Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

Zusammenfassung

Implantation von autologen und allogenen Knochentransplantaten bilden akzeptiert Ansätze zur Hauptgesichtsschädelknochenverlust zu behandeln. Doch die Wirkung der Transplantatzusammensetzung auf das Zusammenspiel zwischen den Neovaskularisation, Zelldifferenzierung und Knochenbildung, ist unklar. Wir präsentieren eine multimodale Bildgebungsprotokoll zum Ziel, die Angiogenese-Osteogenese Interdependenz im Transplantat Nähe aufzuklären.

Zusammenfassung

Ein wesentlicher Parameter für den Erfolg einer Knochentransplantation Verfahren ist Vaskularisierung der Umgebung des Transplantats. Wir vermuten, dass die Implantation eines Knochenautotransplantat würde größere Knochenregeneration durch reichliche Bildung von Blutgefäßen zu induzieren. Um die Wirkung des Implantats in Bezug auf Neovaskularisation an der Defektstelle zu untersuchen, einem Mikrocomputertomographie (μCT) Ansatz neu bildenden Blutgefäßen zu charakterisieren, die eine systemische Perfusion des Tieres mit einem polymerisierenden Kontrastmittel beinhaltet entwickelten wir. Diese Methode ermöglicht detaillierte Gefäßanalyse eines Organs in seiner Gesamtheit. Zusätzlich wurde die Durchblutung mit Fluoreszenz-Imaging (FLI) von durch Blut übertragene Fluoreszenzmittel beurteilt. Knochenbildung wurde von FLI quantifiziert unter Verwendung einer Hydroxyapatit-bezogene Sonde und μCT Analyse. Stammzellrekrutierung durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von transgenen Mäusen, die Luciferase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Osteocalcin überwacht.Hier beschreiben und demonstrieren die Herstellung des Allotransplantats Schädeldefekt Operation μCT Scanprotokolle für die Neovaskularisation Studie und Knochenbildungsanalyse (einschließlich der in vivo-Perfusion von Kontrastmittel) und Protokoll für die Datenanalyse.

Die hochauflösende 3D-Analyse der Vaskulatur, einen signifikant höheren Angiogenese bei Tieren mit implantierten Transplantaten, insbesondere im Hinblick auf die Bildung Arteriole. Dementsprechend war die Durchblutung in der Autograftgruppe signifikant höher nach ^dem 7. Tag nach der Operation. Wir beobachteten, überlegene Knochenmineralisierung und gemessen wird, größer Knochenbildung bei Tieren, die Autotransplantate erhalten. Autograft-Implantation induzierten ansässigen Stammzellrekrutierung, um das Transplantat-Wirt-Knochennaht, wobei die Zellen in knochenbildenden Zellen zwischen dem 7. ^{und 10.} postoperativen Tag differenziert. Dieses Ergebnis bedeutet, dass erhöhte Knochenbildung zugerechnet werden kanndas erweiterte Gefäß Fütterung, die Autograft-Implantation charakterisiert. Die Methoden dargestellt kann als optimales Werkzeug, um die Knochenregeneration in Bezug auf die dicht begrenzt Knochenbildung und Neovaskularisation studieren zu dienen.

Einleitung

Kraniofazialen Knochenschwund aufgrund des Traumas, Tumorresektion decompressive Kraniotomie und Geburtsfehler selten heilt von selbst und stellt eine klare ungedeckten klinischen Bedarf. Autologen Knochentransplantaten und allogenen Knochentransplantate werden in großem Umfang verwendet werden, um diese Bedingungen zu ¹ zu behandeln.

Es ist weithin anerkannt, dass die Osteogenese ist eng mit Angiogenese ^2,3 gekoppelt. Somit sollte die gesamte Studie einer vorgeschlagenen Therapie zur Knochenregeneration eine umfassende Untersuchung des Gefäßbaumes bilden über die gesamte Defektstelle zu schließen. Es gibt mehrere Methoden, um die Vaskularisierung verfügbar in Forschungsmodelle zu charakterisieren. Das Gefäßbaum kann durch eine histologische Analyse untersucht werden. Da Histologie beruht auf Schnittgewebe, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass das sich ergebende Bild wird verzerrt. Um dieses Problem anzugehen, kann Intravitalmikroskopie für Bild in intakten Blutgefäße ⁴ durchgeführt werden; Jedoch ist dieses Verfahrenauf ein Ebenentechnik beschränkt. μCT Abtastung von Proben aus einem Tier mit Kontrastmittel durchströmt erhalten ermöglicht 3D-Bildgebung des Gefäßnetz, die die Regeneration Website ^5-Feeds. Dieser Ansatz ermöglicht eine sehr detaillierte Demonstration des Gefäßsystems eines Organs als Ganzes, sowie eine sorgfältige Analyse der Blutgefäßverteilung. Darüber hinaus ermöglicht die μCT Unterscheidung zwischen abwechslungsreichen Durchmesser der Blutgefäße, die die verschiedenen Untertypen von Blutgefäßen zu charakterisieren.

