Methodenartikel

Long-Term Katheterisierung der Darmlymphe Trunk und Sammlung von Lymphe in Neonatal Pigs

DOI:

10.3791/53457

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5. März 2016

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1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Department of Surgery, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen ein chirurgisches Verfahren zur Katheterisierung des Darmlymphstamms bei neugeborenen Schweinen vor, um große Mengen an Fettstoffwechselkomponenten aus efferenter Lymphe zu gewinnen.

Zusammenfassung

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Die Katheterisierung des intestinalen Lymphstamms bei neugeborenen Schweinen ist eine Technik, die die langfristige Entnahme großer Mengen an intestinaler (zentraler) efferenter Lymphe ermöglicht. Wichtig ist, dass die Entnahme von zentraler Lymphe aus dem Darm es den Forschern ermöglicht, sowohl die Mechanismen und Lipidkonstitutionen zu untersuchen, die mit dem Fettstoffwechsel, Darmentzündungen und Krebsmetastasen verbunden sind, als auch Zellen, die an der Immunfunktion und Immunüberwachung beteiligt sind. Ein ventraler Mittellinien-Operationsansatz ermöglicht eine hervorragende chirurgische Exposition des kranialen Abdomens und einen relativ einfachen Zugang zum intestinalen Lymphstammgefäß, das in der Nähe der Bauchspeicheldrüse und dem rechten ventralen Segment der Pfortader unterhalb des viszeralen Aspekts des rechten Leberlappens liegt. Das Gefäß wird sorgfältig präpariert und von der umgebenden Faszie gelöst und dann mit Nähten erweitert, um das Einführen und anschließende Befestigen des Katheters in das Gefäß zu ermöglichen. Der Katheter wird exteriorisiert und über einen Zeitraum von 7 Tagen wird etwa 1 l/24 h Lymphe entnommen. Während diese Technik die Entnahme großer Mengen zentraler Lymphe über einen längeren Zeitraum ermöglicht, hängt der Erfolg von einer sorgfältigen chirurgischen Dissektion, der Handhabung des Gewebes und der genauen Beachtung der richtigen Operationstechnik ab. Dies ist besonders wichtig bei Operationen bei Jungtieren, da die Lymphgefäße leicht reißen können, was möglicherweise zu chirurgischen und experimentellen Misserfolgen führen kann. Das Video zeigt eine hervorragende Operationstechnik zur Entnahme von Darmlymphe.

Einleitung

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Das lymphatische System ist ein wenig erforschten Gebiet der Physiologie. Präklinische Modelle von Lymph - Katheterisierung treten bei verschiedenen Tierarten 1-8 und werden von der pharmazeutischen Industrie und Forschungseinrichtungen verwendet , um Mechanismen der Lipid beteiligt untersuchen 8-12 und Arzneimittelmetabolismus 13-15, Krebsmetastasen 16 mit experimentellen Behandlung 17 und Immunfunktion 18 -26. Diese Studie untersucht die Verwendung von Darmlymphe Stamm Katheterisierung in einem Hausschwein Modellkomponenten von Lipoproteinstoffwechsel zu messen. Lipoprotein-Metabolismus in der Produktion und Sekretion von Chylomikronen, sowie Änderungen in assoziierten Lipiden und Gesamtprotein beteiligt. Dies sind wichtige Überlegungen gibt es große Unterschiede in den Lipidstoffwechsel zwischen häufig verwendeten Tiermodellen und Menschen und als solche Schweinemodelle unter Verwendung von Darmlymphe sammeln konnten vergleichbare Informationen zur Verfügung stellen für die Untersuchung Lipid michwechsel in Menschen 27-31.

Einen Schädelschulteransatz (dh Ductus Katheterisierung) 5, einen seitlichen oberen Flanke Ansatz 32-34 und einen ventralen Mittellinie oder para Ansatz 22,35: Mehrere chirurgische Techniken , um die Darmlymphe in großen Tierarten zu sammeln verwendet. Dieses Video beschreibt ausführlich den chirurgischen Eingriff bei Schweinen einen ventralen Mittellinie chirurgischen Ansatz für die Katheterisierung der Darmlymphe-Trunk. Sorgfältige chirurgische Technik ermöglicht diese Methode der lymphatischen Katheterisierung große Mengen von Lymphe und seiner Bestandteile über längere Zeiträume zu sammeln.

