Methodenartikel

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

DOI:

10.3791/53456

⸱

2. April 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Zusammenfassung

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In vivo Bildgebung bietet einen beispiellosen Zugang zum dynamischen Verhalten zellulärer und subzellulärer Strukturen in ihrem natürlichen Kontext. Die Durchführung solcher bildgebenden Experimente an höheren Wirbeltieren wie Säugetieren erfordert in der Regel einen chirurgischen Zugang zu dem zu untersuchenden System. Die optische Zugänglichkeit von embryonalen und larvalen Zebrafischen ermöglicht es, solche invasiven Eingriffe zu umgehen und die Bildgebung im intakten Organismus zu ermöglichen. In der Tat ist der Zebrafisch heute ein gut etabliertes Modell, um dynamisches zelluläres Verhalten mit Hilfe der In-vivo-Mikroskopie in einer Vielzahl von Entwicklungskontexten zu visualisieren, von der Proliferation über die Migration bis hin zur Differenzierung. Eine neuere Entwicklung ist die zunehmende Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung subzellulärer Ereignisse, einschließlich des mitochondrialen Transports und der Zentrosomendynamik. Die relative Leichtigkeit, mit der diese subzellulären Strukturen durch fluoreszierende Proteine genetisch markiert werden können, und der Einsatz von lichtmikroskopischen Techniken, um sie abzubilden, verwandelt den Zebrafisch in ein In-vivo-Modell der Zellbiologie. Hier beschreiben wir Methoden zur Generierung genetischer Konstrukte, die Organellen fluoreszierend markieren, wobei Mitochondrien und Zentrosomen als spezifische Beispiele hervorgehoben werden. Wir verwenden das bipartite Gal4-UAS-System in mehreren Konfigurationen, um die Expression auf bestimmte Zelltypen zu beschränken und Protokolle zur Erzeugung transient exprimierender und stabiler transgener Fische bereitzustellen. Schließlich geben wir Richtlinien für die Auswahl lichtmikroskopischer Methoden, die am besten für die Abbildung der subzellulären Dynamik geeignet sind.

Einleitung

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In - vivo - Bildgebung bietet eine direkte Visualisierung von zellulären Verhalten in der die meisten physiologischen Kontext. Die Transparenz der Genaktivität, deren schnelle und externe Entwicklung und eine reiche Auswahl an genetischen Werkzeugen , die Fluoreszenz - Markierung ermöglichen , sind alle auf den wachsenden Einsatz von In - vivo - Mikroskopie beigetragen , die Dynamik der wichtigsten Entwicklungsereignisse aufzuklären. Imaging - Studien von Entwicklung des Nervensystems in Zebrabärbling haben zum Beispiel unser Wissen über das Verhalten von neuralen Vorläuferzellen und das Schicksal ihrer Nachkommen einschließlich ihrer späteren Migration erweitert, Differenzierung und Schaltungsintegration 1-8.

Die Bühne ist nun eingestellt, die subzellulären Dynamik zu untersuchen, diese zellulären Verhaltensweisen zugrunde liegen. Tatsächlich sind, Zebrabärbling bereits als Werkzeuge werden für die in vivo Zellbiologie ausgebeutet. Es ist nun möglich , die Mitochondrien zu visualisieren 9-11, Zentrosomen 2,8,12-14, Golgi 15, Die Mikrotubuli 4 und Aktin - Zytoskelett 16, Endosomen 17 und Komponenten des Apikalmembran komplexen 1.18 unter anderem subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo. Bisher viel von dem, was über die Funktion dieser Organellen bekannt ist, kommt von ihrem Verhalten in kultivierten Zellen zu studieren. Während in - vitro - Studien enormen Einblick in die Zellbiologie ergeben haben, Zellen in Kultur repräsentieren nicht vollständig die Komplexität der in vivo - Situation und daher nicht notwendigerweise die Funktion und Dynamik subzellulärer Organellen in vivo widerspiegeln. Zebrabärbling - Embryonen bieten eine tragfähige in vivo alternative subzellulären Dynamik zu untersuchen.

Da Vertebraten besitzen Zebrabärbling viele Organsysteme (beispielsweise neurale Netzhaut), die mit denen in Säugetierspezies gefunden homolog sind. Zusätzlich werden Genaktivität zunehmend eingesetzt, um menschliche Krankheiten zu modellieren 19,20 (Mikrozephalie 21 und Leber 22 kongenitale Amaurose zB) einschließlich und auf die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit zentrosomalen Funktion (zB Parkinson - Krankheit 23, Tauopathies 10,24 und Barth - Syndrom 25). In - vivo - Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene in diesen Fällen wird ein besseres Verständnis der Zellbiologie erlauben diese pathologischen Zustände zugrunde liegen.

Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methoden ist es, eine umfassende Anleitung zur Verfügung zu stellen Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo Lichtmikroskopie zu untersuchen. Der gesamte Arbeitsablauf beteiligt bei der Visualisierung und Verfolgung von subzellulärer Strukturen in vivo beschrieben - von der genetischen Markierung Ansätze zur Erzeugung von transiente Expression und stabile transgene Fische und schließlich mit großem Feld und konfokale Mikroskopie auf Bildgebung. Während jedes dieser procedures von zahlreichen Zebrabärbling Laboratorien verwendet wird, die beschriebenen Protokolle werden optimiert und rationalisiert für die Dynamik subzellulärer Strukturen zu untersuchen. Zwei spezifische Aspekte der Arbeit hier beschriebenen rechtfertigen erwähnt: Erstens, die Verwendung des Gal4-UAS-Expressionssystems in verschiedenen Konfigurationen zu genetisch Etikett Organellen in bestimmten Zelltypen. Zweitens ist ein direkter Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild subzellulärer Strukturen in vivo.

Aktuelle Strategien zur genetisch Label Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrabärbling entweder nutzen verkappte mRNA 1,4,8 oder DNA - basierte Konstrukte , wo Promotorelemente , die Expression von Fusionsproteinen 9,14,15 direkt fahren. In vitro transkribierten RNA gekappt Ergebnisse in schnelle und breite Ausdruck, das ist aber nicht gewebespezifisch. Zusätzlich verringern Expressionsniveaus im Laufe der Zeit als das verkappte RNA verdünnt wird oder abgebaut. Somit ist die Verwendung von RNA-basiertenKonstrukte zu Organell Dynamik in späteren Stadien in der Entwicklung beschränkt ist (in der Regel bis zu 3 Tage nach der Befruchtung) untersuchen.

Diese Einschränkungen können durch die Verwendung von DNA-Konstrukten überwunden werden, wo räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression durch spezifische Promotorelemente bestimmt wird. Wenn DNA - Konstrukte basieren in Kontext der Gal4-UAS - System wesentliche Verbesserungen an Transgen - Expressionsniveaus verwendet werden , werden 26,27 beobachtet. In diesem bipartite Expressionssystem, Zelltyp-spezifische Promotorelemente treiben, die Expression eines Transkriptionsaktivators Gal4, während Reportergenen stromabwärts von der Gal4-Bindungsstromaufwärts Aktivierungssequenz kloniert werden (UAS). Durch UAS Reporter mit entsprechenden Gal4 Treiber kombinieren, können die Expression auf bestimmte Zelltypen beschränkt werden, wodurch die Notwendigkeit umgangen werden jedes Mal zu klonen Reportergene hinter verschiedenen Promotoren eine spezifische Expressionsmuster gewünscht wird. Des Weiteren kann die Expression mehrerer UAS Reportergene seindurch einen einzigen Gal4 Aktivator angetrieben. Das Gal4-UAS-System stellt somit ein vielseitiges und flexibles genetischer Ansatz für subzelluläre Kennzeichnung.