Wir vermuten, dass die Implantation einer Schädelautograft größer Neovaskularisation als Implantation eines Allograft zu induzieren, und diese erhöhte Gefäßneubildung führen wird, die wiederum zu einer verbesserten Knochen formation.To diese Hypothese beschäftigten wir eine Vielzahl von Techniken zu verfolgen. Wir untersuchten Mustern des neugebildeten Gefäßbaum durch Ausführen einer μCT basierte Analyse. Wir messen die Durchblutung mit Hilfe eines Blutpool Fluoreszenzsonde. Als nächstes haben wir Ärschesed Knochengewebe Mineralisierung von FLI einer Hydroxyapatit-gerichteten Sonde und μCT Analyse. Schließlich überwacht wir Stammzellrekrutierung und Differenzierung, die Durchführung BLI in transgenen Mäusen, in denen Luciferase in Osteocalcin-positiven Zellen exprimiert.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Hebräischen Universität in Jerusalem, Israel (Antrag Nr MD-12-13524-4), ein AAALAC genehmigt Möglichkeiten und durch die Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Antrag Nr 3770). Die Tiere wurden in die strikte Einhaltung von NIH-Richtlinien behandelt.

1. Herstellung von Knochen Allografts

1. Euthanize 7- bis 8 Wochen alte Balb / C-Mäuse, oder keine Belastung vom Empfänger unter Verwendung der Standardmethode von _CO 2 Inhalation oder intraperitoneale Injektion von 50 & mgr; l Phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Bestätigen Sie die Abwesenheit von einem Herzschlag und führen Genickbruch. Alternativ ernten die Allotransplantate von Schlachtkörpern in -20 ° C gehalten und aufgetaut vor der Ernte wurden.
2. Rasieren Sie die Schädelregion mit einer Haarschneidemaschine, ihre Anwendung gegen die Haarwuchsrichtung. Desinfizieren Sie die Karkasse Kopf durch die Anwendung 70% isopropanol. Schneiden Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell Nr 11 und entfernen Sie die Knochenhaut.
3. Mit Hilfe eines Dentalbohrer und eine 4,5-mm-Innendurchmesser trephine, lösen eine kreisförmige Fragment der Schädelknochen. Übertragen Sie das Knochenfragment an ein 100-mm-Kunststoffschale mit steriler Kochsalzlösung. An diesem Punkt zu beachten Blut und Weichgewebe an das Knochenfragment (1A) befestigt ist. Erhalten Knochenfragmente auf diese Weise von 22 Spendern.
4. Halten Sie eine Knochenfragment in einer Zeit mit gebogenen Pinzette. Tupfer gründlich mit Wattestäbchen und entfernen Sie das Hirngewebe, Weichgewebe und Blut (1B). Nicht aufgeKnochenChips, die das Transplantat mit einer feinen Schere verbunden bleiben, so dass das Transplantat eine perfekte runde Form haben sanft geschnitten.
5. Tauchen jedem Transplantat einmal in einer 15-ml-Röhrchen, das 70% Ethanol und zweimal in 15 ml Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um das Ethanol zu waschen.
6. Frieren Sie die Allotransplantaten in einem -80 ° C Kühlschrank in Kryoröhrchen beimindestens 1 Woche. Zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die allogene Transplantate transparent (1C) angezeigt.