Diese Technik eröffnet eine Vielzahl von Anwendungen auf vielen Disziplinen verschiedene physiologische Funktionen untersuchen. Mögliche Anwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den ganzen Körper Lipoprotein und den Fettstoffwechsel, Immunüberwachung, Tumorentstehung und Metastasierung, Darmfunktion und die Entw begrenztent und Progression von Darmentzündungserkrankungen.

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Protokoll

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Alle Verfahren an Versuchstieren in beschrieben sowohl die Video- und Manuskripts wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und anschließend die von der Canadian Council of Animal Care Richtlinien.

1. Chirurgische Anästhesie und OP-Vorbereitung der Neugeborenen-Schweine

  1. In einem separaten Vorraum, premedicate 25 kg Schweine in der Nähe der Basis des Halses mit einer intramuskulären Beruhigungsmittel-Anästhetika Cocktail mit: Azaperon (0,3 mg / kg), Ketamin-Hydrochlorid (10 mg / kg), Dexmedetomidin (15 ug / kg).
    Hinweis: In Buprenorphin (0,005 bis 0,02 mg / kg) in der Pre-Anästhetika Cocktail für eine verbesserte intraoperative Schmerzkontrolle.
  2. Anesthetize die Schweine mit inhalativen Isofluran Inhalationsgas (4-5% Isofluran in 500 ml-1000 ml / min O 2) eine Gesichtsmaske. Visualisieren Sie die Stimmbänder ein veterinär laryngeal Umfang mit (17-25 cm langen, geraden Klinge) und gelten topische 10% Lidocain Spay zum StimmSchnüre. Lassen Sie den Lidocain-Spray die Stimmbänder 30-60 sec vor der Intubation zu kontaktieren die Möglichkeit der Stimmbandkrampf und Obstruktion der Atemwege zu reduzieren.
  3. Intubate die Schweine durch einen Endotrachealtubus mit Manschette vorbei (5,0-7,0 mm Innendurchmesser (ID)) zwischen den Stimmbändern und Aufrechterhaltung der Narkose mit Isofluran - Gas (0,5-2,0% Isofluran bei 1.000-2.000 ml / min O 2) mit einem geschlossenen Schaltung Rückatmungsnarkosesystem in der gesamten Operation. Beurteilen Sie das Niveau der Anästhesie durch Kiefer Ton, und beide Pedal und der Augenlidreflexantworten. Abgelaufene Narkosegas wird ausgespült und außerhalb des Operationssaals entlüftet.
  4. Reinigen der Außenfläche des Ohres mit 2,0% Chlorhexidin chirurgischen Scheuerlösung durch eine 70% Isopropylalkohol gespült. Mit einem 20 G intravenösen Katheter, katheterisieren eine Ohrvene intravenöse Flüssigkeiten zu liefern (Ringer-Laktat-Lösung; 5-10 ml / kg / h) während der Operation. Sicherung ein Pulsoximeter an die Schleimhautoberfläche der Zunge mit medische Bandherzfrequenz und die Sättigung des peripheren Blutsauerstoffsättigung (SpO 2) zu überwachen.
  5. Setzen Sie den narkotisierten Schwein in einer dorsalen liegenden Position und rasieren die ventrale Abdomen ab Mitte der Thorax kaudal ventral des Schambeins. Reinigen Sie diesen Bereich mit zwei 2,0% Chlorhexidin OP-Bekleidungen und steriles Wasser wäscht abwechseln.
  6. Übertragen Sie die narkotisierten Schwein auf den OP-Bereich und wenden Sie die letzte chirurgische scheuern von 70% Isopropylalkohol spülen, trocknen lassen und dann drapieren das Tier.
  7. Legen Sie eine rektale Temperatursonde ca. 2-4 cm in das Rektum Körpertemperatur zu überwachen. Legen Sie die Schweine auf einem Wasserkreislauf Heizkissen auf normale Körpertemperatur (38-40 ° C) während eines chirurgischen Verfahrens aufrechtzuerhalten.
  8. Drapieren Sie das Schwein mit vier Handtücher drapiert in einer darüber liegenden Quadranten Muster um den Bauch gelegt. Legen Sie die erste drapieren über xiphisternum, die zweite drapieren entlang lateralen Seite des Bauches etwa 5 cm lateral der Bauchmittellinie. Platzieren des dritten Abdecktuch über das Ileum crest des Beckens und der vierten Abdecktuch, wie der zweite Abdecktuch (obwohl auf der gegenüberliegenden Seite) entlang der lateralen Seite des Abdomens angeordnet ist, etwa 5 cm an der Bauchmittellinie lateral.
  9. Platzieren Sie einen großen Tisch drapieren, mit einem Schlitz-Öffnung für den Zugang zu der Operationsstelle, über die zugrunde liegenden Handtuch drapiert und decken das Schwein und das gesamte OP-Tisch. Der letzte Vorhang ist ein Einweg-Steri-Drape über den großen Tisch drapieren gelegt.