Breitfeld und konfokale Mikroskope sind die Arbeitstiere der meisten Laboratorien. Weitfeldsysteme typischerweise eine Bogenlampe als Lichtquelle verwenden, und das emittierte Licht mit einer empfindlichen Kamera erkennen, die am Ende des Lichtweges angeordnet ist. Diese Bildgebungsverfahren wird in der Regel auf dünne Proben beschränkt, wie Out-of Fokus Licht verschleiert im Fokus befindlichen Informationen in dickeren Proben. Die konfokale Mikroskope unterscheiden sich von Weitfeld - Systemen dadurch , dass sie gebaut werden Signale zu bevorzugen , die von der Fokusebene über diejenigen , die ihren Ursprung außerhalb des Fokus (dh "optischen Schneidens") 28 stammen. Zu erreichen optischen Schneidens wird ein Pinhole im Emissionspfad in einer konjugierten Position zu der Punktlichtquelle angeordnet. Laser werden als Lichtquellen verwendet, und Signale werden mit Photomultipliern (PMTs) nachgewiesen. Praktisch wird ein LaserStrahl über die Probe Punkt-für-Punkt und der Fluoreszenzemission bei jedem Punkt (Pixel) swiped von der PMT detektiert wird.

Hier Bild, das wir die gleichen subzellulärer Strukturen in Genaktivität leben beide mit großem Feld und konfokaler Mikroskopie mit einem direkten Vergleich der beiden Mikroskopie Modalitäten zur Verfügung zu stellen. Die zugrunde liegende Ziel solcher Vergleiche der Bereitstellung ist es, Richtlinien zu bieten für die am besten geeignete Mikroskopietechnik für die spezifische Frage auf der Hand entschieden haben.

Mit Hilfe der beschriebenen Ansätze hier zeigen wir Gal4-UAS basiert die genetische Markierung der Mitochondrien und Zentrosomen. Diese Organellen sind in verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und in Muskelzellen abzubildenden Verwendung Weitfeld und konfokale Mikroskopie die Eignung jedes Bildgebungsmodalität zu demonstrieren. Die hier beschriebenen Verfahren können leicht zur Untersuchung von anderen Organellen und subzellulären Strukturen im lebenden Zebrafischembryo angepasst werden.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften der Regierung von Oberbayern (München, Deutschland) durchgeführt.

1. Labeling Organell und andere subzellulärer Strukturen

HINWEIS: Hier genetische Reporter - Konstrukte , dass fluoreszenz Tag Zentrosomen, Mitochondrien und Zellmembranen beschrieben werden.

  1. Verwenden Sie herkömmliche Klonierungsverfahren 29 - Fusionsproteine ​​zu erzeugen , die fluoreszenz Zentrosomen und Mitochondrien beschriften. Klon der kodierenden Sequenz von Zebrabärbling centrin4 (cetn4) in-frame mit einem fluoreszierenden Protein 2 (FP) , wie beispielsweise Yellow fluorescent protein cetn4-YFP zu erzeugen. Klonieren die mitochondriale Targeting - Sequenz der Untereinheit VIII der Cytochrom - c - Oxidase in-frame mit einer FP wie Cyan fluorescent protein mitoCFP 9-11 zu erzeugen.
  2. Um zu verhindern, die Expression der Fusionsproteine ​​(cetn4-YFP oder mitoCFP) auf bestimmte Zellen des zebrafish Embryo (zB Neuronen oder Muskelzellen) verwenden , um die zweiteiligen Gal4-UAS - Expressionssystem 26,27. Erzeugen Sie zunächst ein UAS-Reporterkonstrukt. Verwenden herkömmliche Verfahren für das Fusionsprotein in einem UAS - Expressionsvektor zu klonieren, stromabwärts von der Gal4-UAS - Bindungskassette (Varianten liegen im Bereich von 1x bis 14x UAS, siehe Diskussion) 26,27,30 und einen Minimalpromotor (E1b basalen Promotor aus dem Karpfen βactin-Gen), und erzeugen UAS: cetn4-YFP und UAS: mitoCFP.
    HINWEIS: UAS Reporter Zur Vorbereitung Konstrukte für stabile transgene Linie Generation zusätzliche Elemente müssen geklont werden (siehe 3 unten)
  3. Um den zellulären Kontext zu visualisieren, in der Zentrosomen oder Mitochondrien markiert sind, erzeugen UAS Reporterkonstrukte, in denen die Zellmembranen von FPs markiert sind. Klon , der die ersten zwanzig Aminosäuren von Zebrabärbling GAP43 (Palmitoylierung Stellen enthält) im Rahmen mit einem FP zum Ziel , dass FP an die Zellmembran (memFP) 31,32.
  4. obtain Treiberkonstrukte oder transgenen Linien in dem Zelltyp - spezifischen Promotor - Elemente treiben die Expression des transkriptionellen Aktivators Gal4-VP16 27, 33 oder Gal4FF KalTA4 30.
  5. Kombinieren der UAS - Reporter mit einem geeigneten Treiber Konstrukt Expressionskonstrukte auf den gewünschten Zelltyp von Interesse zu beschränken (beispielsweise in Neuronen oder Muskelzellen). Dazu Co-injizieren Gal4 Treiber und UAS - Reporter - Konstrukte an der einen Zellstadium der befruchteten Eier (für detaillierte Anweisungen siehe 2 unten) zu erzeugen transient Fisch Ausdruck zu bringen. Alternativ können Sie eine UAS Reporter stabile transgene Linie erzeugen (für detaillierte Anweisungen 3 unten) und überqueren auf einem Gal4 Treiber stabil transgene Linie Nachkommen zu erzeugen beide Transgene tragen.
    HINWEIS: Es ist auch möglich , UAS Reporterkonstrukts / s in befruchtete Eier aus einer Gal4 - Treiber stabilen transgenen Linie oder einer Gal4 - Treiber - Konstrukts in - Dünger einzuspritzened Eier aus einer UAS Reporter stabil transgene Linie.
  6. Um coexprimieren mehrere verschiedene Fusionsproteine ​​mit dem Gal4-UAS - System, verwenden Sie einen Gal4 Treiber und UAS - Reporter / s in einer der folgenden Konfigurationen: A. mehrere separate UAS Reporterkonstrukte (zB UAS: mitoCFP und UAS: memYFP co -injected mit einem Gal4 - Treiber - Konstrukt) 10, B. Multiple UAS - Kassetten auf einem einzelnen Reporter (zB UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Bidirektionale UAS Reporter (zB UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Abbildung 1).

