Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von zwei monoklonalen Antikörpern (mAbs) der IgG-Klasse, die stark auf Myoglobin von Walen reagieren. Diese mAbs werden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen aufgebracht, der auf dem Sandwichformat basiert, um das Mb von Walen und Delfinen von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden.
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Methodenartikel
Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifens auf der Grundlage des Sandwich-Formats, der zur Unterscheidung des Myoglobins (Mb) von Walen und Delfinen von dem von Robben und anderen Tieren verwendet werden kann. Der Streifen ermöglicht ein schnelles und sofortiges Screening auf Walfleisch und schränkt so den illegalen Handel und Verzehr ein. Es wurden zwei monoklonale Antikörper (mAbs) mit Reaktivität gegenüber dem Mb von Walen entwickelt. Die Aminosäuresequenzen von Mb-antigen-reaktiven Regionen aus verschiedenen Tieren wurden analysiert, um zwei synthetische Peptide (ein allgemeines Peptid und ein spezifisches Peptid) zu entwerfen und danach die mAbs (Unterklasse IgG1) zu erhöhen. Die mAbs wurden aus Hybridomen ausgewählt, die mittels indirektem ELISA, Western Blot und Dot Blot gescreent wurden. CGF5H9 war spezifisch für die Mbs von Kaninchen, Hunden, Schweinen, Kühen, Ziegen und Walen, während es eine schwache bis keine Affinität zu den Mbs von Hühnern, Thunfisch und Robben zeigte. CSF1H13 kann Robben und Wale mit starker Affinität binden, zeigte aber keine Affinität zu anderen Tieren. Walproben aus vier Familien (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae und Kogiidae) wurden in dieser Studie verwendet, und die Ergebnisse zeigten, dass diese beiden mAbs eine breite Bindungsfähigkeit an Mbs von verschiedenen Walen aufweisen. Diese mAbs wurden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen vom Sandwich-Typ aufgebracht. CGF5H9, das viele Spezies erkennt, wurde kolloidisiert mit Gold markiert und als Nachweisantikörper verwendet. CSF1H13, das auf der Testzone beschichtet war, wies das Vorhandensein von Walen und Robben Mbs nach. Muskelproben von Thunfisch, Huhn, Robben, fünf Arten von Landsäugetieren und 15 Arten von Walen wurden in dreifacher Ausfertigung untersucht. Alle Walproben zeigten positive Ergebnisse und alle anderen Proben zeigten negative Ergebnisse.
Einleitung
Historisch gesehen wurde Walfleisch in vielen Teilen der Welt konsumiert und dieser Verzehr setzt sich auch heute noch fort1. Aufgrund des trophischen Gehalts an Walen ist bekannt, dass ihr Fleisch einen hohen Gehalt an Quecksilber und anderen Giftstoffen aufweist2. Daher könnte der Verzehr von Walfleisch nicht nur für Hochrisikogruppen wie Schwangere, sondern auch für die Allgemeinbevölkerung zu einem gesundheitlichen Problem führen3. Darüber hinaus kann es auch während der Verarbeitung und Lagerung zu einer Kontamination von Walfleisch mit zoonotischen oder potenziell zoonotischen Erregern kommen4. Selbst für erfahrene Age....
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Protokoll
Ethik - Statement: Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien durchgeführt und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Nationalen Chiayi University, Zulassung ID: 99022. Die cetacean Probe Verwendung durch den Rat für Landwirtschaft von Taiwan (Research Erlaubnis erlaubt wurde 100M-02.1-C-99).
1. Muskel-Probenvorbereitung und SDS-PAGE
Hinweis: Muskelproben von 23 Arten , darunter 16 Arten von Meeressäugetieren, 5 Arten von Landsäugetieren, Thunfisch und Huhn wurden in dieser Studie (Tabelle 1). Die c....
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Ergebnisse
Monoklonaler Antikörper Merkmale
Wir entwickelten zwei IgG - 1 - mAb (CGF5H9 und CSF1H13) die Anerkennung von zwei synthetischen Peptiden (MKASEDLKKHGNTVLC und AIIHVLHSRHPAEFGC) jeweils von cetacean Mb, und diese wurden verwendet , um ein Sandwich-Typ mit kolloidalem Gold immunochromatographic Teststreifen für die schnelle Detektion von Walen Mb zu konstruieren. 2 zeigt , dass CGF5H9 erkennt Walen und anderen Säugetieren als einzelne gefärbte Band.......
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Diskussion
ein synthetisches Peptid zu Trägerprotein konjugiert unter Verwendung bemerkenswert effektiver im Vergleich zu sein verwandtes Protein. Für ein Sandwich-basierte Technik, weil der mAb unter Verwendung von Epitopen mit bekannten relativen Stellen entwickelt wird, die beiden mAbs in dieser Studie sind nicht geeignet, mit dem jeweils anderen Wechselwirkung mit dem Zielantigen-Epitop zu interferieren. Außerdem kann stärker als die Reaktivität zwischen dem nativen Protein sein , die Reaktivität zwischen dem nativen Protein u.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken den Kollegen von der Taiwan Cetacean Society, der Meeresbiologie und dem Cetacean Research Center der National Cheng Kung University, dem Farglory Ocean Park und dem Animal Disease Diagnostic Center der National Chiayi University für die Probenentnahme. Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss des Landwirtschaftsrates von Taiwan an WCY finanziert (100AS-02.1-FB99).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | Spin-Säule mit Protein G Sepharose |
| IsoStrip Maus Monoklonaler Antikörper Isotypisierungskit | Roche | 11493027001 | Isotypisierungsstreifen, vorbeschichtet mit Subklassen- und Leichtketten-spezifischen Anti-Maus-Ig-Antikörpern |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulosemembran | Whatman | Z613630 | |
| Antikörper Blocker-Lösung | LTK BioLaboratories | Zur Minimierung unspezifischer Bindungswechselwirkungen von unspezifischem IgG in den Proben | |
| BCIP/NBT-Phosphatase-Substrat | KPL | 50-81-00 | |
| Proteindetektor HRP Mikrotiterkit, Anti-Maus | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunplatte MaxiSorp ELISA-Platte | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA Lesegerät | Thermo Elektron Corporation | 51118170 | |
| Kolloid-Gold-Lösung (40 nm) | REGA Biotechnologie AG | 40-50 nm ist geeignet für Immunstreifen | |
| Rinderserumalbumin | Gibco | 15561-020 | |
| Schnelltest immno-strip Drucker | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Nur für die Produktion von Immunstreifen in kleinem Maßstab für Forschungs- und Entwicklungszwecke geeignet |
| Streifenkomponenten (NC-Membranen, Probenpads (#33 Glas, S& S), konjugierte Pads (#16S, S& S) und saugfähigen Einlagen (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund' s adjuvans und unvollständiges Freund' s Adjuvans | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Zur Herstellung von Wasser-in-Öl-Emulsionen der Immunogene |
| Acrylamid, Gelpuffer, Ammoniumpersulfat (APS), Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Protech | Gel Vorbereitung für SDS-PAGE | |
| Coomassie brillantblau R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Proteinfärbung in SDS-PAGE Gelen |
| Laemmli Probenpuffer und β-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Proteinproben vor dem Laden auf SDS-PAGE Gele verdünnen |
Referenzen
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implic....
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Nachdrucke und Genehmigungen