2. Bauchchirurgie und Katheterisierung der intestinalen lymphatischen Trunk

  1. Machen Sie eine 20 cm Hautschnitt mit einem Skalpell die zugrunde liegenden Bauchmuskeln zu belichten. Inzision der Bauchmuskelschichten mit monopolar Elektrokoagulation (20 Watt Einstellung), um das Peritoneum parietale zu belichten. Öffnen Sie ein 20 cm lineares Segment Peritoneum parietale mit Metzenbaum Schere, um die Bauchorgane und Lymphgefäße zuzugreifen.
  2. Stellen Sie einen Retraktor an der Schädel Aspekt der chirurgischen Einschnitt in die Bauchhöhle für die Dauer der Operation offen zu halten.
  3. Benetzen alle Gewebe mit warmem (37 ° C) sterile Kochsalzlösung für das gesamte chirurgische Verfahren. Heben Sie vorsichtig ein großes Segment des Darms einschließlich des Dickdarms, Blinddarm, Ileum und Jejunum aus der Bauchhöhle und exteriorisieren es an der linken Flanke des Schweins den Oberbauch, Leber und Lymphgefäße zuzugreifen. Sichern Sie den exteriorisiert Darm in Position mit zusätzlichen Handtuch drapiert eine Schlinge zu bilden, vorsichtig den Darm zu unterstützen.
  4. Suchen Sie das Lymphgefäßsystem, legt es etwa 4 cm kranial-medial des rechten Nierenvene, 6 cm kaudal-medial- ventralen der Kava ​​- Vorarbeiter und unterhalb des viszeralen Aspekt der rechten Leberlappen in der Nähe der Bauchspeicheldrüse 22,36,37. Identifizieren Sie die Lymphgefäße als durchscheinend Struktur nebeneinander auf der rechten ventralen Segment der Pfortader 36,37.
  5. Trennen Sie das lymphatische vessel aus den umliegenden Faszie durch sanft das beiliegende Gewebe mit Q-Tip Applikatoren Hänselei weg. Sobald die seitlichen Aspekte des Schiffes aus dem umgebenden Gewebe getrennt sind, erstellen Sie einen "Tunnel" Öffnung unterhalb des Behälters mit feinen stumpfen Pinzette gekippt.
  6. Pass drei 2-0 Seidenfäden unterhalb der Lymphgefäße mit einer feinen Pinzette. Ligieren der kaudalste Naht zuerst zu verschließen, aufzuweiten und das Gefäß mit Lymphe füllen. verlassen gezielt die Enden dieses Fadens relativ lange (4 cm), um den Katheter an dem Lymphgefäß zu sichern. Platzieren beiden anderen Fäden 1,0 cm voneinander getrennt und sind ungefähr 1,0-1,5 cm kranial der gesicherten caudal Naht. Lassen Sie diese zwei Nähte mit einem "einzigen lose Ligatur tie" für eine schnellere Sicherung des Katheters in das Gefäß zu ermöglichen.
    Hinweis: Das Segment des Lymphgefäß die sich zwischen der am weitesten kaudal Ligieren Naht und Mittelnaht (der beiden Schädelnähte) die Stelle zur Katheterisierung ist. In Bezug suture Material kann 2-0 Polyglactin Naht für 2-0 Seidenfäden ersetzen, falls erforderlich.
  7. Schneiden Sie ein kleines Loch in das Gefäß mit Iris Schere und das Gefäß mit feinen stumpfen Pinzette aufzuweiten. Legen Sie ca. 1,0-1,5 cm spezieller Katheterschlauch (4,06 Außendurchmesser (OD) X 2,31 mm ID) mit einem abgeschrägten Ende in das Gefäß und binden die beiden Schädelnähte, den Katheter an Ort und Stelle zu sichern. Verwenden Sie die langen Fadenenden der Schwanz Naht um den Katheter in das Gefäß zu sichern.
  8. Waschen Sie die exteriorisiert Darm mit reichlich warmen Kochsalzlösung und vorsichtig in die Bauchhöhle zurückkehren korrekte anatomische Positionierung des Darms zu gewährleisten.
  9. Exteriorize den Katheter an der linken Mitte Flanke (5-10 cm ventral von der Hungergrube). Machen Sie einen Hautschnitt mit einem Skalpell und passieren einen Trokar aus der Bauchhöhle an der Hautoberfläche eine Öffnung für den Exteriorisation des Katheters zu schaffen. Verwenden Sie eine große Kelly Zange den Katheter aus der Bauch cav zu exteriorisierenkeit durch den Trokar Öffnung.
  10. Schließen Sie das Peritoneum parietale mit einem einfachen fortlaufenden Naht Muster von 2-0 Polyglactin Naht mit einem runden (verjüngte) Nadel. Schließen Sie die Bauchmuskelschichten mit einem einfachen Knopfnaht Muster mit einer 2-0 Polyglactin Naht auf einer runden Nadel.
  11. Schließen Sie die Haut in einem subkutikuläre Muster mit 2-0 Polyglactin Naht auf einem Schneide Nadel. Sichern Sie den exteriorisierten Katheter an der Haut mit einer Tabaksbeutelnaht Muster und einer 2-0 Nylonnaht auf einem Schneide Nadel.
  12. Legen Sie eine spezielle Jacke auf dem Schwein, während immer noch betäubt seine Platzierung zu erleichtern und zur Verringerung der Belastung des Schweins während der Genesung.