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Abbildung 1. Strategien zur coexprimierender Fusionsproteine ​​die Gal4-UAS - System.
(A) mehrere separate UAS-driven konst: Co-Expression mehrerer Fusionsproteine ​​können unter Verwendung von UAS Reporter Kassetten in verschiedenen Konfigurationen erreicht werdenructs, (B) mehrere UAS - Kassetten auf einem einzigen Konstrukt oder (C) eine bidirektionale UAS - Kassette auf einem einzigen Konstrukt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Generieren Sie transient Fisch Ausdruck

HINWEIS: Das folgende ist eine Anpassung der bisher veröffentlichten Protokolle 34,35. Eine grundlegende Injektion Setup sollte ein Stereomikroskop mit einem Vergrößerungsbereich von bis zu 12-fach, einen Mikromanipulator mit einer Mikropipette Halter und eine Luftdruckquelle umfassen. Bereiten Sie 2,1-2,5 vor der Zeit:

  1. Ei Mikroinjektionskammern, bereiten eine Lösung von 1,5% (w / v) Agarose in Wasser herzustellen. Hinzufügen Agarose Pulver für Wasser und Mikrowellen, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Füllen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit dieser Lösung.
    1. Lassen Sie die Agarose-Lösung zur Kühlung auf ca.oximately 45 o C vor einer Kunststoffmikroinjektionsform (40 mm x 66 mm, mit 6x 50 mm langen Rippen , die 1,5 mm breit, 1 mm tief und im Abstand von 3 mm auseinander) Anordnen auf der Oberfläche des geschmolzenen Agarose, dabei nicht auf einführen Blasen an der Grenzfläche.
    2. Nachdem die Agarose - Sets, bei 4 o CO / N. Entfernen Sie vorsichtig die Form einer Spachtel. Bereiten Sie mehrere Mikroinjektionskammern zu einem Zeitpunkt, bei 4 ° C und verwenden immer wieder über mehrere Wochen.
  2. Verwenden Sie eine Mikropipette Puller Glas Injektionskapillaren mit einem langen Schaft 36 zu erzeugen.
    HINWEIS: Die spezifischen Einstellungen verwendet Injektionskapillaren zu erzeugen sollte empirisch bestimmt werden. Injektions Kapillaren vor der Zeit gezogen werden und vor dem Gebrauch gelagert.
  3. Messen der Konzentration von Plasmid-DNA (Gal4-Treiber und UAS Reporterkonstrukte) für die Mikroinjektion eines Spektrophotometers nach Herstelleranleitung verwendet wird. Messen60, wobei das Verhältnis der Absorption bei 260 nm und 280 nm (A260 / 280). Verdünne die DNA bis zu einer Endkonzentration von 100 ng / ul in Nuclease-freiem Wasser.
    HINWEIS: Ein A260 / 280 - Verhältnis von ~ 1,8 bedeutet reine DNA. Betrachten wir einen kommerziellen Kit (bezogen auf Siliciumdioxid basierende Bindematrix), um die Plasmid-DNA zu reinigen, zur Injektion verwendet werden. Plasmid DNA sollte von hoher Qualität sein Toxizität zu verhindern.
  4. Herstellung von 10 & mgr; l Injektionsmischung durch Kombinieren von DNA (0,5 bis 2,5 ul einer 100 ng / ul Lager für eine Endkonzentration von 5 bis 20 ng / ul), Danieau-Lösung (0,33 & mgr; l 30x Lager), Phenolrot (0,25 & mgr; l, optional) und Nuklease-freies Wasser bis zu einem 10 & mgr; l Gesamtvolumen.
    HINWEIS: Empirisch die Konzentration von DNA bestimmen , die geeigneten Expressions ergibt. GAL4 UAS Fahrer und Reporterplasmide müssen coinjiziert werden. Kein Ausdruck wird folgen, wenn nur der Gal4-Treiber oder UAS Reporterplasmid in Wildtyp befruchteten Eier injiziert wird. Wenn jedoch ter befruchtete Eier sind von einem Gal4 Fahrer dann Injektion eines oder mehrerer UAS Reporter Plasmide genügt. Umgekehrt, wenn in eine UAS reporter Leitung Mikroinjizieren nur der Gal4-Treiber Plasmid muss injiziert werden. Schließlich, während Phenolrot stark Injektionen kann helfen, zu visualisieren, es ist auch eine fluoreszierende Verbindung selbst. Daher könnte Phenol Red Visualisierung FPs verschleiern wenn die Bildgebung vor 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) geplant ist, da es nicht ausreichend Zeit verdünnt werden können.
  5. Am Abend vor Injektionen sind geplant, mehrere Paare (in der Regel 5 bis 10) der männlichen und weiblichen Zebrabärbling für die Zucht eingerichtet. Verwenden Zuchtbecken mit einem Einsatz eines gerasterten Boden und eine herausnehmbare Trennwand mit dem männlichen und weiblichen Fische zu trennen.
    HINWEIS: Männliche und weibliche Zebrabärbling kann in der Regel durch ihre Körperform zu unterscheiden. Männer neigen dazu, schlank zu sein, während Frauen einen ventral vorstehende Bauch zu zeigen neigen. Männer neigen dazu, zusätzlich eine gelblich-rot col habenoring auf ihrem ventralen Bauchbereich.
  6. Unmittelbar vor der DNA-Injektionen, entfernen Sie die Teiler der männlichen und weiblichen zu ermöglichen, sich zu paaren. Etwa 15 bis 30 min nach dem Entfernen Teiler am Boden des Tanks für Eier überprüfen. Übertragen Sie die erwachsenen Fische ein Fischernetz an einen neuen Zuchtbecken mit.
  7. Gießen Sie das Wasser, die neu verlegten befruchtete Eier enthält, aus dem Zuchtbecken in ein Sieb ( zum Beispiel ein Kunststoff Teesieb). Waschen Sie die Eier in das Sieb mit einer Sprayflasche mit Danieau-Lösung verwendet wird. Kehren Sie die Sieb auf eine Petrischale und verwenden Sie eine Sprühflasche mit Danieau Lösung alle Eier zu erholen (in der Regel 50 bis 200 Eier pro Brutpaar von erwachsenen Fischen).
  8. Mit Hilfe einer Micropipette Rück füllen eine zog Injektionskapillare mit der DNA-Injektion-Mix. Montieren Sie die Injektionskapillare in den Halter eines Mikromanipulators und schneiden Sie die Spitze unter der visuellen Kontrolle eines Stereomikroskops, Zange mit einer Mikropipette zu schaffen, die Penetrate das Chorion und Zytoplasma, während in der Lage, ein geeignetes Volumen der DNA zu liefern.
    HINWEIS: Der Grad , bis zu dem die Spitze der Injektions kapillaren getrimmt wird , sollte empirisch bestimmt werden und kann am besten beurteilt werden , wenn Eier injizieren.
  9. Um das Volumen von DNA zur Injektion Bestimmung Entladen eines Tropfens der Injektionslösung in Mineralöl. Messen der Radius (r) des Tropfens eines Kalibrierungsmikrometers und berechnen dessen Volumen (4/3 π r 3). Modulieren des Volumens durch den Einspritzdruck eingestellt und / oder die Dauer der einzelnen Einspritzimpulses.
  10. Mit Hilfe einer Plastikpipette, übertragen alle gesammelten Eier ( in der Regel 50 bis 200, von 2,7 oben) in die Gräben einer Mikroinjektionskammer. Unter der visuellen Kontrolle eines Stereomikroskops, verwenden Zange um die Eier zu orientieren, so dass die Zelle Zytoplasma (transparent) und Dotter (dichte, nicht-transparent) leicht identifiziert werden.
  11. Unter der visuellen Kontrolle eines StereoMikroskop, DNA in das Zytoplasma der befruchteten Eizelle zu injizieren, darauf, dass das injizierte Volumen (1 bis 2 nl) entspricht etwa 10% des Zellvolumens, um sicherzustellen, nehmen.
    HINWEIS: Phenolrot in der DNA - Lösung hilft bei der Visualisierung des Volumens eingespritzt.
  12. die Eier aus den Schützengräben der Spritzgießform Nach der Injektion lösen, indem sie mit einer Sprühflasche enthält Danieau-Lösung gespült wird. Anschließend übertragen Eier in eine frische Petrischale eine Plastiktransferpipette und in einem 28,5 o C Inkubator erhalten.
  13. Pflegen un-injizierten Eier als Kontrolle, um zu bestimmen, ob Injektionen zu hohe Sterblichkeitsraten beitragen, entweder als Ergebnis einer physischen Beschädigung während der Mikropipette Penetration oder der DNA-Mischung aufrechterhalten.
    HINWEIS: Hohe Sterblichkeitsraten folgenden Injektionen könnten aufgrund zahlreicher Faktoren, einschließlich der zu hohen DNA - Konzentration oder Injektionsvolumina und / oder Plasmide mit contaminants. Um die Toxizität von geringer Qualität DNA-Preps, kommerzielle Kits (auf Basis von Silica-basierte Bindematrix) zu verhindern, können verwendet werden.
  14. In regelmäßigen Abständen folgenden Injektionen, verwenden Sie ein Stereomikroskop für unbefruchtete Eier und tote oder ungültiges Embryonen zu screenen und diese zu verwerfen.
    HINWEIS: halten , damit die Eier , die mehrere Stunden bei der eine Zellstadium nach der Befruchtung zu sein scheinen, wie unbefruchtete. Identifizieren Sie ungültiges Embryonen, die durch grobe anatomische Defekte wie ein geschwächtes anterior-posterioren Körperachsen. Amorphous Materials innerhalb eines Chorion legt nahe, dass der Embryo nicht durch Entwicklungsstadien gehen und starb. Um festzustellen , ob Embryonen , die einen normalen Verlauf der Entwicklung mikroinjiziert wurden unterziehen 37 anatomischen Atlanten konsultieren.
  15. Transfer der Embryonen eine Kunststofftransferpipette zu Danieau Lösung verwendet, enthaltend 1x 1-Phenyl-2-thioharnstoff (1xPTU) zwischen 10 und 24 hpf Pigmentbildung zu verhindern. Pflegen Sie die Embryonen in Danieau Lösung containing PTU für die Dauer des Experiments.
    HINWEIS: Zusätzlich zu den Melanophoren, Iridophoren auf der Oberfläche der Haut kann für die Bildgebung problematisch sein. Während PTU nicht hemmt Iridophoren Bildung, existieren Mutantenlinien mit reduzierter Anzahl von Iridophore wie Roy Orbison (roy) und 38 verwendet werden.
  16. Nach Embryonen Luke (in der Regel am zweiten oder dritten Tag nach der Befruchtung, 2 oder 3 dpf), die Chorion zu verwerfen und die Danieau die Lösung, die PTU auszutauschen.
    Hinweis: Diese Schritte sind wichtig , um die Qualität des Embryos Medium und die Lebensfähigkeit der gesunden Embryonen zu gewährleisten.

