Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Zusammenfassung

Glykolyse ist ein definierender metabolischer Marker in mehreren biologischen Systemen. Die Überwachung der Glykolyse durch Messung des extrazellulären Flusses von H⁺ ist üblich, erfordert jedoch eine Korrektur, um quantitativ und eindeutig zu sein. Hier zeigen wir, wie extrazelluläre Flussdaten gesammelt und korrigiert werden können, um zwischen respiratorischen und glykolytischen Quellen der extrazellulären Versauerung zu unterscheiden.

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Messung des Sauerstoffverbrauchs und der Säureproduktion ist eine einfache und leistungsstarke Methode, um die Atmungs- und Glykolyseraten zu überwachen¹. Sowohl mitochondriale (Atmung) als auch nicht-mitochondriale (andere Redox) Reaktionen verbrauchen Sauerstoff, aber diese Reaktionen können leicht durch chemische Hemmung der mitochondrialen Atmung unterschieden werden. Während der mitochondriale Sauerstoffverbrauch jedoch ein eindeutiges und direktes Maß für die Atmungsrate² ist, gilt dies nicht für die extrazelluläre Säureproduktion und ihre Beziehung zur glykolytischen Rate ^3-6. Die von den Zellen produzierte extrazelluläre Säure wird sowohl aus Laktat gewonnen, das durch anaerobe Glykolyse produziert wird, als auch aus CO₂, das im Zitronensäurezyklus während der Atmung produziert wird. Bei der Glykolyse ist die Umwandlung von Glukose in Laktat^- + H⁺ und der Export von Produkten in das Testmedium die Quelle der glykolytischen Ansäuerung. Für die Atmung ist der Export von CO₂, die Hydratation zu H₂CO₃ und die Dissoziation zu HCO₃^- + H⁺ die Quelle der Atemwegsübersäuerung. Die Anteile der glykolytischen und respiratorischen Übersäuerung hängen von den Versuchsbedingungen ab, einschließlich des Zelltyps und der bereitgestellten Substrate, und können von nahezu 100 % glykolytischer Ansäuerung bis zu nahezu 100 % respiratorischer Übersäuerung reichen ⁶. Hier demonstrieren wir die Datenerhebungs- und Berechnungsmethoden, die erforderlich sind, um den respiratorischen und glykolytischen Beitrag zur gesamten extrazellulären Versauerung ganzer Zellen in Kultur anhand von C2C12-Myoblastenzellen als Modell zu bestimmen.

Einleitung

Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, den glykolytischen Rate von Zellen mit der extrazellulären Flussanalyse genau zu messen. Quantitative Messung der glykolytischen Rate unter Verwendung extrazelluläre Ansäuerung ist der gewünschte Endpunkt vieler Experimente. Allerdings ist die Gesamtrate der extrazellulären Ansäuerung die Summe aus zwei Komponenten: Atem Versauerung, in Form von _CO 2 (die _H 2 CO 3 distanziert dann zu _HCO 3 Hydrate ^{- +} H +) und glykolytischen Versauerung, in Form Lactat ^{- +} H ^+.

Die Beiträge der _CO 2 zum Gesamtextrazelluläre Ansäuerung bis vor kurzem wurde als geringfügig in der Messplattform zum Einsatz, der XF24 ^Analysator 7. Es ist jedoch klar, in mehreren anderen Systemen, die _CO 2 kann einen wichtigen Beitrag zur extrazellulären Ansäuerung ^4-5 sein. Mehrere Papiere bestätigen diese conBeitrag, aber versuchen Sie nicht, direkte Quantifizierung von _CO 2 abgeleitete Säure ^3,8,9. Wir haben kürzlich gezeigt, dass quantitativ _CO 2 Produktion ist eine bedeutende Quelle der extrazellulären Ansäuerung in diesem System ^6. Darüber hinaus, obwohl es mehrere Stoffwechselwege, _die CO 2 aus Glukose-Katabolismus zu erzeugen, die Kontrollen durch Matrix-Dehydrogenasen in der Zitronensäure-Zyklus durchgeführt werden die überwältigende Mitwirkenden und alle anderen Quellen zu erzeugen Mengen an _CO 2, die innerhalb der Fehler ^6.

Ohne Korrektur für die _CO 2 -Produktion ist extrazelluläre Ansäuerung daher eine mehrdeutige Indikator für glykolytische Rate und nicht quantitativ verwendet werden. Unsere früheren Veröffentlichung hebt mehrere Fälle, in denen Atmungs CO _{2 umfasst} den Großteil der Gesamt Ansäuerung Signal, sogar in einzelnen Zellen im Allgemeinen angenommen, dass in erster Linie nutzen Glykolyse ^6. Zusätzlich kann dasAtem _CO 2 Beitrag zur gesamten Ansäuerung variiert stark im Verlauf gemeinsamer metabolischer Profile Experimente zeigen, dass den genauen Vergleich der glykolytischen Rate während verschiedene Teile eines Experiment erfordert Korrektur für _CO 2.

