Methodenartikel

Die Herstellung von Baumwolle Analytische Geräte

DOI:

10.3791/53480

⸱

30. August 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Department of Ophthalmology, Taichung Veterans General Hospital, 3Department of Engineering and System Science, National Tsing Hua University, 4Institute of Biomedical Engineering, National Tsing Hua University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um einfache Herstellungsansätze für mehrere Assay-Anforderungen zu untersuchen, haben wir ein flüssigkeitsabsorbierendes Kanalsystem aus Baumwollmaterial entwickelt. Dieses Gerät wurde verwendet, um eine Mehrfachnachweisplattform einzurichten und Kontaminationsprobleme zu lösen, die häufig biomedizinische Geräte auf Lateral-Flow-Basis betreffen, für die klinische Urinanalyse von Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine robuste, kostengünstige Analysegerät sollte benutzerfreundlich, schnell und erschwinglich sein. Solche Geräte sollten auch in der Lage sein, mit knappen Proben zu betreiben und Informationen für die Behandlung Follow-up zur Verfügung stellen. Hier zeigen wir die Entwicklung eines auf Baumwollbasis Harnanalyse (dh, Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Assays) analytisches Gerät , das eine Lateral - Fluss-basiertes Format verwendet, und kostengünstig ist, leicht hergestellt, schnelle und verwendet werden kann zur Durchführung mehrere Tests ohne Kreuzkontamination Sorgen. Baumwolle wird mit natürlichen Absorptionseigenschaften von Zellulosefasern bestehen, die für die Flow-basierte Analyse genutzt werden können. Die einfache, aber elegante Herstellungsprozess unserer Baumwollbasis Analysegerät wird in dieser Studie beschrieben. Die Anordnung der Baumwollstruktur und Test-Unterlage nutzt die Hydrophobizität und Absorptionsstärke jedes Material. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften können farbmetrischen Ergebnisse beharrlich auf die Probe haftenPad. Dieses Gerät ermöglicht es Ärzten, klinischen Informationen in einer angemessenen Weise zu empfangen und zeigt ein großes Potenzial als Instrument für frühzeitiges Eingreifen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entwicklung von Point-of-Care (POC) Diagnose - Geräte , die erschwinglich, robust und leicht verwendet zur Verbesserung der globalen Gesundheit 1,2 zwingend notwendig ist. Insbesondere bestehen Geräte aus Cellulosesubstraten (zB Papier, Faden und Baumwolle) bieten vielversprechende analytische Plattformen für Low-Cost - Analyse wegen ihrer Allgegenwart, Erschwinglichkeit, einfache Bedienung, Robustheit und Kapazität 3-7 schnelle Ergebnisse zu liefern.

Hier präsentieren wir die Entwicklung eines Baumwollbasierten Analysegerät, der eine Lateral-Flow-basierten Format verwendet zur Urinanalyse. Diese Baumwolle-basierte Analysegerät stellt einen alternativen Nachweis Ansatz mit mehreren wichtigen Vorteile: i) Herstellung mit minimaler menschlicher Anstrengung; ii) niedrige Kosten; iii) die Fähigkeit, werden verwendet, um mehrere verschiedene Assays ohne Kreuzkontamination betrifft zuführen; . iv) Geräteunabhängigkeit, dh die Fähigkeit , ohne zusätzliche Geräte und / oder Strom betrieben werden; und, v) Geschwindigkeit (kolorimetrische Assays können innerhalb von 10 min) durchgeführt werden.

Die Struktur dieser Baumwollbasis Analysegerät kann in vier Teile unterteilt werden: i) Baumwolle, die auf ihrer äußeren hydrophoben Schicht natürlich hydrophob ist; ii) Baumwolle, die intern hydrophil ist, und dient als ein Transportkanal für Flüssigkeit wicking; iii) Laminieren Film, bindet und komprimiert die Baumwolle verwendet werden, sondern enthält Löcher für die Platzierung von Reaktions- / Test-Pads herausgebohrt; und iv) Chromatographiepapier Testpads, die beschichtet sind / eingebettet mit reaktiven Reagenzien, auf der äußeren Oberfläche der Baumwolle gelegt (insbesondere in dem Raum aus dem Laminatfilm gebohrt) als Reaktionsbereiche für kolorimetrische Assays (dh, Nitrit, Gesamtprotein, pH-Wert und Urobilinogen-Assays) und Ergebnisanzeige.