3. Generieren Stabile transgene Linien

HINWEIS: Stabile transgene Linien effizient erzeugt werden können , die Tol2 Transposon - System. Ein Tol2 Transposon-Vektor das Transgen von Interesse ist Co-Injections zusammen mit mRNA codiert, das Transposaseenzym in befruchten enthältd Eier an der Ein-Zell-Stadium. Transposase - Protein aus der injizierten mRNA abgeleitet katalysiert die Exzision der Transgen - Kassette aus dem Transposon - Vektor und seiner Integration in das Genom 39.

  1. Klonieren das Transgen Reporterkassette (zB UAS: mitoCFP) zwischen Tol2 invertierten terminalen Repeats in einer der Tol2 Vektoren gegenwärtig in der Zebrabärbling - Gemeinschaft verwendet wie 40 beschrieben.
    HINWEIS: Tol2 Vektoren einen selektierbaren Kassette enthält , in dem Promotorelemente FP - Expression in Organsysteme nicht mit dem Bereich von Interesse Antrieb (zB Herz 41 oder Linse 42) sind nützlich für das Screening von UAS reporter transgenen Linien in Abwesenheit von GAL4 - Transaktivierungs .
  2. Verwendung eines kommerziellen Kits (bezogen auf Siliciumdioxid basierende Bindematrix), reinigen die Plasmid DNA für die Injektion verwendet werden. Sicherzustellen, dass die Plasmid-DNA von hoher Qualität ist die Toxizität zu verhindern.
  3. Transkribieren Tol2 Transposase kodierenden mRNA unter Verwendung einesentsprechende Transkriptionsvektor wie PCS-TP 43. Kurz gesagt, linearisieren PCS-TP und eines kommerziellen Kits verwenden, um mit einer Kappe bedeckt mRNA erzeugen und Protokoll des Herstellers folgen. Achten Sie darauf , eine Kontamination mit RNasen zu vermeiden (zB verwenden RNAse-freie Pipettenspitzen und Rohre). Aliquot der RNA, bei einer Konzentration von 100 ng / ul, für den Einmalgebrauch und bei -80 o C
  4. Am Morgen der Injektionen, eine aliquote Menge von Transposase mRNA auf Eis auftauen. Mischen Sie die Transposon-DNA-Vektor (2 ul 100 ng / ul) und Transposase mRNA (2 ul 100 ng / ul) in einem Verhältnis 1: 1, und fügen Sie 6 ul Wasser RNAse-frei, das Gesamtvolumen bringen zu 10 ul.
    HINWEIS: Eine Konzentration von 20 ng / & mgr; l für jede empfohlen , aber die optimale Konzentration sollte empirisch bestimmt werden. Verwenden Sie RNAse-freies Wasser zur Verdünnung. Verwenden Sie Handschuhe, wenn die DNA-RNA-Injektion Mix Handhabung und halten Sie sie auf Eis für den gesamten Zeitraum von Injektionen Abbau des m zu verhindernRNA.
  5. Mit den detaillierten Anweisungen in Abschnitt 2, injizieren , um die DNA-RNA - Injektion Mischung in befruchtete Eier an der Ein-Zell - Stadium. Unter visueller Kontrolle eines Stereomikroskops an der Ein-Zell-Stadium Zytoplasma der Zelle Ziel für die höchsten Raten von Transgene Effizienz. Pflegen Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 ° C , bis sie bereit für die transgene Expression zu screenen.
    HINWEIS: Die PCR kann für die Effizienz des Tol2 Transposase zu überprüfen durchgeführt werden , wie zuvor 44 beschrieben.
  6. Bildschirm Embryonen in einer Petrischale für die Transgenese unter Verwendung der Okulare eines Fluoreszenz Binokular.
    HINWEIS: Verwenden Sie die entsprechenden Filtersätze des Mikroskops FP Expression des selektierbaren Kassette (dh Fluoreszenz im Herzen oder Linse) bei 2 oder 3 dpf zu visualisieren. Identifizieren Sie potenzielle transgenen Embryos durch den Ausdruck (in Herz oder Linse) und heben diese Embryonen bis zum Erwachsenenalter (F 0 -Generation) unter Verwendung von StandardProtokolle 45. Alternativ identifizieren potenzielle transgenen Embryonen , die durch PCR , wie in 46 beschrieben.
  7. Sobald die UAS Reporter F 0 Fische sind 2,5 - 3 Monate alt, überqueren sie (siehe 2.5 für weitere Details) zu nicht-transgenen Fisch Wildtyp - Eier zum Erwerb eines F - 1 Generation zu etablieren. Alternativ überqueren die UAS Reporter F 0 Fisch zu einer Gal4 Fahrer eine F 1 zu etablieren. Im letzteren Fall wird die UAS-driven Transgen direkt in den von dem Quer erhaltenen Embryonen überwacht werden kann.
  8. Verwenden eines Fluoreszenz Präpariermikroskop F 1 Embryonen für die Expression des Transgens oder auswählbare Kassette zu screenen.
    HINWEIS: Wenn die Expression bestätigt wird , dann kann das Transgen gesagt werden Keimbahn übertragen werden. Transgene nicht-Mendelschen an der F 0 Bühne. Die Anzahl der Embryonen, die das Transgen exprimieren, aus einer kleinen Zahl an die überwiegende Mehrheit in den einzelnen clutche variieren kanns. Transposon Integration in verschiedenen F 0 Fische können stark variieren, was zu unterschiedlichen Expressionsmuster. Daher F 1 Fisch aus verschiedenen F 0 Gründer als separate Unterlinien halten. Transposon - Integrationen in F 1 Fische sind stabil und werden auf die nachfolgenden Generationen in einem Mendelschen Art und Weise weitergegeben.
  9. Pflegen Sie jede F 0 Fische in separaten Tanks Transgen Träger neu zu identifizieren.

