Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

Zusammenfassung

Mikrowellen-Technologie ermöglicht extrem schnelle Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für Atherosklerose Plaquecharakterisierung. Die Verwendung eines Aminobisphosphonat in der Außenseite des Nanopartikels bietet eine schnelle Anreicherung in der atherosklerotischen Bereich.

Zusammenfassung

Eine schnelle und reproduzierbare mikrowellengesteuertes Protokoll wurde für die Synthese von Neridronat-funktionalisierten Nanopartikel entwickelt. Ausgehend von der Synthese von hydrophoben Nanopartikeln, ist unsere Methode basiert auf einer Anpassung von Verfahren zur thermischen Zersetzung Mikrowellen angetrieben Synthese. Die neue Methodik erzeugt eine Verringerung der Reaktionszeiten im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren. Darüber hinaus erhöht die Verwendung der Mikrowellentechnik, die Reproduzierbarkeit der Reaktionen, was wichtig vom Standpunkt der klinischen Anwendungen. Die Neuheit dieses Eisenoxid-Nanopartikel ist die Befestigung von Neridronat. Die Verwendung dieses Moleküls führt ein Bisphosphonat - Einheit in Richtung der Außenseite des Nanopartikels , das Ca ²⁺ Bindungseigenschaften in vitro und in vivo eine selektive Anreicherung in der Atherom Plaque liefert. Das Protokoll ermöglicht die Synthese und Plaque-Erkennung in etwa 3 Stunden seit der ersten Synthese von organic Vorläufer. Ihre Anreicherung in der atherosklerotischen Bereich in weniger als 1 Stunde liefert ein Kontrastmittel, insbesondere geeignet für klinische Anwendungen.

Einleitung

Atherosklerose ist eine multifaktorielle chronische entzündliche Erkrankung der Wandung arterielle aus einem deregulierten Lipidstoffwechsel und einem fehlerhaften Entzündungsreaktion. Aufgrund der Prävalenz und die wirtschaftlichen und sozialen Kosten von kardiovaskulären Erkrankungen dieser und verwandten besteht ein wachsendes Interesse an der Pathologie mit neuen Werkzeugen in Adressieren, von denen Nanotechnologie eine der vielversprechendsten ist. ^1-3 Jedoch gibt es sehr wenige Beispiele für schnelle Herstellung und Charakterisierung von Sonden , die für die Übersetzung in die Klinik ⁴ in diesem Protokoll verwenden wir eine Mikrowellensynthese von Eisenoxid - Nanopartikel zur weiteren Funktionalisierung mit einem Bisphosphonat und in vivo Detektion von Atherosklerose in ApoE basisch ist ^{-. / -.} Mäuse in 1 Std ⁵ Eisenoxid-Nanopartikel (IONP) sind eine bekannte Nanomaterial und seine Verwendung als Kontrastmittel für Magnetic Resonance Imaging (MRI) hat sich für den Nachweis verschiedener Krankheits etablierts in den letzten Jahren. ^6-8

Mikrowellensynthese (MWS), ermöglicht Nanopartikel in extrem kurzen Zeiten mit hoher Reproduzierbarkeit und verbesserte Ausbeuten zu synthetisieren. ^9,10 In unserem Protokoll erhalten wir IONP mit Plaque - Fähigkeiten in drei Schritten Targeting. Die letzte ist die Befestigung eines Aminobisphosphonat, Neridronat, die aufgrund ihrer Calciumbindungseigenschaften in unserer Strategie Schlüssel. Aufgrund ihrer natürlichen analogen Pyrophosphat (PPi), Neridronat wurde bei der Behandlung von Osteogenesis imperfecta (OI) und der Paget-Knochenkrankheit (PDB) für ihre hohe Affinität zu Knochenmineral verwendet. ^11-13