2. Schädeldachdefektchirurgie

1. Für Empfänger verwenden transgenen Mäusen, die Luciferase unter der Kontrolle des Osteocalcinpromotor ⁶ auszudrücken.
2. Sterilisieren Sie die Spitzen der chirurgische Instrumente unter Verwendung eines Glasperlen Heizung für 30 Sek. Bringen Sie die Werkzeuge, um ein Glas mit 70% Isopropanol, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie sterile Handschuhe.
3. Betäuben einen 7- bis 8 Wochen alten weiblichen Maus durch intraperitoneale Injektion einer ketamine- Medetomidin Mischung (75 mg / kg und 1 mg / kg). Drücken Sie den Tierische Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief anästhesiert. Lassen Sie nicht ein Tier unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten.
4. Rasieren Schädelbereich mit einer Haarschneidemaschine durch Anlegen gegen die Richtung des Haarwachstums. Bewerben Haarentfernungscreme, alle Pelzreste zu entfernen und wischen Sie es after nicht länger als 2 min mit trockenem Mull, gefolgt von Kochsalzlösung getränkter Gaze. Es sollte darauf geachtet werden, zu vermeiden, ist es in den Augen. Alternativ kann der Tierarzt, Augensalbe vor der Haarentfernung als zusätzlichen Schutz für die Augen aufgetragen werden. Es ist zwingend notwendig, dass alle Spuren der Enthaarungscreme, um mögliche Irritationen vor übermäßiger Belastung durch die chemischen Mittel zu vermeiden, entfernt werden. Desinfizieren Sie die Kopfhaut durch die Anwendung von 5% Chlorhexidin (1D).
5. Injizieren subkutan 5 mg / kg Carprofen in 200 ul Kochsalzlösung verdünnt. Bewerben vet Augensalbe, um Trockenheit zu verhindern und halten das Tier auf einem Thermal-Pad zu jeder Zeit. Positionieren Sie das Tier unter dem Betriebsfernglas.
6. Machen Sie einen 1 cm langen ovalen Schnitt in der Kopfhaut mit einer feinen Schere und Pinzette (1E). Halten Sie die Knochenhaut mit gebogenen Pinzette und schneiden Sie mit einer feinen Schere.
7. Bohren Sie das Schädeldefekt 2 mm anterior der Lambdanaht mit Hilfe eines Zahnbohrers einnd 5 mm Außendurchmesser-Trepan (1F und G). Um das Eindringen der Dura mater zu vermeiden, bohren drei Viertel des Weges in den Knochen lösen, dann das Knochenfragment mit einem Spatel.
8. Um ein Autograft implantiert werden, rufen Sie die Knochenfragment und waschen Sie ihn in einem 10 mm Kunststoffplatte, die 10 ml steriler Kochsalzlösung, um Schmutz zu entfernen. Die Weichteile nicht entfernen. Um eine Allograft, Tauwetter im Voraus zu implantieren eine Allograft und normalisieren es auf RT und dann waschen Sie.
9. Legen Sie das Knochentransplantat in dem Defekt mit gebogenen Pinzette, so wird es nicht berühren die Defektränder (Abbildung 1H). Kleben Sie das Transplantat an den Wirtsknochen mit Fibrin-Gel (5 ul von 46 mg / ml Fibrinogen mit 5 & mgr; l von 25 U / ml Thrombin gemischt).
10. Naht der Haut mit 4-0 Vicryl Nahtmaterial (1I). Bewerben PVP-Jod auf die chirurgische Schnitt. Vorsicht ist geboten, um die Kontamination des Fadens von Pelz zu verhindern. Markieren Sie die Mausohr und injizieren 0,25 mg / kg Antisedan to kehren die betäubende Wirkung von Medetomidin.
11. Wenn das Tier nicht aufwachen in 10 min, sicherzustellen, dass es auf einem erwärmt Pad entfernt. Injizieren 200 ul steriler Kochsalzlösung, und wenn inject 0,1 mg / kg Antisedan notwendig. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.
12. Halten Sie die Tiere in getrennten Käfigen für eine Woche, um sie das Öffnen der Nähte verhindern. Zeigen Mäusefutter in Wasser in einer Petrischale auf dem Käfigboden für ein paar Tage nach der Operation eingeweicht. Injizieren subkutan 200 ul 1 mg / ml-Lösung täglich Carprofen in steriler Salzlösung verdünnt, einmal für 3 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen, zu behandeln.