3. Post-chirurgische Wiederherstellung und Lymph-Sammlung

  1. Etwa 10 Minuten vor der Beendigung der Inhalationsanästhesie, verabreichen bupenorphine (0,1 mg / kg) intramuskulär sofort nach der Operation Analgesie zu liefern. Weiterhin bupenorphine (0,1 mg / kg) alle 12 h für 24-48 Stunden zu haltenpostoperative Analgesie.
  2. Überwachen Sie die Schweine, die für postoperative Komplikationen alle 8-12 Stunden für einen Zeitraum von 7 Tagen.
  3. Sammeln Sie die Lymphe in 500 ml-Polypropylen-Waschflaschen, beschichtet mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), und mit Antibiotika ergänzt; Penicillin (6.000 IE), Streptomycin (6 mg) und Amphotericin B (3 mg) alle 12 Stunden für einen Zeitraum von 7 Tagen.

4. Quantifizierung von Lipoprotein ApoB48, Triglyceride, Cholesterin und Gesamtprotein aus Lymph Gesammelte

  1. Zentrifugieren Sie die Lymphe Probe bei 1800 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und es für die Quantifizierung von Triglycerid, Cholesterin und Gesamtprotein.
  2. Teilen Sie den Überstand in drei Proben: eine unverdünnte Probe, eine Probe 1:20 verdünnt destilliertem Wasser und eine letzte Probe 1: 100 verdünnt mit destilliertem Wasser.
  3. Verwenden Sie den unverdünnten Überstand Cholesterinspiegel zu messen, mit einem im Handel erhältlichen Kits.
  4. Verwenden Sie den 01.20 und 01.100 verdünnten Proben jeweils Triglycerid- und Gesamtproteinspiegel mit einem handelsüblichen Kit und dem Bicinchoninsäure-Gesamtprotein-Assay zu messen.

5. Quantifizierung von Lipoprotein ApoB48, Collected von Lymph 38

  1. Bestimmen Sie die Konzentration von Lipoprotein ApoB48 mit einer angepassten Immun Western Blotting Verfahren 38. Separate Gesamt Lymphe mit 3-8% Tris-Acetat- Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
  2. Übertragung der aufgetrennten Proteine ​​auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (0,45 um) und inkubieren sie mit einem polyklonalen Ziegen-Antikörper gegen ApoB (1: 4000), dann binden sie mit einem anti-Ziege sekundärem Antikörper.
  3. Quantifizieren der Lipoprotein ApoB48 mit Chemilumineszenz einen linearen densitometrische Vergleich mit gereinigtem Nagetier ApoB48 Protein-Standard.

