieder und inkubiere in der BCIP / NBT-Phosphatase-Substratmischung innerhalb 10 bis 20 min, bis die Farbentwicklung.
6. Die Reaktion durch die Membran in mehrere Änderungen von destilliertem Wasser zu waschen.

5. Indirekte ELISA

1. Bereiten Waschpuffer (0,002 M Imidazol-gepufferte Salzlösung mit 0,02% Tween 20). Waschen Sie die Platte 3-mal mit WaschPuffer zwischen jedem folgenden Schritt (Protokoll 5,2-5,5).
2. Bereiten 01.25 Verdünnung von Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in Beschichtungspuffer. Mantel eine 96-Well-ELISA-Platte mit 100 & mgr; l verdünnte Überstand bei 4 ° C über Nacht und Blockieren mit Blockierungspuffer (1% BSA in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie 1: 2000 Verdünnung des gereinigten mAb mit verdünnter Puffer und fügen 100 ul verdünnt mAb in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Hinzufügen anti-Maus-Ziegen-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (1: 200-Verdünnung in Puffer verdünnt) für die weitere Inkubation.
5. In Peroxidase Substrat in jede Vertiefung (100 ul / Vertiefung) und Inkubation für 10-15 min.
6. Stoppen Sie die Enzymreaktion durch die Peroxidase-Stop-Lösung (100 ul / Vertiefung), wenn die Farbentwicklung zu beobachten ist.
7. Lesen Sie die optische Dichte bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Spektralphotometer.

6. Herstellung von kolloidalem Gold markiertem mAb

Hinweis: Die Farbe der kolloidalen Goldlösung, und die Mischung sollte immer rot sein. Der pH-Wert, Konzentration von mAb, Zentrifugengeschwindigkeit, wenn schwarzer Niederschlag bemerkt wird. Die Schritte 6.1 und 6.2 sind Optimierungsschritte.

1. Hinzufügen gereinigter Erfassungs mAb (50 ug / ml, 3 & mgr; l) zu 100 & mgr; l von kolloidalen Goldlösung mit pH-Werten von 5 bis 9 variierende. Die minimale pH-Wert, die Farbe Rot zwei Stunden lang hält, ist als der optimale pH-Wert betrachtet. Hinweis: In dieser Studie wurden 0,1 M Kaliumcarbonat verwendet wurde Kolloidgold einzustellen (40 nm) Lösung pH 8.0 (pH-Optimum).
2. Fügen verschiedene Menge an gereinigtem mAb Erfassen (500 ug / ml, 1-20 ul) zu 100 ul von kolloidalen Goldlösung bei pH 8,0. Anmerkung: Die optimale Konzentration in dieser Studie beträgt 6 & mgr; g / ml (kein schwarzer Niederschlag).
3. Nach den obigen Ergebnissen, mit 60 ug gereinigtem Nachweis mAb tropfenweise zu 10 ml Kolloid Goldlösung. Emulgieren der Mischung vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 min. Anzeiged 2 ml 5% BSA-Lösung in PBS (pH 7,4) zu dem Gemisch gegeben und für 15 min bei Raumtemperatur leicht emulgieren, um Hintergrundstörungen zu reduzieren.
4. Zentrifugieren der Mischung bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C.
5. Entfernen Sie den Überstand mit nicht-konjugierten Antikörper sorgfältig und setzt die resultierenden Pellets in 4 ml PBST mit 1% BSA und 0,1% Tween 20, und wiederholen Zentrifugation und Suspension mehrere Male.
6. Suspend die letzten Niederschläge in 1 ml PBST und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.

7. Konstruktion von Immun-Streifen

Hinweis: Abbildung 1 zeigt die Immunstreifendesign. Bereiten Sie und die Streifen in einer feuchtigkeitsarmen Laborumgebungsbedingungen (<20% relative Luftfeuchtigkeit) für eine längere Haltbarkeit (> 1 Jahr) montieren. Die Abmessungen des Pads und Membran sind: Konjugat-Pad 300 mm x 10 mm, absorbierendes Kissen 300 mm x 24 mm, Probenkissen 300 mm x 24 mm, NC-Membran 300 mm x 25 mm, Pappe 300mm x 80 mm.

1. Hinzufügen Kolloidgold-markiertem mAb-Lösung aus Schritt 6.6 mit einer Mikropipette, die das Konjugat-Pad zu sättigen und dann für 1 h bei 37 ° C Trocknen vor der Montage.
2. Verteilen das spezifische Antigen-Einfangen mAb (500 ug / ml) auf die Testzone und Kaninchen-anti-Maus-IgG (500 & mgr; g / ml) auf der Steuerzone mAb auf der NC-Membran mit einer Pipette oder immunostrip Drucker zu erfassen. Pflegen Abstand (> 5 mm) zwischen den beiden Zonen Interferenzen zu vermeiden.
3. Fügen Sie das konjugierte Polster, absorbierende Kissen und NC-Membran auf der Montagefläche mit doppelseitigem Klebeband.
   Hinweis: overlap die Pads auf jeder Seite der NC-Membran um ca. 2 mm. Unangemessen Streifen Konstruktion wird in einer unvollständigen Prüfung zur Folge haben.
4. Legen Sie das Probenkissen über das Konjugat-Pad (2 mm) und fügen Sie ihn auf der Montagefläche.
5. Erstellen Sie 6 mm breiten Streifen mit einem Papierschneider. Packen Sie die Streifen in der Aluminiumfolienbeutel mit Trockenmittel, und lagern Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung.