Um den glykolytischen Rate von Zellen mit der extrazellulären Ansäuerung Rate der zu messen, ist es notwendig, den pH-Wert der Entwicklung der Gesamt H ⁺ erzeugt umzuwandeln und um die extrazellulären Ansäuerung von CO _{2 verursacht wird} während des Betriebs des Zitronensäurezyklus freigesetzt zu subtrahieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zum Messen extrazellulären Protonenproduktionsrate (von extrazellulären pH-Änderungen und der kalibrierten Pufferkraft des Assaymediums) und _CO 2 -Produktion (von extrazellulärer Veränderungen in _O 2 -Konzentration) und zeigen, wie man glykolytischen Rate zu berechnen unter Verwendung dieser Messungen.

Diese Methode Stärke ens die Nützlichkeit der extrazellulären Ansäuerung Messung, indem Sie es richtig zu berechnen glykolytischen Rate wie durch Laktatproduktion definiert. Ohne Korrektur für Atem _CO 2 (oder direkte Messung der Laktat), ist es unmöglich, festzustellen, ob und in welchem ​​Umfang die Gesamt Ansäuerungsrate spiegelt glykolytischen Rate, verwechseln die Interpretation von Experimenten, die gesamte extrazelluläre Ansäuerung nutzen als direkte Messung der Laktatproduktion.

BERECHNUNGEN

_CO 2 und Lactat sind, innerhalb des experimentellen Fehlers, die nur zwei Beiträge zur extrazellulären Säureproduktion, basierend auf Experimenten mit Myoblastenzellen ^6. Daher kann die Rate der gesamten extrazellulären Ansäuerung (PPR, Protonenproduktionsrate) wie folgt definiert werden:

PPR _{tot =} PPR _bzw. + PPR _glyc Gleichung 1

. _content "> wobei tot = Gesamt; resp = Atem; glyc = glykolytischen glykolytischen PPR ist somit:

PPR _glyc = PPR _tot - PPR _bzw. Gleichung 2

Hier,

PPR _{tot =} ECAR _tot / BP Gleichung 3

wo ECAR = extrazellulären Ansäuerungsrate (mph / min) und BP = Pufferkraft (mph / pmol ^H + in 7 ul), während

PPR _bzw. = (10 ^{pH-PK _{1 / (1}} ​​+ 10 ^{pH-PK ₁₎₎} (max ^H + / _A-2) (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Gleichung 4

wobei K _{1 =} kombinierte Gleichgewichtskonstante der _CO 2 Hydration und Dissoziation zu _HCO 3 ^{- +} H +; max H ⁺ _/ O 2 = the _CO 2 stammenden Versauerung für eine bestimmte metabolische Umwandlung, wie vollständige Oxidation von ^Glucose-6; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate (pmol _O 2 / min) und OCR _{rot / myx} = nicht-mitochondrialen OCR.

Gleichung 4 Isolaten mitochondrialen OCR durch Subtrahieren jeden Nicht mitochondrialen OCR (definiert als OCR, die gegenüber der mitochondrialen Atmungsgifte Rotenon und Myxothiazol ist) und beträgt die maximale H ⁺ pro _O 2 für jedes Substrat (max H ⁺ _/ O 2 verbraucht erzeugten ) (siehe ^6), sowie der Anteil an _CO 2, die zu H ⁺ in der Versuchstemperatur und pH-Wert (10 ^{pH-PK _{1 / (1}} ​​+ 10 ^{pH-PK _1).} Für eine vollständige Oxidation von Glucose, mitochondrialen Sauerstoff Verbrauchsrate (OCR) ist genau gleich der Geschwindigkeit der CO _{2 -Produktion.} Im geschlossenen Assayvolumen von extrazellulärem Flussmessung, CO _{2 erzeugen}d durch Atmung bleibt gefangen in dem Testmedium. + H ^{+ -} der größte Teil der eingefangenen CO _{2 mit} H _{2 CO 3,} die dann dissoziiert _HCO 3 hydratisiert. Eine kleine Fraktion gelöst bleibt, jedoch nicht hydratisiert, und ein anderer kleiner Anteil hydratisiert, aber nicht gespalten, da thermodynamisch durch die kombinierte Gewichtskonstante _CO 2 Hydratation und Dissoziation _HCO 3 diktiert ^{- +} H ^{+ bei} Versuchstemperatur (37 ° C) und pH- (~ 7,4).