Abbildung 1. Schädeldecken Allograft Vorbereitung und Schädeldecken Defect Chirurgie. Das Knochenfragment wird aus dem Schädelbereich (A) isoliert. Weichgewebe, Knochenmark und Blut abgetupft (B) und das Transplantat wird in 70% Ethanol, gefolgt von zwei Waschungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (C, AG = Allotransplantat) gespült. Der Empfänger der Maus ist für die Chirurgie nach der Rasur und Desinfektion der Haut im Schädelbereich (D) hergestellt. Ein ovaler Schnitt wird in der Kopfhaut erstellt, und die Knochenhaut entfernt wird (E). Als nächstes wird der Schädeldefekt unter Verwendung einer 5 mm Durchmesser Trepan (F) gebohrt. Das Knochenfragment wird mit einem löffelförmigen Spatel abgelöst, so dass der Sinus sagittalis superior intakt (G). Allotransplantats wird dann in den Defekt eingebracht und unter Verwendung von Fibrin-Gel (H) befestigt ist. Schließlich wird die Haut vernäht (I). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Mikro-Computertomographie für die Charakterisierung vonGefäßbaumes

1. Bereiten heparinisierter Kochsalzlösung. Gewicht 2.000 U Heparin-Natrium und legen Sie sie in 50 ml Kunststoffröhrchen. In 20 ml Kochsalzlösung und gut schütteln den Schlauch. Füllen Sie einen 20-ml-Luer-Lock-Spritze mit 15 ml erwärmt heparinisierter Kochsalzlösung, und schließen Sie die Spritze mit einer 23-G Kopfhaut Vene gesetzt. Befestigen Sie die Spritze mit einer Spritzenpumpe, und setzen Sie ihn auf 10 ml mit 1 ml / min zu pumpen.
2. Sedieren eine Maus unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von 50 ul Phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Klemmen Sie das Tier Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief sediert. Sichern Sie die Maus auf dem Rücken zu einer Fixationsplatte mit einer absorbierenden Oberfläche Liner (2A) gewickelt. Setzen Sie die Fest Maus in einem Abzug des Personals der Exposition gegenüber Rauch zu verhindern.
3. Schneiden Sie die Haut aus dem Bauch bis zum Hals mit einer feinen Schere und Pinzette (2B). Schneiden Sie die Bauchwand bis zum Schwertfortsatz (Abbildung 2C). Schneiden Sie den Brustkorb entlang der lateralen Seite. Nicht zu verletzen, die Lunge eined Herz, und stellen Sie sicher, das Herz voll ausgesetzt ist. Verwenden Sie eine Gefäßklemme, um das Brustbein (2D) zurückzuziehen.
4. Legen Sie die Butterfly-Nadel 3 mm in den linken Ventrikel (2E). Kleben Sie die Nadel, um das Herz und die Brustwand unter Verwendung von 3-sec Kleber (2F).
5. Aktivieren Sie die Pumpe sofort. Nach einer Minute zu sezieren die untere Hohlvene, um das Gefäßsystem (2G) drucklos. Kippen Sie die Platine, so dass Flüssigkeiten vom Kopf weg fließen. Erfolgreiche Perfusion wird bei der Klärung der Leber und der Blutgefäße führen.
6. Wenn die heparinisierter Kochsalzlösung Perfusion beendet ist, zu perfundieren 10 ml von 4% Formaldehyd. Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen in das Gefäßsystem und die Belastung durch Formaldehyd-Dämpfe zu vermeiden. Erfolgreiche Formaldehyd-Perfusion in Versteifung des Schwanzes führen. Spülen Sie die Formaldehyd mit 10 ml heparinisierter Kochsalzlösung.
7. Bereiten Sie die röntgendichten Kontrastmittel nach manufacturer Anweisungen. Typischerweise wird es Mischen der Verbindung, Verdünnungsmittel und einem Härter erforderlich. Verwenden serologischen Pipetten und mischen Sie die Lösung in einer 15 ml Kunststoffröhrchen.
8. Perfusion des Tieres mit der Kontrastmittel-Gemisch mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min. Beachten Sie die koronare, Darm- und Leberblutgefäße und sicherzustellen, dass sie werden gelb nach Perfusion von 2 - 3 ml, was eine erfolgreiche Perfusion (2H). Nach Beendigung der Perfusion, schneiden der Butterfly-Nadel Schläuche, erhalten den Kadaver allein und wickeln Sie es mit Toilettenpapier, um ein Auslaufen der Lösung des Schädelbereich zu verhindern. Erlauben Polymerisation in 4 ° CO / N.
9. Präparieren Sie die Schädelregion (2I); Verwenden Sie zuerst ein Skalpell, um die Haut als seitliche wie möglich geschnitten, Vermeidung von Schäden an der Schädel Region von Interesse. Suchen Sie den Knochentransplantat und verwenden Sie dann feinen Schere, um die Schädelknochen 10 mm entfernt von der Pfropf geschnitten.
10. Scannen Sie den getrennt Calvarial Knochenprobe unter Verwendung eines μCT-Scanner; eingestellt Sehfeld von 20,5 mm, der Röntgenenergie von 55 kVp, Intensität von 145 & mgr; A mit 1.000 Projektionen pro 360º und Integrationszeit von 200 ms. Passen μCT Parameter ^{7 bis} Bild anderen Knochendefekt-Modelle.
11. Beachten Sie die 2D rekonstruierten Schichten, die von der μCT-Software generiert wurden. Stellen Sie sicher zu scannen die Region von Interesse ist richtig und suchen Sie den Schädeldefekt. Bewerten Sie die Qualität der Durchblutung. Nach erfolgreicher Identifizierung von Blutgefäßen (2J), fortzusetzen und zu entkalken die Probe mit 6% Trichloressigsäure (TCA) in doppelt destilliertem Wasser (DDW) verdünnt.
12. Rescan die Probe mit den in Abschnitt 3.10 genannten Parameter. Suchen Sie die Lambdanaht im rekonstruierten 2D-Schichten. Definieren einen zylindrischen interessierenden Volumen (VOI) in der Höhe von 2 mm und 8 mm Durchmesser ist, die tangential zu dem Nahtmaterial - dies ist die Lokalisation der Defekt.
13. Segment the Knochengewebe aus Weichteile mit Hilfe eines globalen Schwellenwertverfahren; stellen Sie die untere Schwelle auf 130, und wenden Sie einen eingeschränkten 3D-Gauss-Filter (sigma [σ] = 2,0 und Support = 2), um teilweise Rauschen zu unterdrücken in den Bänden. Generieren Sie eine 3D-Rekonstruktion und sicherzustellen, dass der VOI richtig positioniert ist (Abbildung 2K).
14. Generieren Sie eine Dickenkarte mit der IPL-Software und die Funktion "dt_object_param" (Abbildung 2 l).
    Hinweis: Diese Funktion beschreibt die Gefäßvolumen für jeden Gefäßdurchmesser.