Die drei Schritte des Protokolls sind in Schema 1 zusammengefasst ersten und zweiten Stufen durchgeführt werden Mikrowellentechnik. Erster Schritt bereitzustellen Ölsäure überzogenem Eisenoxid - Nanoteilchen (OA-IONP) durch eine Modifikation der veröffentlichten Verfahren. ¹⁴ Das Protokoll ist eine Anpassung an Mikrowellensynthese des traditthermische Zersetzung ional Synthese. ^15,16 Eine Mischung , die Fe (acac) _3, Ölsäure, Oleylamin und 1,2-Dodecandiol wird in Benzylalkohol gelöst und bei zwei Erwärmungsverfahren unterworfen. Reinigung wird durchgeführt, mit EtOH gewaschen und Sammeln der Teilchen mit einem Nd-Fe-B-Magneten um den Überschuss an oberflächenaktiven Mitteln in dem Überstand zu entfernen. Dann OA-IONP in CHCl ₃ stabilisiert. Wie erwartet, aufgrund der sehr schnelle Erwärmung, zeigte die erwarteten Ergebnisse, dass die durch Mikrowellen kleiner synthetisierten Nanopartikel in Form von Kern (3,7 ± 0,8 nm) und hydrodynamischen Größe (7,5 nm) im Vergleich zu herkömmlichen thermischen Zersetzung; jedoch Nanopartikel noch eine hervorragende Kristallinität präsentieren.

Der zweite Schritt besteht in einer direkten chemischen Modifikation der Doppelbindung, die in der Ölsäure, ein starkes Oxidationsmittel wie KMnO ₄ unter Verwendung der ursprünglichen Methode entwickelt , in unserer Gruppe für MW Bedingungen geändert wurde.17 Eine erste Stufe bildet , die Komplexe zwischen MnO ₄ ^- und die Doppelbindung. Dann wird eine zweite Stufe in sauren Bedingungen produzieren die Spaltung des Moleküls Ölsäure Azelainsäure-IONP geben. Nach diesen zwei Stufen von 9 min jedem wird die Probe gereinigt, zuerst Waschen mit NaHSO ₃ 1% des Überschusses an MnO ₄ zu reduzieren ^- zu MnO ₂ und dann mit NaOH 1% zu neutralisieren , um die Säure.

Nach dem Reinigungsschritt, Azelain--IONP werden in 10 mM Phosphatpuffer pH = 7,2 stabilisiert. Dieser Puffer ist die beste Umgebung für die kolloidale Stabilität der Teilchen in ähnlicher Weise zu dem, was in der ursprünglichen, thermische Reaktion geschah. ¹⁸ die Verwendung von Mikrowellen für die direkte Oxidation der Doppelbindung enthalten in OA-IONP ist ein sehr gutes Beispiel für die Vorteile dieser Technik bei der Synthese von Nanopartikeln. Bei der klassischen Methode die Reaktion 24 Stunden dauert, nimmt die Nutzung von Mikrowellen die Reactipünktlich zu 18 min. Darüber hinaus zeigt die Mikrowellen-unterstütztes Protokoll eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit Nanopartikeln mit 30 ± 5 nm der hydrodynamischen Größe nach 4 Wiederholungen gibt. Neben der Änderung der hydrodynamischen Größe ist das Zeta-Potential ein guter Parameter, um schnell die erfolgreiche der Reaktions überprüfen. Aufgrund des Vorhandenseins der neuen Carboxylgruppen in Azelaic-IONP, ist der Wert für das Zeta-Potential -44 mV herum, sehr ähnlich dem Wert, der durch die thermische Ansatz erhalten.

Zur Befestigung von Neridronat zu Azelaic-IONP, traditionelle EDC / Sulfo-NHS Konjugation verwendet wird. ¹⁹ Dieser Syntheseansatz ist gut etabliert , da unter Verwendung eines aktivierten Carboxylats mit dem Sulfo-NHS gewährleistet kolloidale Stabilität während der Reaktion. Nach der Eliminierung von Phosphatpuffer die Reaktion mit Neridronat wird in 1 mM HEPES-Puffer (pH ~ 7) durchgeführt. Die Reaktion macht Neridronat-IONP mit einem hydrodynamischen Größe von 40 ± 4 nm in einer engen Größen distribution und -24,1 mV von Zeta-Potential.