Somit ist die komplette Gleichung zur Berechnung PPR _g durch Subtraktion PPR _bzw. von PPR _tot ist:

PPR _glyc = ECAR _tot / BP - (10 ^{pH-PK _{1 / (1}} ​​+ 10 ^{pH-PK ₁₎₎} (max ^H + / _A-2) (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Gleichung 5

ichn So Raten von Atmung und Glykolyse, sowie ihre zugehörigen ATP Produktionsraten kann quantitativ aus einfachen Messungen (Sauerstoffverbrauch, extrazelluläre Ansäuerung Pufferkapazität) sowie Ein- und Berechnung der anderen erforderlichen Werten (H ⁺ _/ O 2 bestimmt werden, P / O, und die Gleichgewichtskonstante K _{¹⁾ 6.} Das hier beschriebene Experiment baut auf Standard-Techniken für die Verwendung der extrazellulären Flux Analyzer wie Seahorse XF24 ^10,11; für andere extrazelluläre Flussmessung Formate (zB XF ^E 96 oder XFP), sollten alle unten Volumina entsprechend skaliert werden.

Die Pufferleistung der Assay-Medium kann durch die Entwicklung einer Standard-Kurve entweder direkt in der extrazellulären Flussplattform oder separat mit einem kalibrierten pH-Sonde gemessen werden. Hier werden drei Optionen zur Messung von Puffern durch die extrazelluläre Flusstestmedium gegeben, einschließlich Verwendung aller INJEKTIERTan den Ports der extrazellulären Flux Analyzer mit zellfreien Probenvertiefungen oder nur mit dem letzten Einspritzöffnung in zellhaltigen Brunnen (Abschnitt 1) ​​oder durch Verwendung eines externen pH-Messung (Abschnitt 2). Siehe die beigefügte Tabelle für die vollständige Berechnung der Beispieldaten.

Um Pufferkraft zu messen unter Verwendung des pH-Erfassungsfähigkeit der extrazellulären Flux Instruments, ist es am sichersten, zellfreien Brunnen verwenden, um Signaländerung zu minimieren. Innerhalb des Fehlers zwischen zellfreie und zellhaltigen Vertiefungen bei der Durchführung dieser Messung (Daten nicht gezeigt) besteht jedoch keine statistische Differenz. HINWEIS: Die in Schritt 1.7 beschriebenen Variante trägt den Vorteil, Buchhaltung für mögliche Änderungen an Puffern von zugesetzten Verbindungen oder durch die Anwesenheit von Zellen verliehen, mit dem Nachteil lauter Signal. Jedoch, wie oben angegeben, wurden keine signifikanten Unterschiede in der berechneten Pufferkraft zwischen dem zellfreien Design in Tabelle 1 gezeigt festgestellt unddie post-Versuchsplanung in der Tabelle 2 unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen.

Zusätzlich über kleine ApH Bereichen (<0,4 Einheiten; experimentell am besten, 0,2 Einheiten beschränkt), die lineare Steigung durch Auftragen Δ mph / pmol H erhaltenen ⁺ angemessen approximiert die logarithmische Beziehung zwischen & Dgr; pH und [H ^+]. Die Steigung der Standardkurve stellt daher die Pufferkraft des Assaymediums prüfenden pH / nmol H ⁺ in 7 ul oder mph / pmol H ⁺ in 7 ul. Wir empfehlen Medium Pufferkraft erhöht oder verringert Zelldichte für die Proben, die einen pH-Wert von 0,2 Einheitsänderung während der Messzeit überschreiten. Die Messzeit kann auch herabgesetzt werden, aber dies kann die stationäre Ansäuerungsrate verkürzen und Fehler in die Ratenberechnungs einzuführen.

Protokoll

1. Messung Pufferkraft in einer extrazellulären Flux Instrument: Zwei Variationen

HINWEIS: Die Berechnungen und hier beschriebenen Methoden wurden unter Verwendung eines extrazellulären Flux Analyzer entwickelt. Für andere Instrumente, muss das Messvolumen entsprechend skaliert werden.

1. Bereiten 0,1 M Standard HCl in Wasser unter Verwendung von HCl-Konzentrat (siehe Materialien und Ausrüstung) gemäß Herstelleranweisungen.
   Hinweis: Ein Berechnungsbeispiel für die Herstellung HCl Injektionen zur Verwendung bei allen vier Einspritzöffnungen sind in Tabelle 1 gezeigt:

Tabelle 1 Fortlaufende HCl-Injektionen in einer extrazellulären Flux Assay gut.