4. Bereiten Sie Embryonen für Imaging auf einem aufrechten Mikroskop

HINWEIS: Die hier beschriebenen Verfahren wurden für die Bildgebung auf aufrechte Mikroskope mit langen Arbeitsabstand Wasser-Tauchen-Kegel Ziele optimiert.

  1. Verwenden Sie ein Fluoreszenz Binokular Embryonen für die transgene Expression zu screenen.
    HINWEIS: Die Expression eines Reporter UAS Transgen hängt von der spezifischen verwendeten Gal4 Treiber abhängig Linie. Wählen Embryonen für die Bildgebung Experimente basieren auf Wunsch expression Muster.
  2. Übertragen Sie die ausgewählten Embryonen eine Plastikpipette in eine separate Petrischale mit Danieau Puffer mit 1x PTU und 1x Tricaine enthält.
    HINWEIS: Bei der Kennzeichnung spärlich ist (nur wenige Zellen in einem Organsystem) montieren Sie die Embryonen in Agarose (siehe 4,3-4,7 unten) und Bildschirm für die Expression Transgen ein Weitfeldmikroskop mit stark vergrößernden Objektiven (siehe 5.1 unten) verwenden. Tricaine betäubt die Fische und sollten innerhalb von Sekunden wirksam sein. Wenn Fische nicht immobilisiert werden, ist es wahrscheinlich, dass die Tricaine verschlechtert hat. Mögliche Gründe für diese Verschlechterung sind schlechte Lagerung von Tricaine, die lichtempfindliche 47.
  3. in Danieau-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,7% bereiten die Agarose den Fisch zum Einbetten von niedrigschmelzenden Agarose-Pulver aufzulösen. Aliquot (1 ml) und halten in einem Wärmeblock bei 40 ° C bis zur Verwendung.
    HINWEIS: Höhere KonzentratIonen von Agarose (bis 1,5%) können auch einzubetten Fisch verwendet werden.
  4. In 50 ul eines 20x Lager von Tricaine und 20 ul einer 50x Stammlösung von PTU zum 1 ml aliquote Menge von niedrig schmelzenden Agarose und gut mischen, indem Sie die Seite des Rohres tippen. Bringen Sie das Rohr mit dem Wärmeblock. Mit Hilfe einer Plastiktransferpipette, Pipette vorsichtig ein paar (1-10) narkotisiert Embryonen in die Agarose, so wenig Flüssigkeit wie möglich zu übertragen zu vermeiden, die Agarose zu verwässern.
  5. Verwendung einer Kunststoffpipettentransfer alle Embryonen mit einer kleinen Menge von Agarose zu einem Glasboden Petrischale.
  6. Arbeitet relativ schnell, Verwenden einer Pinzette die Embryonen in der gewünschten Ausrichtung zu positionieren, in Abhängigkeit von der Struktur abgebildet werden.
    HINWEIS: Richten Sie Embryonen auf ihrer Seite , wenn die Netzhaut oder Rohon-Beard (RB) sensorischen Neuronen sollten abgebildet werden.
  7. Lassen Sie die Agarose für mindestens 15 Minuten zu verfestigen. In Danieau Puffer 1xPTU und 1xTricaine enthält die Embryonen in agaro eingebettet zu deckense. Die Schale enthält Agarose eingebetteten Embryonen in einem Inkubator bei 28,5 o C bis bereit zu Bild.

5. Imaging zellulärer und subzellulärer Strukturen Weitfeld oder konfokale Mikroskopie mit

HINWEIS: Weitfeldmikroskopie und Punkt-Scanning - konfokale Mikroskopie sind die am häufigsten verwendeten Modalitäten Bild fluoreszenzmarkierten Genaktivität Tabelle 1 fasst die wichtigsten Vor- und Nachteile der beiden Systeme.. Für beide Formen der Mikroskopie, sind Embryonen in Agarose montiert , wie in 4 oben beschrieben, und bei 28,5 o C während des gesamten Abbildungsexperiment gehalten durch eine Heizkammer auf dem Tisch des Mikroskops verwendet wird . Wichtig ist, dass die Schale mit Agarose eingebetteten Embryonen erlaubt 28,5 o C äquilibrieren , bevor Abbildungs ​​beginnt, Temperaturschwankungen Drift in der z-Dimension führen. Bei der Durchführung von Langzeit Bildgebung Experimente (über several Stunden), legen Sie eine Plexiglasabdeckung über der Petrischale Verdampfen des Puffers zu reduzieren.