Abbildung 2. Perfusion mit einem röntgendichten Mittel über das Herz Ansatz. Die Maus wird mit dem Befestigungsplatte (A) befestigt ist, und die Haut wird entlang den Bauch bis zum Hals (B) geschnitten. Die Bauchdecke wird entlang der Mittellinie bis zum Schwertfortsatz proce geschnittenss (C) und der Brustkorb seitlich (D) schneiden. Ein Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel eingeführt, die Vermeidung Einführen in die rechte Herzkammer, die deutlich dunkler ist (E, wird der rechte Ventrikel durch die weiße gestrichelte Linie angedeutet), und die Nadel wird auf das Herz und Brustwand befestigt (F) . Heparinisierter Kochsalzlösung (2-3 ml) wird in das Herz gepumpt wird, und die untere Hohlvene seziert (G, weiße Pfeil zeigt die untere Hohlvene). Formaldehyd (4%) wird durchblutet und ausgewaschen; dies wird durch eine Perfusion von gelbgefärbten strahlenundurchlässigen Kontrastmittels folgt. Erfolgreiches Durchblutung wird durch Freigabe der Blutgefäße, die Farbe zu gelb (H) ändern verständlich sein. Nach der Polymerisation wird die Schädelregion isoliert (I, AG = Allograft) und abgebildet mit einem μCT-Scanner, um die ordnungsgemäße Durchblutung (J, interessierende Volumen wird mit orange markiert) zu bestätigen. dasProbe wird entkalkt und neu gescannt (K), gefolgt von der Erzeugung einer farbigen Dickenkarte (L). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Fluoreszenz-Imaging von Knochenmineralisierung und Durchblutung