2. Verdünnungen des HCl-Standard in dem Medium wie in Tabelle 1 für die Anzahl der Wiederholungsversuche technischen wobei Carr getestet werdenied in eine Platte, plus ein bis zum Pipettieren Fehler erlauben, zB für vier technische Replikate des Hafens A Injektion, bereiten Sie einen Vorrat an (1,1 & mgr; x 5) 0,1 M HCl in (48,9 & mgr; x 5) Assay-Medium.
3. Verteilen 50 ul in jeden Port A der Meßsonde Patrone. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Ports B, C und D.
4. Führen Sie einen extrazellulären Flux Assay ¹⁰ mit einem Standard-Kalibrierungszyklus, gefolgt von zwei Zyklen der [2 min mix, 1 min Wartezeit, und 5 min Mess] für jede der Vier-Port-Erweiterungen (siehe Abbildung 2).
   1. Programmieren Sie das Experiment oben in der Gerätesoftware nach Software-Anweisungen. Laden der vorbereiteten Kartusche in das Gerät und führen Sie die Kalibrierung nach Software-Anweisungen.
   2. Wenn durch das Programm dazu aufgefordert werden, entfernen Sie die Kalibrierungshaltigen Platte und setzen Sie die Platte mit Assay-Medium in jeder Vertiefung in das Gerät; Programm fortsetzen.
5. U singen die durchschnittlich 8-10 Datenpunkte in einem stabilen Zustand erhalten (in der Regel die letzten 8-10 Punkte) vor und nach jedem Hafen hinaus errechnen (kumulativ) Unterschied in der pH-Wert (& Dgr; pH) nach jeder Injektion von Standard-Säure verursacht.
6. Plotten ApH gegen nmol H ⁺ in der 7-ul-Volumen von der Messsonde eingeschlossen enthalten. Die lineare Steigung ist die Pufferkraft (BP) in mph / pmol ^H +.
7. Alternativ zu den Schritten von 1,2 bis 1,3, die Durchführung der & Dgr; pH-Messungen nach einem Test, bei dem Anschlüsse A, B, und C für ein Experiment verwendet wird, gefolgt von einer HCl-Injektion in Port D. Wie in Tabelle 2 sind vier technische Replikate verwendet, um jeden Punkt eines 5-Punkt-Standardkurve in den 20 Versuchsbrunnen (mit Ausnahme der vier Hintergrundtemperaturkorrektur Wells) der extrazellulären Flussassayplatte zu erzeugen.

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Tabelle 2. Einzel HCl-Injektion in einer extrazellulären Flux Assay gut.

2. Mess Buffering Strom Verwenden eines externen pH Meter

HINWEIS: Für die Messung der Pufferkraft eines Mediums unter Verwendung eines externen pH-Sonde, Kalibrierung der Sonde bei 37 ° C und diese Temperatur für alle Reagenzien während des Experiments aufrechtzuerhalten.

1. Bereiten 0,1 M Standard HCl in Wasser unter Verwendung von HCl-Konzentrat nach Herstelleranweisungen.
2. Warm pH-Sonde, pH-Standards, dem Testmedium, dessen Pufferkraft zu messen ist, und 0,1 M HCl auf 37 ° C in einem Wasserbad.
3. Kalibrieren pH-Sonde bei 37 ° C gemäß den Herstelleranweisungen. Pflegen Sie alle Reagenzien bei 37 ° C während des Assay durch Verwendung einer Wärmeplatte oder Wasserbad.
4. 10 ml Aliquot des Assaymediums in einem kleinen Becher oder konischen Rohr. Überwachen pH kontinuierlich mit Hilfe eines pH-Sonde eingetaucht.
5. Mit 0,1 M HCl zu dem alssagen Medium in 10-20 ul Aliquots.
   1. Stellen Sie sicher, das Mischen unter Verwendung eines Rührstabes oder durch den Behälter nach jeder Säureadditions manuell wirbeln.
   2. Lassen Sie ein paar Sekunden, bis der pH-Wert-Messung zu stabilisieren, dann notieren Sie die pH nach jeder Zugabe.
   3. Wie in Tabelle 3 gezeigt, stellen Sie eine ausreichende Anzahl von Ergänzungen genaue Steigungsberechnung zu gewährleisten und die pH-Bereich während des Experiments erwartet decken.

Tabelle 3. Messpufferkraft mit einem pH-Meter. Die Daten stellen einen typischen Versuch mit sechs 20 ul Zugaben von 0,1 M HCl.

6. Pro 7 ul Plot ApH gegen nmol ^H + zugegeben, was eine lineare Steigung, die die Pufferleistung (Abbildung 1) darstellt.