Großes Feld Point-konfokalen
Kosten Relativ billig Teure (ca.. 5x mehr)
Foto-Bleich Niedrig Hoch. Die Probe wird oberhalb und unterhalb der Brennebene mit Laserlicht belichtet.
Foto-Toxizität Niedrig High (siehe Foto-Bleich oben)
Aufnahmegeschwindigkeit Schnell Langsam
Auflösung in xy Abbe-Gesetz Abbe-Gesetz (kann durch Anwendung verbessert werden 40% ein sehr kleines Pinhole verwendet;. Jedoch indie meisten Einstellungen das hat wenig praktische Anwendung)
Optische Schnitte Arm Ja (kann durch Pinholegröße eingestellt werden)
Gewebepenetration Begrenzt auf Oberflächenstrukturen (zB Rohon-Beard - Zellen oder Muskelfasern) Begrenzt auf <100 mm von der Oberfläche des Embryos

Tabelle 1. Allgemeine Vergleich von Breitfeld und Punkt-Scanning - konfokale Mikroskopie

  1. Weitfeldmikroskopie
    HINWEIS: Hier Richtlinien zur Abbildung Genaktivität unter Verwendung eines aufrechten Weitfeldmikroskop mit Langarbeitsabstand Wassertauchkegel Ziele zur Verfügung gestellt. Das Mikroskop ist mit einer gekühlten CCD-Kamera ausgestattet und Filtersets für die Visualisierung verschiedener Fluorophore montiert auf einem automatisierten Filterrades für die schnelle Erfassung mehrerer Kanäle.Die Bildaufnahme wird durch μManager, einem Open - Source - Mikroskopie - Software - Paket 48 gesteuert. Ein konkretes Beispiel für Mitochondrien in RB sensorischen Neuronen Bebilderung bereitgestellt. RB - Zellen sind genetisch mit Membran gezielt YFP markiert und ihre Mitochondrien sind GFP-markierten (siehe 1.1 oben).
    1. Mount Embryonen auf ihrer Seite in niedrig schmelzenden Agarose , wie in 4 oben beschrieben.
    2. Dann wird die Schale mit montiertem Fisch auf 28,5 o C in einer Heizkammer auf dem Tisch des Mikroskops äquilibrieren vor der Bilderzeugung begonnen wird .
    3. Verwenden Sie eine niedrige Vergrößerung Wasser-Tauchen-Kegel Ziel und schauen Sie durch die Okulare des Mikroskops einen Bereich auf der Oberfläche des Embryos Bild auszuwählen.
      HINWEIS: Wenn die stabile transgene MitoFish Reporter Linie, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, in Verbindung mit einer Treiberleitung verwendet wird, wie HuC: Gal4 dann die meisten RB Neuronen markiert und erscheinen als dichte mesh-Arbeit von Neuriten Dorne auf der Oberfläche des Embryos. Wenn die Mikroinjektion von DNA - Konstrukte verwendet wird spärliche Beschriftung zu erreichen (zB Sensory: Gal4-VP16 mit UAS: mitoCFP und UAS: MA-YFP), Bildschirm Embryonen doppelt markierten Zellen zu identifizieren.
    4. Öffnen Sie die Mikroskop-Software (μManager 1.4) und klicken Sie auf "Illumination '' unter" Konfigurationseinstellungen ", um die richtige Filtersätze für die Wellenlänge von Interesse (YFP oder GFP für das aktuelle Beispiel) definieren. Unter" Kameraeinstellungen "geben Sie die Belichtungszeit erforderlich, um ein geeignetes Bild zu erhalten.
      HINWEIS: Die "Illumination Settings" ist so voreingestellt , durch den Benutzer bei der Installation der Software und geladen wird , wenn μManager öffnen. Wenn die Software nicht konfiguriert ist, das Filterrad zu steuern, manuell das Filterrad in dem Turm in die entsprechende Position zu bewegen.
    5. Wechseln Sie zu einem langen Arbeitsabstand Wassertauchkegel Ziel im Bereich von 40-100x Vergrößerung. WählenDas Ziel, die den höchsten numerischen Apertur (NA) und wird chromatisch korrigiert (Achromat) aufweist.
    6. Klicken Sie auf "Live" das Sichtfeld zu wählen: Bei der RB Neuron, Bild mitochondrialen Transport am Stamm Axon, ausgehend von dem Zellkörper oder im peripheren Laube.
      HINWEIS: Die peripheren Dorne von RB Neuronen in der Schwanzflosse Falte des Embryos eine ideale Gelegenheit bieten ein großes Sichtfeld zu Bild , das flach ist und kann daher mit einem Weitfeldmikroskop auf einem einzigen Rahmen erfasst werden. Es ist daher wichtig, den Embryo möglichst flach auf der Seite zu montieren, so dass der Schwanzflosse Falte ist parallel zu dem Boden der Petrischale.
    7. Nach einem Sichtfeld der Wahl, klicken Sie auf den "rechteckige Auswahl" in der ImageJ Menü eine Region of Interest (ROI) und klicken Sie auf "ROI" im μManager Fenster definieren. Nach den ROI für die Bildgebung der Auswahl, klicken Sie auf "Stop" und "Speichern", um take ein Bild des YFP Kanal die lokale Morphologie der Neuriten / s aufzuzeichnen.
    8. Um das Bild klicken mitochondrialen Transport auf der "Multi-D Acq." Taste. Beachten Sie ein zusätzliches Fenster ( "Mehrdimensionale Acquisition") und wählen Sie die Anzahl der Zeitpunkte sowie das Intervall zwischen den Zeitpunkten in diesem Fenster. Verwenden Sie eine Bildrate von 0,3-1 Hz. Führen Sie die Aufnahmen für mindestens 10 Minuten, so viele Daten-Punkte wie möglich zu sammeln.
    9. In der "Mehrdimensionale Acquisition" Fenster, klicken Sie auf "Kanäle", hinzufügen und die Wellenlänge für die Bildgebung (GFP für Mitochondrien in diesem Beispiel) und die Dauer der Exposition definieren. Halten Sie Belichtungszeiten unter 400 ms für mitochondriale Transport Bildgebung.
    10. Klicken Sie auf die Option "Speichern von Bildern" in der "Mehrdimensionale Acquisition" Fenster, um automatisch die Dateien in einem bestimmten Ordner speichern im "Directory-Root 'skizziert. Klicken Sie auf "Acquire" in der rechten oberen Ecke tim zu startene-Lapse-Imaging.
    11. nachstellen manuell den Fokus während der Zeitrafferaufnahme für jede Drift in der z-Dimension zu kompensieren.
      HINWEIS: diese Parameter mitochondrialen Transport in RB Neuronen verwenden, können so lange wie 4 Stunden abgebildet werden.
  2. Konfokalmikroskopie
    HINWEIS: Hier Richtlinien für die Bildgebung mit einem aufrechten Olympus FV1000 konfokalen Mikroskop und Langarbeitsabstand Wassertauchkegel Ziele zur Verfügung gestellt. Das Mikroskop ist mit mehreren Laserlinien und mehrere Detektoren (konventionelle PMTs und empfindlicher Galliumarsenid-Phosphid-Detektoren) ausgestattet, die für Mehrkanalaufnahmen ermöglichen. Spezifische wird auf Olympus FluoView Software. die Abbildungsparameter hier beschrieben werden, sollten andere konfokale Systeme übertragbar jedoch leicht.
    1. Mount Embryonen in niedrigschmelzenden Agarose in einer Orientierung geeignet für die Organ- / Struktur abgebildet werden, wie in 4 oben beschrieben.
    2. Die Schale wird mit montierter Fisch auf 28,5 ° C in einer Wärmekammer auf der Bühne des Mikroskops äquilibrieren vor der Belichtung beginnt.