Das Verfahren ist für die schnelle Synthese von IONP für in vivo Visualisierung von atherosklerotischen Plaques beschrieben , obwohl die Durchführbarkeit des Verfahrens die Befestigung jedes Peptid / Antikörper mit freien Aminen ermöglicht, die gleichen Bedingungen verwendet, für verschiedene Zwecke innerhalb der T ₂ -gewichteten MRT - Kontrastmittel Feld.

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Vorbereitung 1 mM HEPES-Puffer, 23,8 mg HEPES in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Den pH-Wert auf 7.
2. Herstellung von 10% NaHSO ₃ Auflösen von 10 g NaHSO ₃ in 100 ml destilliertem Wasser. Rühre das Gemisch 15 min.
3. Bereiten NaOH Lösung Lösen von 1 g NaOH in 100 ml Wasser. Man rührt 10 min.
4. Herstellung von 10 mM Phosphatpuffer , 600 mg NaH ₂ PO ₄ in 1 l Wasser auflöst. In sorgfältig 0,34 ml Phosphorsäure und Rühren für 30 min. Stellen Sie den pH-Wert auf 2,9 (Akzeptanzbereich 2,7-3,0).
5. Den pH - Wert auf 7.2 Herstellung von 10 mM Phosphatpuffer , 269 mg NaH ₂ PO ₄ und 1,09 g Na ₂ HPO ₄ zu destilliertem Wasser gelöst wird ein Volumen von 1 l zu machen.

2. Synthese von Oleic Acid beschichtete Nanopartikel (OA-IONP)

1. In einem Mikrowellen angepasst Kolben mit 0,5 g Fe (acac) _3, 1,4 ml Oleic Säure, 0,6 ml Oleylamin und 1,19 g 1,2-hexadodecanediol. 10 ml Phenylether vorsichtig durch die Kolbenwand eine Messpipette.
2. Führen Sie den Kolben in den Mikrowellenreaktor und starten Sie das Mikrowellen Protokoll.
   HINWEIS: Mikrowellen-Software ermöglicht es, die Größe für verschiedene Parameter wie Temperatur, Druck, Rühren Geschwindigkeit, Leistung und Reaktionszeit zu wählen. Darüber hinaus hat er die Möglichkeit, drei verschiedene Stufen in dem gleichen Protokoll zu laden abstimmbaren Synthese ermöglicht. Sobald die geladene synthetische Protokoll beginnt, erwärmt Mikrowellen die Probe so schnell wie möglich (Ramping-Prozess) und hält sie während der gewählten Reaktionszeit (Laufverfahren). Wahl der Leistung bestimmt die Zeit von Ramping.
3. Legen Sie eine dynamische Studie in der Mikrowelle. Das Protokoll enthält drei Phasen:
   1. Stufe 1: Stellen Sie die Temperatur auf 60 ° C, Zeit 2 min, Druck 250 psi und 150 W Leistung. Stir Geschwindigkeit hat in hoher Position und maximale Leistung in auf zu sein.
   2. Hirsche 2: die Temperatur auf 200 ° C, Zeit 20 min, Druck 250 psi und 300 W Leistung eingestellt. Stir Geschwindigkeit hat in hoher Position und maximale Leistung in auf zu sein.
   3. Stufe 3: Stellen Sie die Temperatur auf 250 ° C, Zeit 10 min, Druck 250 psi und 300 W Leistung. Stir Geschwindigkeit hat in hoher Position und maximale Leistung in auf zu sein.
4. Nach der Protokoll Schlichten, kann der Kolben bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
   HINWEIS: Kühlphase mit oder ohne Gasstrom durchgeführt werden kann. Beide Fälle liefern dieselben Ergebnisse. Aggregate werden in der Rührstab und in der Wand des Kolbens, waschen Sie es mit EtOH und auf den Erlenmeyer setzen.
5. Übertragen Sie das Reaktionsgemisch in einen Erlenmeyer mit einer Glaspipette und 10 ml EtOH 98%. Setzen Sie ein Nd-Nb-B-Magneten unter dem Kolben, warten Sie 5 Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Glaspipette.
6. In 10 ml EtOH, beschallen die Probe bei RT für 2 Minuten und 40 kHz, legen Sie die Probe auf den Magneten und die Beseitigung der Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt bei least dreimal.
7. Disperse Öl Nanopartikel in 30 ml CHCl ₃ und beschallen bei 40 kHz für 5 min bei RT. Schauen Sie sich die hydrodynamischen Größe in der Zetasizer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Setzen 0,5 ml OA-IONP in der Glasküvette und fügen Sie 0,5 ml CHCl _3. Akzeptanzbereich 7-10 nm, ausgedrückt als Z-Durchschnittsgröße in der Intensität.
   HINWEIS: OA-IONP können in Hexan gut dispergiert werden.