Abbildung 1. Bestimmung Pufferkraft. HCl-Standardkurve, wie in Tabelle 1, Tabelle 2 oder (hier) gemessen, wie in Tabelle 3. Die Steigung der linearen Kurvenanpassung gibt die Pufferkraft (pH / nmol H ⁺ in 7 ul). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SEM von n = 9 technische Replikate.

7. Sobald die Pufferkraft wird durch Methode 1 oder 2 oben genannt, wandeln die ECAR Signal (mph / min), um PPR (pmol ^H + / min / ug Protein) durch Division ECAR durch Puffern Leistung (BP) (mph / pmol ^H +) und Skalieren auf den Proteingehalt jedes Wells:
   PPR _{tot (pmol} ^H + / min / ug Protein) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol ^H + in 7 ul) / Protein pro Well (ug) Gleichung 6
8. Alternativ können Sie die gleichen Experimente in der Methodes 1 oder 2, um die Pufferkapazität (BC) Wert von der Gerätesoftware verwendet werden, um während der Datenerfassung automatisch berechnen PPR berechnen.
   HINWEIS: Das Gerät Bedienungsanleitung ¹² (Seite 107) liefert detaillierte Informationen über die Ermittlung und Verwendung Pufferkapazität, in BC ist, wie beschrieben,
   BC (mol / L) = mol ^H + / (& Dgr; pH x Puffervolumen (L)) Gleichung 7
   HINWEIS: Die Pufferkapazität, wie in Gleichung 7 definiert ist, kann in den oben beschriebenen Instrument oder externen pH-Sonden-Assays berechnet werden. Konvertierung zwischen Pufferkraft und Pufferkapazität ist leicht getan (siehe beigefügte Tabelle):
   BC = 1 x ¹⁰ -9 / BP ((mph / pmol ^H + in 7 ul) / 7 ul) Gleichung 8
   HINWEIS: Wenn bekannt ist vor der Durchführung des Assays kann die Pufferkapazität direkt in der Gerätesoftware im Versuchsaufbau eingegeben werden.
9. Wenden Sie dieses Verfahren und die oben zu den meisten herkömmlichen Puffersystemen verwendet werden, Berechnungen, wie in früheren Veröffentlichung ⁶ beschrieben.
   HINWEIS: In Tabelle 4 sind die Pufferkraft und die Pufferkapazität von mehreren herkömmlichen Medien.

Tabelle 4. Buffering Macht und Pufferkapazität des ausgewählten Medien.

3. Durchführen einer Extracellular Flux Assay unter Verwendung von C2C12 Myoblastenzellen

HINWEIS: In Schritt 3.4.3, gab es keine Unterschiede in der beobachteten _CO 2 abgeleitetes Säureproduktion von der Gegenwart von Carboanhydrase in C2C12-Kultur, was darauf hindeutet, dass seine Anwesenheit nicht zur vollständigen Umwandlung von CO _{2 und HCO} 3 erforderlich ^{- +} H ^+. Jedoch empirisch testen diese in verschiedenen Versuchssystemen vor om empfohlenitting Carboanhydrase.

1. Kultur der Maus C2C12 Myoblasten ¹³ bei 37 ° C unter 95% Luft / 5% CO _{2 in} Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 11,1 mM Glucose, 2 mM Glutamin, 10% v / v fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
2. 24 Stunden vor dem Test, Platte / Samenzellen in 100 ul des gleichen Kulturmediums bei 20.000 Zellen / Vertiefung in eine 24-Well-Polystyrol extrazellulären Flussassayplatte (siehe Materialien und Verfahren) ohne zusätzliche Beschichtung.
3. Verdünnter Oligomycin, FCCP und Rotenon zuzüglich Myxothiazol und HCl (optional) zu 10X Endkonzentration in Krebs-Ringer-Phosphat-HEPES (KRPH) Assay-Medium (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH _{2 PO 4,} 3,7 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 1,5 mM _CaCl 2, 0,1% w / v fettsäurefreies Rinderserumalbumin, pH 7,4 bei 37 ° C).
4. Zellpräparation
   1. 30 min vor dem Test, waschen anhaftenden Zellen dreimal durch Ansaugen an GEntly entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und dann langsame Zugabe von 500 ul KRPH.
   2. Inkubieren Zellen nach dem dritten Waschschritt bei 37 ° C unter Luft (nicht unter 5% CO _{2, die den} pH-Wert dieser Bicarbonat-freiem Medium verändert wird).
   3. Bei Testbeginn, ersetzen KRPH in Vertiefungen mit 500 ul frisches KRPH mit 500 U / ml Carboanhydrase und entweder Glucose (10 mM) oder nur Medium, ohne zusätzliches Substrat.
5. Laden der Sensorkartusche
   1. Pipettieren Sie 50 ul Aliquots jeder 10x Verbindung in Schritt 3.3 in Patrone Häfen von einer extrazellulären Flusssensorkartusche wie folgt (Endkonzentrationen im Test auch angegeben) hergestellt: Port A: 2 ug / ml Oligomycin, Port B: 0,5 um FCCP, Port C : 1 & mgr; M Rotenon, 1 uM Myxothiazol, Port D: HCl (falls die Durchführung einer Assay Säure Kalibrierung wie oben und in Tabelle 2 beschrieben).
      Hinweis: Für die Zwecke der vollständigen Atmungskette Hemmung hier beschriebenen, 1 uM meinexothiazol austauschbar mit 1 & mgr; M Antimycin A. verwendet werden
6. Extracellular Flux Assay:
   1. Führen Sie eine Standard-extrazellulären Flux Assay zur Bestimmung der Atemkontrolle, wie in ¹⁰ beschrieben.