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Ergebnisse

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Lymphatische Katheterisierung der intestinalen lymphatischen Stamm der Neugeborenen-Schweine ermöglicht Sammlung von etwa 1 l / 24 h zentrale Lymphe über einen Zeitraum von 7 Tagen. Die Lymphe in diesen Experimenten gesammelt enthaltenen Komponenten des Fettstoffwechsels, nämlich Gesamt Lymphe Protein, Lipoprotein ApoB48, Triglyceride, Gesamtprotein und Cholesterin. Tabelle 1 Highlights repräsentative Mengen dieser Lipidkomponenten aus gepoolten Lymphe Proben von drei Schweinen. Bemerken...

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Diskussion

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Darmlymphe Sammeln ist eine ausgezeichnete Methode Mechanismen der Lipid beteiligt zu untersuchen , 8-12 und 13-15 Droge Stoffwechsel, Krebsmetastasen 16,17, Zellhandel und Immunfunktion 18-26, in verschiedenen experimentellen Tiermodellen. Tatsächlich hat die Fähigkeit , große Mengen zu ernten entweder peripher (zuführenden) und Zentral (abführenden und großen Kofferraum Gefäße) Lymphe über einen längeren Zeitraum war besonders wichtig für zeitliche Veränderungen zu verstehen...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung der Alberta Livestock and Meat Agency und den Natural Science and Research Council Discovery Grant an S. D. Proctor unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Miller Laryngoskop KlingeWelch Allyn68044182 mm Länge
Surgivet Berater: VitalparametermonitorSurgivetV9203
Rektaler TemperaturfühlerSurgivetV3417
Monopolarer Elektrochirurgie-GeneratorValley Lab
Metzenbaum SchereFine Science14518-18
Tuffier-RetraktorStevens162-11-676
Moskito-ZangeStevens162-7-10
Kelly-Pinzette-gebogen (14cm)Stevens162-7-38
Allis GewebezangeStevens162-7-38
Pinzette Verbandöse (10.2cm)Stevens162-18-780
Zange Verband-Adison (12.1cm)Stevens162-17-2510
NadeltreiberStevens162-V98-42
IrisschereFine science14058-11
UmwälzwasserpumpeJorvetJ-783X
Maxitherm-VinyldeckeJorvetJ-784C
Q-Tip-ApplikatorenFisher Scientific22-037-960
Katheterisierung  Rohre (4,06 OD x 2,31 ID)Braintree Scientific Inc.MRE-160Mikro-Renethan-Implantationsschlauch
2-0 SeidennahtEthiconLA556
2-0 PolyglactinNaht EthiconJ443H2-0 Vicryl
GroßtierjackeLomir Biomedical Inc.SSJ2YC
Polypropylen-WaschflaschenFisher Scientific03-409-22C500 ml
Penicillin-StreptomycinSigma AldrichD4333
EDTASigma Aldrich60-00-4
Amphotericin BSigma AldrichA2411
AzaperonElanco Animal HealthStresnil
DexmedetomidinhydrochloridZoetis6295Dexdomitor
IsofluranAbbott Tier  Gesundheit05260-5IsoFlo
KetaminhydrochloridZoetis2626Ketaset
Bupenorphin HydrochloridChampion Alstoe TiergesundheitDIN:02347510
6 mm EndotrachealtubusJorvetJ-165d
10% Lidocain SprayAstraZenecaDIN:02003767
4 % Chlorhexidin OP-PeelingPartnar Animal HealthPCH-011Verdünnt: 2,0 % ige Lösung
3M Chirurgisches Tuch3M Health Care1040
SDS-SeitengelInvitrogenEA0375BOX3-8 % Trisacetat
Polyvinylidenfluorid-MembranMilliporeIPVH000100,45 μ m Porengröße
ApoB Antikörper EMD MilliporeAB7421:4000 Verdünnung
Esel Anti-Ziegen IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologieSc-2304
ECL Prime Western Blotting ReagenzGE Healthcare LifeSciencesRPN2232     
Triglycerid-KitWako Pure Chemicals998-40391/994-40491
Gesamtcholesterin-KitWako Pure Chemicals439-17501
Gesamtprotein  Durchbohren 23225Bicinchoninsäure-Assay

Referenzen

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