1. Rekonstituieren Sonden auf eine Konzentration von 2 nmol / 100 ul PBS in einem 1,5-ml-Röhrchen (mit einem Bisphosphonat-konjugierten Fluoreszenzsonde zur Knochenmineralisierung und einer durch Blut übertragbaren Fluoreszenzmittel zu überwachen, um die Durchblutung zu messen). Pipette mehrmals vorsichtig, um eine homogene Auflösung der Sonde gewährleistet ist.
2. 24 Stunden vor dem vorgesehenen Imaging-Sitzung nehmen Sie ein Bild der Zeit von Null; betäuben 3 Mäuse mit 2 l / min Inhalation von Sauerstoff 100% medizinischem mit 3% Isofluran in einem Induktionskammer ergänzt. Nach entsprechender Anästhesie festgestellt wurde, senken Sie die Isofluran-Konzentration auf 1,5% - 2%.
3. Bewerben vet Augensalbe bis zur Trockenheit zu verhindern und sicherzustellen, Thermal-Pad auf jederzeit umgeschaltet. Drücken Sie den Tierische Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief anästhesiert. Lassen Sie nicht ein Tier unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten.
4. Rasieren Schädelbereich mit einer Haarschneidemaschine Auftragen gegen die Richtung des Haarwachstums. Fellreste mit Haarentfernungscreme zu entfernen. Alle Fellrest wird mit optischen Abbildungs ​​stören. Nähte mit einer feinen Schere und Pinzette entfernen.
5. Platzieren Sie drei Tiere auf dem IVIS Stufe erwärmt auf 37 ° C für jede Bildgebungssitzung. Stellen Sie die Belichtungszeit, um die automatische, Sichtfeld, um C und Filter anpassen. ZB für eine Bisphosphonat-konjugierten Fluoreszenzsonde mit maximaler Erregung gekennzeichnet, daß zuminLichtWellenLänge von 680 nm, verwenden Sie ein Anregungsfilter von 675 nm und einem Emissionsfilter von Cy5.5 . In ähnlicher Weise, wenn Sie eine durch Blut übertragene Fluoreszenzmittel mit Spitzen Anregung bei Lichtwellenlänge 750 nmverwenden ein Anregungsfilter von 710 nm und einem Emissionsfilter von 780 nm.
6. Bild die Mäuse durch Wohnzimmer Bild-Software, indem Sie auf die Schaltfläche "Erfassen". Sicherstellen, dass die Schädelregion vollständig sichtbar ist (3B) Für eine umfassende Anleitung beraten Lim et al ²⁰⁰⁹ 8.
7. Lassen Sie die Maus zu erwachen Einatmen 100% Sauerstoff.
8. Spritzen Sie die 2-nmol Fluoreszenzsonde über einen intravenösen Schwanz Injektion. An der bestimmten Bildgebungssitzung führen Bildgebung wie oben beschrieben.

5. Mikro-Computertomographie für die Knochenregeneration

1. Zur Quantifizierung der Knochenbildung, zu betäuben die Maus durch Inhalation von 3% Isofluran, wie in Schritt 4.2 dargestellt - 4.3. Übertragen Sie die Maus an die μCT-Scanner-Bett, und legen Sie sie in den Scanner.
2. Gesetzt Röntgenröhre potentielle Energie der μCT Scanners bis 55 kVp und Intensität von 145 & mgr; A mit mittlerer Auflösung. Mit einem Sichtfeld von 20,5 mm, führenein Scout (Einzel x-ray) zu scannen und eine Region von Interesse, die sich von den Augen der Maus auf die Rückseite seines Schädels zu definieren. Führen Sie einen CT-Scan mit 1000 Vorsprünge pro 360 ° und Integrationszeit von 200 ms.
3. Rekonstruktion der 2D-Schichten mit einem Nominal räumlichen Auflösung von 20 um. Richten Sie die Defektränder auf eine standardisierte Position mit μCT-Software ^9.
4. Ähnlich wie in Schritt 3.20, definieren eine zylindrische Volumen von Interesse und Anwendung der eingeschränkten 3D-Gauss-Filter (σ = 0,8 und Support = 1), um teilweise Lärm in den Bänden unterdrücken. Segment das Knochengewebe aus Weichteile mit Hilfe eines globalen Schwellenwertverfahren.
5. Bestimmen das Volumen der mineralisierten Knochengewebe in dem interessierenden Volumen.