HINWEIS: Für jedes Segment des Experiments bestimmen die Mischung, zu warten, und Messzeiten gewünscht, sowie die Anzahl der Zyklen pro Segment.

Anmerkung: Die Daten in der Tabelle 5 wurden zwei Testzyklen von 2 min mischen, 1 Minute Wartezeit, und 5 min Maß für jedes Segment gesammelt, mit drei Testzyklen nach dem Port D Zugabe unterschiedlicher Mengen an HCl (zur Kalibrierung von Zwischenspeichern, Computer wie in Tabelle 2).

Tabelle 5. Extracellular Flux Assay-Konfiguration.

4. Measuring End-Punkt-Laktat-Konzentration

HINWEIS: Um die in irgendeiner anderen System, Endpunkt Laktatkonzentration am Ende einer extrazellulären Fluss Experiment kann direkt in einem konventionellen 96-Well-Platte bestimmt werden hier beschriebenen indirekten Assay durch Messung der Anfangsgeschwindigkeit (mehr als 2 min) der Reduktion der Validierung ^NAD + → NADH von Laktat-Dehydrogenase, die im Detail in unserer früheren Veröffentlichung ⁶ beschrieben katalysiert. Für die in Repräsentative Ergebnisse präsentierten Daten wurde der Endpunkt Laktatkonzentration in glucosehaltigen Testvertiefungen betrug etwa 40 um.

1. Vorbereitung 2x Hydrazin Medium: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM Hydrazin, pH 9,8 bei 22 ° C). Unmittelbar vor dem Test zu starten, fügen ^NAD + bis 4 mm und Laktat-Dehydrogenase (LDH) bis 40 U / ml. Endgültige Assaymedium Zusammensetzung (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM Hydrazin, 2 mM NAD ^+, 20 U / ml LDH.
2. Unmittelbar nach der extrazellulären Flux Assay, entfernen 100ul Assay-Medium von jeder Vertiefung der extrazellulären Flussassayplatte und in ein Well einer opak (schwarz) 96-Well-Platte.
3. Zu jeder Probe gut, fügen Sie 100 ul 2x Hydrazin Medium.
4. Die Platte in einem Mikroplattenleser sofort zu laden und beginnen Überwachung NADH Fluoreszenz bei 340 nm Anregung / 460 nm Emission.
5. Nehmen Sie die Anfangsgeschwindigkeit für ca. 2 min.
6. Führen Sie einen ähnlichen Versuch, um eine Standardkurve, bei der Anfangsgeschwindigkeit gegen die Laktatkonzentration für zusätzlichen Laktatkonzentrationen von 0 bis 50 & mgr; M zu konstruieren.
7. Berechnen Laktatkonzentration in jedem Versuchs auch mit Hilfe der Standardkurve.

5. Mess Protein Inhalt

1. Entfernen Sie verbleibende Testmedium aus jeder Vertiefung der Testplatte.
2. Dreimal mit 250 Wash Brunnen ul BSA freie KRPH, wobei Sie darauf achten, die eine Verlagerung der Zellen vom Boden und Oberfläche zu minimieren.
3. In 25 ul RIPA LyseMedium (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v Natriumdeoxycholat, 0,1% v / v SDS, pH 7,4, bei 22 ° C) zu jeder Vertiefung der Testplatte.
4. Inkubieren Platte auf Eis für 30 min.
5. Agitieren Platte auf einem Plattenschüttler bei 1200 rpm für 5 min.
6. Messung der Proteinkonzentration durch Standardverfahren, beispielsweise durch BCA-Assay, um sicherzustellen, dass der Lysepuffer Zusammensetzung mit dem Messverfahren kompatibel ist. Der Proteingehalt in dem Experiment in 2 betrug ~ 4 & mgr; g / Vertiefung.