8. Kreuzreaktivität-Test

1. Homogenisieren 0,03 g der rohen Muskelprobe mit 1 ml PBS (enthaltend 0,1% BSA) in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen einen Bambusstab verwendet oder Stangenschleifen.
2. Halten Sie den Streifen am Ende gegenüber den Testbereichen und tauchen Sie das Probenkissen Teil in die Probe für 5-10 Minuten und das Ergebnis direkt zu beobachten.
   1. Optional: Sammeln Sie 500 ul Überstand und überträgt es auf ein neues Zentrifugenröhrchen.
      Anmerkung: Dieser Schritt wird vorgeschlagen, wenn das Signal nicht offensichtlich ist, wenn das Band direkt in den Überstand getränkt ist.
3. Testen Sie verschiedene Muskelproben in dreifacher Ausfertigung.
   Hinweis: Hier haben wir getestet Thunfisch, Huhn, Siegel, 15 Arten von Walen und 5 Arten von Landsäugetieren.
4. Haben fünf unabhängige Inspektoren 8.3 für fünfmal wiederholen, das heißt, verwenden Sie 575 Streifen insgesamt.

Results

Monoklonaler Antikörper Merkmale

Wir entwickelten zwei IgG - ₁ - mAb (CGF5H9 und CSF1H13) die Anerkennung von zwei synthetischen Peptiden (MKASEDLKKHGNTVLC und AIIHVLHSRHPAEFGC) jeweils von cetacean Mb, und diese wurden verwendet , um ein Sandwich-Typ mit kolloidalem Gold immunochromatographic Teststreifen für die schnelle Detektion von Walen Mb zu konstruieren. 2 zeigt , dass CGF5H9 erkennt Walen und anderen Säugetieren als einzelne gefärbte Band...

Discussion

ein synthetisches Peptid zu Trägerprotein konjugiert unter Verwendung bemerkenswert effektiver im Vergleich zu sein verwandtes Protein. Für ein Sandwich-basierte Technik, weil der mAb unter Verwendung von Epitopen mit bekannten relativen Stellen entwickelt wird, die beiden mAbs in dieser Studie sind nicht geeignet, mit dem jeweils anderen Wechselwirkung mit dem Zielantigen-Epitop zu interferieren. Außerdem kann stärker als die Reaktivität zwischen dem nativen Protein sein , die Reaktivität zwischen dem nativen Protein u...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	GE  Healthcare	28-9031-34	Spin-Säule mit Protein G Sepharose
IsoStrip Maus Monoklonaler Antikörper Isotypisierungskit	Roche	11493027001	Isotypisierungsstreifen, vorbeschichtet mit Subklassen- und Leichtketten-spezifischen Anti-Maus-Ig-Antikörpern
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Nitrocellulosemembran	Whatman	Z613630
Antikörper Blocker-Lösung	LTK BioLaboratories		Zur Minimierung unspezifischer Bindungswechselwirkungen von unspezifischem IgG in den Proben
BCIP/NBT-Phosphatase-Substrat	KPL	50-81-00
Proteindetektor HRP Mikrotiterkit, Anti-Maus	KPL	54-62-18
Nunc Immunplatte MaxiSorp ELISA-Platte	Thermo  Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA Lesegerät	Thermo  Elektron  Corporation	51118170
Kolloid-Gold-Lösung (40 nm)	REGA Biotechnologie AG		40-50 nm ist geeignet für Immunstreifen
Rinderserumalbumin	Gibco	15561-020
Schnelltest immno-strip Drucker	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	Nur für die Produktion von Immunstreifen in kleinem Maßstab für Forschungs- und Entwicklungszwecke geeignet
Streifenkomponenten (NC-Membranen, Probenpads (#33 Glas, S& S), konjugierte Pads (#16S, S& S) und saugfähigen Einlagen (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund' s adjuvans und unvollständiges Freund' s Adjuvans	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Zur Herstellung von Wasser-in-Öl-Emulsionen der Immunogene
Acrylamid, Gelpuffer, Ammoniumpersulfat (APS), Tetramethylethylendiamin (TEMED)	Protech		Gel Vorbereitung für SDS-PAGE
Coomassie brillantblau R-250	Bio-Rad	1610436	Proteinfärbung in SDS-PAGE Gelen
Laemmli Probenpuffer und β-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610737, 1610710	Proteinproben vor dem Laden auf SDS-PAGE Gele verdünnen