    3. Verwenden Sie lange Arbeitsabstand Wasser-Tauchen-Kegel Ziele für die konfokale Mikroskope in einer aufrechten Konfiguration. Wählen Ziele mit möglichst hoher NA die Menge an Fluoreszenzsignalen zu maximieren, die gesammelt werden können, und haben die beste Auflösungsvermögen. Bei der Erfassung der Bilder mehrerer Kanäle wählen chromatisch korrigierten Ziele (Apochromat).
    4. Öffnen Sie die Mikroskop-Software und klicken Sie auf "Trans-Lampe" oder "Epi Lampe" entweder übertragen oder Fluoreszenzlicht zu verwenden, die jeweils die Region von Interesse über die Okulare des Mikroskops zu identifizieren.
    5. Verwenden Sie die Software die folgenden Scan-Parameter einzurichten, um Bildstapel zu erwerben:
      1. In der "Acquisition Setting" Fenster überprüfen, ob das Ziel für die Bildgebung gewählt, um das Ziel übereinstimmt, die auf dem Dropdown-dow erscheintn-Menü der verfügbaren Ziele.
        Hinweis: Dies ist , um sicherzustellen , dass alle vorher berechneten Parameter für ein bestimmtes Ziel (beispielsweise laterale und axiale Auflösung, die Größe der konfokalen Öffnung etc.) halten wahr und zuverlässig eingesetzt werden kann.
      2. Wählen Sie die entsprechenden Laserlinie / s und Anregungs- und Emissions dichroitische Filter zur Bild spezifische fluoreszierende Protein (s). Tun Sie dies, indem Sie auf die "Dye-Liste" in der "Image Acquisition Control" Fenster klicken und wählen Sie den entsprechenden Fluorophors / s. Alternativ klicken Sie auf den "Lichtpfad und Farbstoffe" Taste manuell diese Parameter einzustellen.
        HINWEIS: Wenn das "Dye List" Tastenoption gewählt wird, wählt die Software automatisch die entsprechenden Laserlinien, Anregungs- und Emissions dichroitischen Filter und passt die Größe der konfokalen Öffnung geeignet.
      3. In der "Acquisition Setting" Fenster, stellen Sie den "Zoom" Faktor und "Größe aspect Verhältnis "(dh, 512x512, 1024x1024 etc.) des gescannten Bildes notwendig , um die Pixelgröße zu erhalten , lösen , um am besten die Strukturen abgebildet werden. Stellen Sie die Pixelgröße etwa die Hälfte der theoretischen Auflösung des Objektivs zu sein, wodurch die Stichprobenkriterien folgende Nyquist . Um die Pixelgröße des erfassten Bildes klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Symbol für Informationen ( "i") in der "image Acquisition Control" Fenster bestimmen.
      4. Stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit auf die schnellstmögliche (2 & mgr; s / Pixel) im "Acquisition Setting" Fenster.
      5. In der "Image Acquisition Control" Fenster klicken Sie auf Lungs Kalman Linie noise.A Faktor von 2 bis 3 reicht in der Regel zu reduzieren.
      6. Wählen Sie einen sequentiellen Scan-Modus, wenn Fluorophore Bildgebung mit Spektren überlappen. Um dies zu tun, klicken Sie auf "Sequential" und "Line" in der "Image Acquisition Control" Fenster.
      7. Passen Sie die Leistung der jeweiligen Laserlinie / s (typischerweiseunter 5%). Die spezifischen Werte müssen empirisch bestimmt werden.
      8. Klicken Sie auf "XY Repeat" oder die "Focus x2" oder "Focus x4" Taste kontinuierlich den ausgewählten Bereich zu scannen, während die Detektoreinstellungen für jeden Kanal eingestellt werden. Stellen Sie "HV", "Gain" und "Offset" für jeden Kanal Bilder zu erwerben, die den größten Dynamikbereich von Grauwerten haben.
        HINWEIS: Die spezifischen Werte für diese Einstellungen empirisch bestimmt werden müssen. "HV" stellt die Spannung am Detektor seine Empfindlichkeit zu verändern, "Offset" stellt das Ausgangssignal des Detektors und "Gain" multipliziert das Ausgangssignal des Detektors mit einem konstanten Faktor.
      9. Drücken Sie Strg + H, um die aufgenommenen Bilder über eine Look-Up-Tabelle (HiLo) sichtbar zu machen, die unter tigten identifiziert (blau erscheinen) und über-gesättigten Pixel (erscheinen rot), welche beide sollten generell vermieden werden. Neubewertung der Ausgangsleistung des jeweiligen Laser line / s und die Detektoreinstellungen.
        HINWEIS: Die Verwendung hoher Laserleistung und ein hohes Maß an der "HV" des Detektors wird zu mehr Signal führen. Höhere Laserleistung wird jedoch zu einem erhöhten Bleichen und Phototoxizität führen. Eine Erhöhung der "HV" führt zu einer erhöhten Lärm führen. Daher ist ein Kompromiss gefunden werden muss , wenn Laserleistungseinstellung und "HV" , um Bilder mit akzeptablen Mengen an Rauschen erwerben , während Foto-Schäden zu verhindern (siehe auch Tabelle 1).
      10. Sammeln von Bildern von einem definierten Volumen durch die Konzentration auf die oberen und unteren Grenzen des Bereichs von Interesse. In der "Acquisition Setting" Fenster klicken Sie auf den "End-Set" und "Start Set" Set Tasten der z-Stack-Fenster an den oberen und unteren Grenzen des Volumens abgebildet werden. Wählen Sie eine Schrittweite , die die Hälfte der z-Auflösung für das gegebene Ziel (z. B. wenn z Auflösung von 2 & mgr; m wählen 1 & mgr; m). Um die z-Auflösung des objektiv bestimmen,e Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Symbol für Informationen ( "i") in der "Image Acquisition Control" Fenster.
      11. Legen Sie eine Zeitreihe bis z-Stacks mit einer zeitlichen Frequenz sammeln, die für die Dynamik der subzellulären Struktur abzubildenden geeignet ist. In der "Timescan" Unterfenster geben Sie die Frequenz, bei der z-Stapeln sollte ( "Intervall" ') und die Anzahl der Male die Bilder erworben werden sollen ( "Num") erworben werden.
      12. Klicken Sie auf die "Tiefe" und "Time" Schaltflächen in der "Image Acquisition Control" Fenster, um zu bestätigen, dass ein Z-Stapel und Zeitreihen wird erworben werden. Klicken Sie abschließend auf "XYZT", um zu beginnen Zeitrafferbilder zu erwerben.
      13. Nach Abschluss der Bildaufnahme, beobachten "Series Done" auf der Software-Schnittstelle. Klicken Sie darauf, und speichern Sie die Bilder in "OIB" Format, um die Bilder und Metadaten, die mit ihnen verbunden sind aufzuzeichnen.
        HINWEIS: Bilder auf die erhaltenemit einer Software wie FIJI, einem freien öffentlichen Bereich Bildverarbeitungsprogramm Weitfeldmikroskop und konfokalen Mikroskop visualisiert und analysiert werden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird die Verwendung von Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild Mitochondrien und Zentrosomen in Genaktivität leben direkt verglichen und gegenübergestellt. Je nach Lage der Zellen in dem Organell Dynamik untersucht und die Eigenfrequenz der spezifischen subzellulären Ereignisse zu werden, im allgemeinen entweder Weitfeld oder konfokalen Mikroskopie ist die bessere Wahl. Wir abzubildenden Organellen in RB Neuronen auf der Oberfläche des Embryos und in Netzhautzellen befindet tiefer....