Ergebnisse

Figur 2 zeigt die Rohdaten für ein typisches Experiment. Die letzten 10 Messpunkte von dem Punkt-zu-Punkt-Aufzeichnung sowohl von OCR und pH (schraffierte vertikale Balken) wurden für die Berechnungen verwendet. Anfängliche Bedenken, dass der Mittelwert (Mittelpunktmessung) jedes Testzyklus würde keine ausreichende Auflösung der Preis für eine genaue Berechnung, vor allem, da es schien, eine leichte Verzögerung zwischen Hafen hinaus und stationären Ansäuerungsrate zu können, wurden nicht bestätigt, dies scheint nicht wesentlich zur Berechnungsfehler tragen (nicht gezeigt). Alternativ kann, wenn der korrekte Pufferkapazität während des experimentellen Aufbaus eingegeben, PPR kann direkt von der Datenerfassungsinstrument Auslesen durch die Anzeige der Ausgabe PPR in der Gerätesoftware oder im PC-kompatiblen Format als eine der Datenausgabeeinstellungen verfügbar gelesen werden.

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Abbildung 2. Repräsentative extrazellulärem Fluss Spuren von _O 2 und H ^+. OCR und pH-Spuren für das Beispiel Experiment in Tabelle 5, die 10 mM Glucose bei Assay beginnt. Port D hatten unterschiedliche HCl-Konzentrationen für die Kalibrierung des Pufferkraft (in diesen gemittelten Spuren gezeigt). Daten aus früheren Veröffentlichung ^6. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SEM von n = 8 biologischen Replikaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Datenanalyse repräsentativer Ergebnisse

Verwendung der in Tabelle 6 gezeigt und als Anlage vorgesehen Arbeitsblatt kann die Datenwerte aus den einzelnen Vertiefungen in den mit gelben Schriften dargestellt Spalten eingegeben werden. Alle sechs Spalten der rechten Seite sind aus diesen Eingaben berechnet. Das Beispiel in Tabelle 6 zeigt die Berechnungen der PPR _bzw. und PPR _glyc Verwendung ECAR und OCR-Daten aus einzelnen Vertiefungen für die nativen Bedingungen mit oder ohne Zusatz von Glukose, vor dem Anschluss A Zugabe von Oligomycin. Technische Replikate für jedes biologische Herstellung sind in der Regel gemittelt, um einzelne Werte der Ausgänge in den letzten vier Spalten geben, dann werden die Daten aus unterschiedlichen biologischen Präparate mit entsprechenden Ausbreitung von Fehlerstatistiken in BP und dieser vier Werte gemittelt.

Tabelle 6. Berechnung der Atemwege und des glykolytischen Versauerung. Spalten in gelben Leitung anzuzeigen, Werte aus der Berechnung eingegeben werden (zB BP, max ^H + / _{A-2) oder} von der Datenerfassung (zB ECAR _tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Tabellenansicht |. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle als Excel-Tabelle herunterladen .

Beiträge der Glykolyse und Atmung zu PPR nach der Korrektur

Abbildung 3 zeigt die grafische Ausgabe von Daten für native Raten von glykolytischen und Atem Versauerung, Raten folgenden Oligomycin hinaus (Port A), und die Sätze folgende FCCP hinaus (Port B) berechnet, wie in Tabelle 6. Diese Daten zeigen deutlich, wie die Anteile der Atemwege und des glykolytischen Versauerung Wechsel mit Wahl des Substrats (Glukose vs. Kontrolle (CTL) mit keiner hinzugefügt) und mitochondrialen Status (native Funktion vs. pharmakologisch veränderten Funktion).

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Abbildung 3. Proton Produktionsrate (PPR) aus glykolytischen und Atemquellen. PPR von Atmung (offene Abschnitte) und Glykolyse (gefüllt Portionen) der C2C12-Zellen unter Verwendung der Gleichung 5 mit Zusatz von Glukose (drei linke Balken) oder ohne Zusatz von Glukose (drei rechte Balken). Daten von ^6. Alle Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM von n = 8 biologischen Replikaten.

Diskussion

Extrazelluläre Ansäuerung ist eine leicht gemessen Angabe der zellulären Stoffwechselrate. Um richtig bestimmen die Rate der zellulären Glykolyse (wie durch Laktatproduktion definiert) ist es wichtig, die Pufferleistung der Testmedium kennen und an die extrazelluläre Flussmessungen des Sauerstoffverbrauchs und Versauerung zu konvertieren, um die Produktionsraten Proton. Mit der Durchführung dieser Berechnung kann die Versauerung von _CO 2 in der Zitronensäurezyklus freigesetzt resultierenden abgezogen werden, so dass die Versauerung, die von Laktatproduktion führt.