Der zugrunde liegende Mechanismus des Tests ist wie folgt. Die Baumwolle-basierte Analysegerät ist mit Linien erzielt, die auf halbem Weg durch den Abt eindringenh des Baumwollmaterial einen Strömungskanal zu schaffen, die Probenflüssigkeit erlaubt die reaktiven Pads zu erreichen ist. Die Absorptionskante des analytischen Hilfsmittels in die Zielprobe eingetaucht, worauf die Lösung entlang der Fluid - Kanal aus dem Absorptionsende zu den Prüfkontaktflächen (Abbildung 1) Losen ist. Weil die Absorptionsstärke der Test-Unterlage ist größer als die aus Baumwolle, die von den Test-Pads absorbierten Lösungen sind fest innerhalb der Test-Unterlage Papier enthalten, so daß es keine Reflow zurück in den Fluidkanal ist, und die farbmetrischen Ergebnisse sich in der Folge auf der festen Testkissenmaterial. Am Ende der Reaktion kolorimetrischen Ergebnisse werden über einen Desktop-Scanner erfasst und mittels Bildanalysesoftware analysiert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACHTUNG: Die richtige Laborhygienepraxis ist nicht erforderlich. Handschuhe und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen erforderlich sind, wenn diese POC-Gerät. Verunreinigung von Ergebnissen oder Infektion kann auftreten, wenn eine ausreichende Sterilisationsverfahren sind nicht richtig durchgeführt wird.

1. Bereiten Sie den Teststreifen-Geräte

  1. Bestimmung der Hydrophobizität der Außenschicht des Reinigungs Baumwolle durch Kontaktwinkelmessung 8 (Figur 3).
  2. Fabrizieren die Baumwollbasis analytischen Hilfsmittels durch Schneiden Reinigungs Baumwolle in 5,5 cm x 1 cm - Stücke mit einem Papierschneider (2A).
  3. Die Bohrungen (ø = 0,5 cm) in einem Standard-Blatt Laminierungfilm in Reihen von drei; der Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Löchern ist 1 cm.
    HINWEIS: Nicht weniger als 36 einzelne Teststreifen mit drei Testflächen jeweils hergestellt werden , um ein Standardblatt Laminierfolie (5,5 cm x 2 cm) (2B) verwendet wird .
  4. Sandwich die Reinigung Baumwolle (characterized durch äußere Hydrophobizität und Innen Hydrophilie) zwischen zwei Stücken Laminierungfilm, dh das Loch gebohrt Blatt Laminierungfilm auf der einen Seite, und ungebohrter Blatt Laminierungfilm (ohne Löcher) auf der anderen Seite. Platzieren der Anordnung in einem Laminator die Vorrichtung zu verpacken. Dies erhöht die mechanische Festigkeit des Geräts und bietet eine externe, undurchlässige Schicht.
    HINWEIS: Die Durchmesser der Löcher von 0,5 cm schrumpfen auf ~ 0,47 cm nach der Laminierung. Einige geringfügige Lücken zwischen der Reinigung Baumwolle und Laminierungfilm um den Umfang jedes Lochs verbleiben. Diese geringfügige Lücken erleichtern die Platzierung von Testfeld Kreise in einem nachfolgenden Schritt.
  5. Verwenden Sie ein Paar Schereneinzel 5,5 cm x 1 cm Teststreifenvorrichtungen von der Baugruppe zu schneiden, dh das gebohrte Lamellenblechart / Wattepad / ungebohrter Lamellenblechart "Sandwich" (Abbildung 2C). Machen Sie 48 Geräte Standardkurven zu erstellen insgesamt wie später beschrieben wird (18 Gerätefür die Nitrit-Test, 15 Geräte für den BSA-Test und 15 Geräte für den Urobilinogen-Test).
  6. Mit einem scharfen Messer oder einer Rasierklinge einen Schlitz (als kleiner fluidischen Kanal) von der Mitte eines jeden Testbereich (nicht abgedeckt durch Laminieren Film) zu schneiden, über und durch die hydrophobe Schicht von Testfläche auf der hydrophilen Schicht der Längsvorrichtung, wobei vorsichtig Hälfte der Tiefe der sandwichartig Einrichtung (2D) zu schneiden.
  7. Anwenden Papier Prüfkontaktflächen (ø = 0,5 cm) , indem sie in die Zwischenräume am Umfang jedes Lochs in der Laminierungsrichtung (2E) gleitet.