3. Synthese von Azelainsäure Nanopartikel (Azelainsäure-IONP)

1. Man löst 44,3 mg KMnO ₄ und 150,4 mg BTACl in einem Gemisch aus H ₂ O: CHCl ₃ (3: 2 ml). Fügen Sie die resultierende Lösung in ein 5 ml Aliquot von OA-IONP im Mikrowellenkolben angepasst.
2. Starten Sie das Mikrowellen Protokoll für Azelainsäure-IONP. Eingestellte Temperatur bei 105 ° C, Zeit 9 min, der Druck 250 psi und Leistung bei 300 W. Setzen 10 ml Phosphatpuffer pH = 2,9, in den Kolben und wiederholen Sie die Mikrowellen Protokoll. Nach dem Schritt Abkühlen erholen, die Nanopartikelunter Verwendung eines Magneten und den Überstand entfernen.
3. 5 ml 10% NaHSO ₃ in einen Erlenmeyerkolben, beschallen bei 40 kHz für 2 min bei 25 ° C, zu sammeln , die Partikel unter Verwendung eines Magneten und den Überstand entfernen. (Der Schritt wird 2-mal wiederholt.) Waschen der Nanopartikel noch dreimal mit 1% NaOH und schließlich wieder zu dispergieren sie in 5 ml Phosphatpuffer pH = 7,2.
4. Schauen Sie sich die hydrodynamische Größe und Zeta-Potential. Setzen 0,7 ml Azelaic-IONP in die Einweg-Kapillar-Zelle gefaltet und legen Sie es auf den Zetasizer.
   HINWEIS: Akzeptanzbereich für Größe 25-35 nm als Z-Durchschnittsgröße in der Intensität ausgedrückt. Akzeptanzbereich für Z-Potential -45 ± 5 mV. Größere Nanopartikel (~ 70 nm) mit Phosphatpuffer pH> 7 statt pH = 2,9 (ref Chem Eur J 2008) erhalten werden.

4. Synthese von Neridronat Nanopartikel (Neridronat-IONP)

1. Hinzufügen 12 mg EDC und 15 mg Sulfo-NHS in einer Zentrifuge mit 2 ml Aliquot von Azelainsäure-IONP. Stellendas Gemisch in einem Vortex bei RT für 35 min.
2. Setzen Sie ein Magnet unter der Zentrifuge, die Nanopartikel zu destabilisieren, den Überstand aspirieren und waschen Sie die Partikel mit 1,5 ml HEPES 1 mM pH = 7 Puffer. (Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.) Danach werden 5 mg Neridronat und schütteln Sie die Mischung in einem Wirbel für 2 Std.
3. Separate Nanopartikel mit einem Magneten und Waschen (3 x 2 ml) mit 1 mM HEPES pH = 7 Puffer. Neridronat-IONP in 2 ml 1 mM HEPES-Puffer pH = 7 schließlich dispergieren.
4. Schauen Sie sich die hydrodynamische Größe und Zeta-Potential. Setzen 0,7 ml Neridronat-IONP in die Einweg-gefalteten Kapillarzelle und legen Sie es auf die Zetasizer (Geräte-Setup sehen).
   HINWEIS: Akzeptanzbereich für Größe 40-45 nm als Z-Durchschnittsgröße in der Intensität ausgedrückt. Akzeptanzbereich für Z-Potential von -20 ± 5 mV.