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier zeigen wir die Vielseitigkeit des Gal4-UAS - Expressionssystem zur fluoreszenz tag Mitochondrien Zentrosomen und die Zellmembranen von spezifischen Zelltypen in vivo in Zebrabärbling - Embryonen. Viele fluoreszierende Fusionsproteine ​​, die andere Organellen oder subzellulärer Strukturen beschriften kann in der veröffentlichten Literatur zu finden und kann von dem jeweiligen Labor, kommerziellen Quellen oder nichtkommerziellen Plasmid Hinterlegungsstellen (zB Addgene) erhalten werden. Zu entwerfe...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.E. wird gefördert durch das Graduiertenkolleg 1373 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und die Graduiertenschule der Technischen Universität München (TUM-GS). G.P. wurde gefördert durch die TUM-GS. L.T. wird durch ein EMBO-Stipendium unterstützt (EMBO ALTF 108-2013). Die Arbeiten von D.P. zum Zebrafisch wurden von der DFG im Rahmen des Sonderforschungsbereichs "Molekulare Mechanismen der Neurodegeneration" (SFB 596) gefördert; das Center for Integrated Protein Sciences (München) und das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7/2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 200611 (MEMOSAD). Derzeit ist er Stipendiat der New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller und wurde durch ein Stipendium der Deutschen Akademie der Naturforscher Leopoldina unterstützt. L.G. wird gefördert durch eine Förderung der DFG im Rahmen des SFB 870 "Aufbau und Funktion neuronaler Schaltkreise", Projekt A11.

Wir danken Kristina Wullimann für die Instandhaltung unserer Fischanlage, Yvonne Hufnagel für den technischen Support und Thomas Misgeld für die Kommentare zum Manuskript. Wir danken R. Köster (Technische Universität Braunschweig) für die Bereitstellung des M1-Medusa-Vektors (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP), von dem wir Centrin-YFP kloniert haben, und S.C. Suzuki und T. Yoshimatsu (University of Washington) für die Bereitstellung der 14xUAS:MA-cerulean-Kassette, die wir zur Generierung des Reporterkonstrukts zur Herstellung von CentrinFish verwendet haben. Wir danken weiterhin S.C. Suzuki und T. Yoshimatsu (University of Washington) für die transgene Otx2:Gal4-Linie, A. Sagasti für das Sensory:Gal4-VP16-Konstrukt (UCLA) und M. Nonet (Washington University in St. Louis) für den pCold Heart Tol2-Vektor. Wir danken Bettina Schmid, Alexander Hruscha und Christian Haass (Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen München - DZNE) für ihren Beitrag zur Entwicklung von MitoFish.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose (2-Hydroxyethylagarose)Sigma-AldrichA4018-10Gniedriger Geliertemperatur
EppendorfThermomixer compact
Ca(NO3)2 Calciumnitrathydrat, 99,996% Aldrich202967-50gZur Vorbereitung von 30x Danieau's
CCD-KameraQimagingRetiga Exi Fast 1394
Keramikbeschichtet Dumont #5 PinzetteDumont - Fine Science Tools11252-50#5 Pinzette
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopOlympusFV1000 Fluoview
KulturschalenheizungWarner Instrument CorporationDH-35Heizring
Ethyl-3-aminobenzoat-MethansulfatsalzPharmaQTricaine PharmaQ-25gTricain (Anästhetikum)
Fluoreszenz-PräpariermikroskopLeicaM205 FA
GeneClean KitMP Biomedicals111001200
GlasbodenkulturschalenMatTek CorporationP35G-0-14-C35 mm Petrischale, 14 mm Mikrotiterplatte, Nr. 0 Deckglas
GlasnadelnWorld Precision Instruments Inc. TW100F-4Für Mikroinjektionen
HEPESSigmaH3375-250gZur Herstellung von 30x Danieau's
HochvakuumfettDow Corning DCC000001242 150gSiliziumdioxid-Fett
KCl 99%Sigma-AldrichS7643-5kgZur Herstellung von 30x Danieaus
MgSO4.7H2O     Magnesiumsulfat-Heptahydrat 98+% A.C.S. ReagenzSigma-Aldrich230291-500gZur Herstellung von 30x Danieau's
Microinjector EppendorfFemtoJet
Microloader SpitzenEppendorf9300010070.5-20 ul
MikromanipulatorMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
MikropipettenhalterIntracelP/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 TranskriptionskitAmbionAM1340Zur Transkription von PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5%Sigma-AldrichP9541-1kgZur Vorbereitung von 30x Danieau's
NanophotometerZur Messung der DNA/RNA-Konzentration
NadelabzieherSutter InstrumentP-1000Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W NikonWassertauchkegel-Objektiv
N-Phenylthioharnstoff Grade I, ca. 98%SigmaP7629-10GPTU (verhindert Pigmentierung)
PetrischalenSarstedt AG 82147292 x 16mm 
Kunststoff-Formen Adaptive Science ToolsTU-1Für Mikroinjektionen
Plexiglasabdeckung - mit einem LochSonderanfertigungDas Loch in der Plexiglasabdeckung sollte 3 mm größer sein als der Durchmesser des Wassertauchkegels Objektiv
Teesieb (Kunststoff)Zum Sammeln von Zebrafischeiern
TemperaturreglerWarner Instrument CorporationTC-344BDual Automatic Temperature Controller
TransferpipettenSarstedt AG 86.11713,5 mL Kunststoff-Transferpipetten
UMPlanFI 100x/1.00WOlympusWassertauchkonus-Objektiv
UMPlanFLN 20x/0.50W OlympusWassertauchkegel-Objektiv
WeitfeldmikroskopOlympusBX51WI
PTU (50x Stock)76 mg PTU in 50 ml destilliertem Wasser auflösen
Bei Raumtemperatur kräftig umrühren 
Bei -20 oC in 1 ml Aliquoten lagern
Bei 1x Arbeitslösung
aufbewahren Tricain (20x Stamm)200 mg Tricain in 48 ml destilliertem Wasser auflösen
2 ml 1M Tris-Base (pH9) hinzufügen
Auf pH 7 
Lagerung bei -20 oC in 1 ml Aliquoten
Verwendung bei 1x Arbeitslösung
Danieau's Solution (30x Lager)1.740 mM  NaCl 
21 mM          KCl 
12 mM          MgSO4.7H2O 
18 mM          Ca (NO3)2
150 mM      HEPES-Puffer 
Destilliertes Wasser bis zu 1 L 
Lagern bei 4 oC 
Einsatz bei 0,3x funktionierender Lösung
Typ VII Blockheizer mit

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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