6. Biolumineszenz-Bildgebung von Stem Cell Rekrutierung und Differenzierung

1. Bereiten Sie die Maus für die Bildgebung wie in den Abschnitten 4,2 bis 4,4 dargestellt und wach die Mäuse durch Inhalation von 100% Sauerstoff.
2. Verwalten 126 mg / kg Käfer Luciferin jeder Maus durch intraperitoneale Injektion, und gibt das Tier auf die Induktionskammer. Nach 2 min, betäuben die Tiere unter Verwendung von 3% Isofluran. Zeigen die Mäuse auf dem IVIS erwärmt Bühne.
3. Via Wohnzimmer Bild-Software, stellen Sie die Belichtungszeit auf "auto", und das Sichtfeld zu C. Bild die Mäuse 5 min nach Luciferin Verwaltung. Bild die Tiere wie in Schritt 4.6 dargestellt, mit Hilfe der "Biolumineszenz" Modalität Regionen von Interesse zu definieren, da transgene Expression variiert zwischen Mäusen. Normalisieren die Schädel Signal an den Schwanz.

Ergebnisse

Neovaskularisation wurde durch μCT Volumenanalyse und durch FLI unter Verwendung eines fluoreszierenden Blut übertragenen Mittel, um die Durchblutung zu quantifizieren bewertet. Sieben Tage nach der Operation zeigte μCT Scanning eine deutlich höhere Volumen der kleinen und mittleren Durchmessers der Blutgefäße bei Mäusen, die Autotransplantate als bei Mäusen, die Allotransplantate aus C57BL / 6 (3A) geerntet erhalten hatten. Interessant ist, dass in der Autograftgruppe die neu gebildete Gefäßbaum ersche...

Diskussion

Das Ziel der hier beschriebenen multimodale Bildgebung Ansätze ist es, sorgfältige Untersuchung der Angiogenese-Osteogenese Achse im Rahmen der Schädelknochentransplantation zu ermöglichen. Neovaskularisation wurde unter Verwendung eines μCT-Protokoll, das eine genaue hochauflösende 3D-Demonstration des Gefäßbaumes erlaubt Zuführen des gesamten Schädeldefekt abgebildet. μCT Daten können leicht analysiert werden mit Hilfe modernster Tools wie IPL-Software. Zum Beispiel kann die Dicke Analyse in 3C gezeig...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/C  Mäuse	Harlan Laboratorien	57
FVB/n Mäuse	Harlan Laboratorien	862
Phenobarbital	West waro	NDC 0641-0477-25
Nagetier Haarschneider	Wahl Tier	8786-451A
Skalpell 11	Miltex	27111504
Dental Mikromotor	Marathon III
5 mm Trephin	Fine Science Tools	18004-50
Haarentfernungscreme	Veet
KetaVed (Ketamin)	Vedco	NDC 50989-996-06
Domitor	Zoetis	NADA 141-267
Carprofen	Norbrook	02000/4229
Augensalbe	Puralube	NDC 17033-211-38
Binokular zur Bedienung	Kent scientific	KSCXTS-1121
Feine Schere	Fine Science Werkzeuge	14060-11
Kurvenpinzette	Fine Science Werkzeuge	11274-20
Löffelförmiger Spatel	Fine Science Werkzeuge	10090-13
Tisseel Fibin Gel-Kit	Baxter	718971
Nadelhalter	Fine Science tools	12060-01
vicryl Naht 4-0	Ethicon	J392H
Antisedan	Zoetis	NADA#141033
Heparin	Sigma	H3393
20 ml Luerlock	BD	302830
23G Kopfhautvenen-Set (Schmetterlingsnadel)	BD	367342
Hemostat	Fine Science Werkzeuge	13008-12
Spritzenpumpe	Harvard Gerät	PHD 2000
3-Sekunden-Gelkleber	Scotch
Nagetier-Präparierbrett	Leica	38DI02313
Microfil MV-122	flow-tech	MV-122
μ CT40 Scanner	Scanco	μ CT40
TCA6%	Sigma	T6399
Osteosense 680	PerkinElmar	NEV10020EX
Angiosense750	PerkinElmar	NEV10011
Oxigen 100% medizinisches
Isofluran (Furan)	Baxter	1001936040
IVIS Kinetik	Xenogen
Käfer Luciferin	Promega	E160A