5. In - vivo - Nachweis von Atherom Plaque in ApoE ^{- / -} Mäuse von MRI

1. Vorbereitung für die MRI-Akquisition
   HINWEIS: Mehrere Extra-Systeme für Tierversuche erforderlich sind. Es wird also erforderlich:
   1. Verwenden Sie geeignete Ausrüstung, um die Tiere zu betäuben.
   2. Besorgen Sie sich einen geschlossenen Kreislauf zirkulierenden Warmwassersystem mit einem externen Warmluft die Temperatur des Tieres stabil zu halten.
      HINWEIS: In diesem Fall wird die MRI kompatiblen Überwachung und Gating-System registriert die Temperatur des Tieres innerhalb des MRI-Magneten.
   3. Überwachen Sie die Außentemperatur in der Nähe des Tieres, der Körper (Rektalthermometers) Temperatur des Tieres, der Atmungssensor unter dem Körper des Tieres in der Nähe des Thorax befindet sich eine integrierte Schnittstelle in der MRI-Konsole.
2. MRI-Experiment
   1. Anästhesieren, die Tiere mit Isofluran verdampft (2% für die Induktion während zwei bis drei Minuten und 1-1,5% für die Wartung während des Experiments MRI) mit einem 100% Sauerstoffleitung.
   2. Legen Sie das Tier in der Mitte des Magneten mit Hilfe eines Profilerfassung.
   3. Nach dem Schritt 5.2.2, tune die HF-Spule auf 300 MHz (7 T) Resonanzfrequenz und entsprechen der charakteristischen Impedanz der Spule 50 Ohm für einen optimalen Signalempfang.
      HINWEIS: Achten Sie auf die externe Verkabelung und Anbindung an das Messsystem über den Adapter / Splitter individuell auf jeden Teil der Sendespule gehen (in unserem Fall war es eine Quadratur-Spule).
   4. Nach der Einstellung der und um die Spulen passende, stecken die Spulen in den Scanner.
   5. Für HF-Impuls Kalibrierung (Form und Länge) und Mittenfrequenzjustierschaltung führen sowohl Impuls Kalibrierung und das Zentrum der Frequenz manuell. Führen Sie die 90 ° Impuls Kalibrierung, grob Shim (siehe unten), Mittenfrequenz und Empfänger Verstärkungseinstellungen manuell.
   6. Führen Sie genaue Position eines Gradienten-Echo mit (FLASH oder GRE) Localizer-Scan (3 Ebene Scout Erfassung: axial, koronal und sagittal, auch genannt TriPilot.
   7. Führen Sie den Magneten Shim die Magnetfeldhomogenität im cen zu optimierenter des Magneten. Führen Sie diesen Schritt manuell (siehe 5.2.3) unter Verwendung eines ein oder Einzelimpuls FID-Sequenz und stellen Sie die erste und die zweite Aufträge Unterlegscheiben oder jede automatische Shim-Sequenz im System
      HINWEIS: Ein gut unterfüttert Magnetfeld wird durch die T2 * (als größer, desto besser) oder schmalen FWHM der Spektren leicht erkannt und gemessen werden.
3. MRI - Datenerfassung der Plaque ⁵
   1. Inject 100 ul (1 mg [Fe] ml ^-1) von Neridronat Nanopartikel intravenös in die Schwanzvene und Bilder aufzunehmen , 1 Stunde nach der Injektion. Legen Sie die Parameter für die MRI-Akquisition von atherosklerotischen Plaques an der Bauchaorta suchen (renale Bifurkation).
   2. Setzen Sie Multi-Slice, 10 bis 20 Scheiben in Verschachtelungsmodus Artefakte zu minimieren.
   3. Erwerben Sie hochauflösende Fast-Spin-Echo-T1-gewichteten MRT in koronalen oder axialen Ansicht mit den folgenden Parametern: FOV 60 x 30 mm (koronale), 30 x 30 mm (axial), Dicke 0,8 mm in Scheiben schneiden (mit dem kleinen Gradientenspule configuration dies kann auf 0,6 mm reduziert werden), 400 ms TR, 8 msec TE, 256 x 256 Erfassung und Rekonstruktion Matrixdaten, 6 (große Steigung) bis 8 (kleine Steigung) Signalmittelwerte für 5-8 min durchschnittliche Akquisitionszeiten.
      HINWEIS: TE ist besonders kritisch, und das Vorhandensein von Blut Signal und Strömungs- und chemische Verschiebung Artefakte, die die Anwendungen begrenzen. In diesen Fällen fließen unempfindlich schnelle Spin-Echo-T2-IR-Artefakte zu reduzieren helfen können und die Akquisition von komplementären Daten in genau der gleichen Stelle helfen können, um die Plaque zu charakterisieren. Zusätzlich kann eine Vorsättigung Puls das Fett umgebenden Gewebes der Arterienwand zur besseren Abgrenzung von der äußeren Begrenzung der Wand und der chemischen Verschiebung Artefaktreduktion zu reduzieren verwendet werden.
   4. Übertragen Sie die Bilder in einem Standardformat wie Dicom und Blick in geeigneten Software (zB Osirix Imaging Software oder AMID: Medical Imaging Data Examiner) unter Verwendung von ^5. Quantifizierung der Kontrastwirkung manuell ves begrenzensel Bereich, Wandstärke, Lumenfläche und Plaque - Last ^5.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wird die Synthese von drei verschiedenen IONP beschrieben. Ausgehend von hydrophoben OA-IONP wässrige stabile Nanopartikel werden mit Hilfe von Mikrowellengesteuerten Synthese erhalten. Alle Nanopartikel präsentiert ultrakleine hydrodynamischen Größe (AVW <50 nm) in einer sehr engen Größenverteilung (Abbildung 1c). Die Verwendung von Mikrowellentechnologie macht ultra-kleine Nanopartikel im Hinblick auf die Kerngrößen. Da Mikrowelle eine schnelle E...