Die mehreren verschiedenen Möglichkeiten die hier angegeben, um Pufferkraft für diese Korrektur messen tragen unterschiedliche Vor- und Nachteile. Externe Messung unter Verwendung einer pH-Sonde ist sehr genau und reproduzierbar ist, kann jedoch kleine Unterschiede im pH-Erfassung durch die in der Testplatte, die Zugabe von Verbindungen, die während des Tests, oder der Anwesenheit von t enthaltenen Fluorophore eingeführt widerspiegelner Zellen selbst. Die in-Platte pH-Messungen diese Probleme anzugehen, sondern auch die Einführung in unterschiedlichem Maße von experimentellen Lärm.

Die _CO 2 Korrektur ECAR ermöglicht zum ersten Mal die eindeutige quantitative Berechnung der glykolytischen Rate und zeigt Unterschiede in respiratorische und glykolytische Beitrag zur gesamten ECAR im Verlauf eines Experiments. Unter Verwendung von Gleichung 5 und die Messungen der OCR, ECAR und Pufferung Leistung kann glykolytischen Rate mit der einfachen Tabellenkalkulation zur Verfügung gestellt (Tabelle 6) berechnet werden. Diese Rate kann durch post-hoc Laktatmessung, falls gewünscht ⁶ überprüft werden. In Zellen, in denen die Pentosephosphatweg hoch aktiv ist, kann die Verwendung von Pathway-Inhibitoren wie 6-Aminonicotinamid sinnvoll sein, die glycolytische Rate zu isolieren. Berechnung der Beiträge sowohl von _CO 2 ^- und Lactat abgeleitete ^H + aus dem gesamten gemessenen extrazelluläre Ansäuerung Frequenz und Sauerstoff ConsumptIonen-Rate ist ein unschätzbares Werkzeug für die Verwendung von extrazellulären Flussdaten, um leistungsfähige und quantitative Aussagen über Stoffwechselaktivität zu machen.

Mit den hier beschriebenen Verfahren, einschließlich verschiedene Modifikationen zur Messung Pufferkraft und die Optimierung der für die extrazelluläre Flussexperiment für die untersuchten Zellen und die gewünschten Daten, kann die Geschwindigkeit der Glykolyse in intakten Zellen, die unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen quantifiziert werden. Dieses Verfahren ist auf Zellen, die in adhärenten Kultur auf wachsen kann (oder die Zellen oder Organellen, die geklebt werden können, um) ein Polystyroloberfläche begrenzt. Es ist sehr zuverlässig, wenn die kultivierten Zellen homogen und konfluent sind, obwohl Nutzdaten können noch über einen Bereich von diesen Bedingungen erhalten werden. Die Berechnungen erfordern einige Kenntnisse über den Stoffwechsel der Zellen, wie max ^H + / O _{2 im Bereich} von 0,65 bis 1,0 für die vollständige Oxidation von verschiedenen Substraten und zur Partialoxidation ⁶ jedoch, wenn die Zellen known um Glukose zu oxidieren, kann ein Wert von 1,0 ausgegangen werden.

Wenn alle relevanten metabolischen Charakterisierung kann dieses Verfahren besonders nützlich sein, wenn sie in Systemen verwendet, bei dem eine Verschiebung zwischen der Atemwege und glykolytischen Metabolismus aufrechtzuerhalten zellulären ATP-Versorgung ist eine kritische Phänotyp, einschließlich der Charakterisierung von Stammzellen und tumorderivierten Krebszellen. Das Verständnis der Stoffwechseleinstellung Veränderungen in diesen und anderen Zusammenhängen wird ein höheres Maß an Kultiviertheit und Genauigkeit bei der Versuchsplanung und Analyse dieser Zelltypen ermöglichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pherastar FS	BMG	n/a	Mikroplatten-Reader
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	n/a	extrazelluläres Flussmessgerät
Seahorse XF Assay-Platte	Seahorse Bioscience	V7-PS	Verbrauchsmaterial
XF Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000	Lösung
HCl Standard	Sigma	38280	chemisches
Oligomycin	Sigma	O4876	chemisches
FCCP	Sigma	C2920	chemisches
Rotenon	Sigma	R8875	chemisches
Myxothiazol	Sigma	T5580	chemisches
DMEM	Corning	10-013-CV	mittleres Bauteil
FBS	Corning	35-010-CV	medium Komponente
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI	mittlere Komponente
Carboanhydrase	Sigma	C2624	chemisch
96-Well-Assay-Platte	Corning	CLS3991	Verbrauchsmaterial
NAD+	Sigma	N7004	Chemikalie
LDH	Sigma	L1254	Chemikalie