Diskussion

Eisenoxid-Nanopartikel (IONP) sind eine der wichtigsten Nanomaterialien und es hat sich für verschiedene Anwendungen vor langer Zeit verwendet worden. Die Verwendung dieser Materialien als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein gut eingeführtes Gebiet. Allerdings nehmen die Synthesewege oft mehrere Zeit und die Einstellung ist kompliziert. Aufgrund dramatisch Reaktionszeiten zu reduzieren und verbessert die Reproduzierbarkeit scheint die Verwendung von Mikrowellengesteuerten Synthese eine gute Al...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikrowellen-Explorer/Entdecken Sie Hybrid-12	CEM Corporation, USA		Jede Mikrowelle für die chemische Synthese kann verwendet werden
Einweg-PD-10-Entsalzungssäulen	GE Healthcare life sciences	17-0851-01	Ausschlussspalten jeder Größe funktionieren Amicon
® Ultra-0,5 ml	Merck Millipore Ltd
Kalibriertes pH-Messgerät	SI-Analytik	285105127
Neodym-Magneten	Aiman Gz	ND010B
Vortex Genius 3	IKA	3340000
ZetaSizer Nano ZS	Malvern Instruments
Standard (Makro) Zelle Optisches Glas	Labbox	11718
Zetasizer Nanoserie Einweg gefaltete Kapillarzellen DTS1070	Malvern
Bruker Minispec mq60	Bruker