2. Bereiten Sie Standards und Indikatorlösungen für Urinalysis

  1. Bereiten 10,0 mM Nitrit Stammlösung durch Auflösen von 69,0 mg Natriumnitrit in 100 ml entionisiertes (DI) Wasser. Verdünnen Sie die Nitrit - Stammlösung in DI - Wasser eine Reihe von Nitrit - Konzentration Standardlösungen zu schaffen (2500, 1250, 625, 312, 156 und 78 & mgr; M) (Abbildung4A).
  2. Vorbereitung 60 uM Rinderserumalbumin (BSA) Stammlösung durch Auflösen von 415 mg BSA in 100 ml PBS-Lösung (10 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,0). Verdünne die BSA - Stammlösung in entionisiertem Wasser eine Reihe von BSA - Konzentration von Standardlösungen zu schaffen (30, 15, 7,5, 3,75 und 1,875 & mgr; M) (4B).
  3. Bereiten Sie 25 g / L urobilinogen Stammlösung durch Auflösen von 2,5 g Urobilinogen in 100 ml VE-Wasser. Verdünnen Lager urobilinogen Lösung in VE - Wasser eine Reihe von Urobilinogen Konzentration Standardlösungen zu schaffen (7,8, 15,6, 31,2, 62,5 und 125 mg / L) (4C).
  4. Bereiten Nitrit Indikatorlösung, die 50 mM Sulfanilamid, 330 mM Citronensäure und 10 mM N- (1-Naphthyl) ethylendiamin-dihydrochlorid.
  5. Bereiten BSA-Indikatorlösung, die 250 mM Citrat-Pufferlösung (pH 1,8) und 3,3 mM Lösung von Tetrabromphenolblau in 95% Ethanol.
  6. Bereiten Sie urobilinogen Indikatorlösung 0,1 M 4-Dimethylamine Benzaldehyd enthalten.

3. Bereiten Sie Indikator-Pads

  1. Cut drei kreisförmige Kissen oder Scheiben (ø = 0,5 cm) aus der Chromatographie Papier und legen Sie jede von ihnen (eine für jeden Test auf dem Drei-Teststreifen) auf jedem Teststreifen-Gerät eine Lösung Standardkurve (Abschnitt 4) zu erstellen.
  2. An jedem der drei Laminierungfilm Löcher der Montage, eine kleine Lücke zwischen dem Laminierungfilm beobachten und den Baumwolltestfeld an den äußersten Rand des geschnittenen Loch. Beachten Sie, das Loch in der Laminierfolie ist im Durchmesser etwas kleiner als die Papiertestkissen.
    HINWEIS: Zusammen stellen diese Funktionen ermöglichen es dem Papier Testkissen gegen das Testfeld Teil der Vorrichtung Baumwolle angewandt werden , so dass die Ränder des Papiers Testfeld Schlicker in die schlanke Lücke erwähnt, dh unter den Rändern des Laminierungfilm Loch. Dies hält die Papier Test-Pads an Ort und Stelle.
  3. Bereiten Sie die Nitrite Assay Teil der Vorrichtung.
    1. Bestreichen Sie die Nitrit-Assay-Pad mit 4 ul Nitrit Indikatorlösung (hergestellt in Schritt 2.4) und lassen Sie es vollständig bei Raumtemperatur trocknen.
  4. Bereiten Sie die Gesamtprotein-Assay Portion der Erfassungsvorrichtung.
    1. Coat die Gesamtproteinassay-Pad mit 4 & mgr; l BSA-Indikatorlösung (hergestellt in Schritt 2.5) und ermöglichen es vollständig bei Umgebungstemperatur trocknen.
  5. Bereiten Sie die Uroblinogen Assay Portion der Erfassungsvorrichtung.
    1. Mantel der uroblinogen Assay-Pad mit 4 ul uroblinogen Indikator (hergestellt in Schritt 2.6) und lassen Sie es vollständig bei Raumtemperatur trocknen.

4. Erstellen von Standardkurven für die Cotton-basierte Analysegerät

  1. Für jeden Standard vorbereitet, tauchen die Absorptions Ende eines vorbereiteten Gerät (mit Test Indikatoren vorbelastet (Abschnitt 3.4) zu sehen) in die Standardlösung für 10 sec (das Absorptionsvolumen ~200-300 ul) (2F).
  2. Legen Sie die Baumwolle-basierten Gerät in einer Umgebung für 10 min kolorimetrischen Reaktionen (2F) zu vervollständigen. Wiederholen Sie jede Experiment in dreifacher Ausfertigung.
  3. Scannen Sie das Gerät die kolorimetrische Änderung zu analysieren an jedem Testfeld auftritt (2G). Ort resultierenden Testflächen auf dem Glas eines Desktop-Scanner und Scan-Test-Pads in RGB-Modus mit 600 dpi der Bildauflösung. Speichern Sie jedes Bild im JPEG-Format.
  4. Analysieren des gescannten Bildes auf einer Computerbildanalysesoftware unter Verwendung der jeweiligen Farbintensitäten (Figur 2H) , um zu bestimmen.
    1. Download von ImageJ Software bei http://imagej.nih.gov/ij/. Öffnen Sie die gescannten Bilddateien. Wählen Sie das Bild in den Menübefehlen, und wählen Sie "Type" in RGB-Bilder in 8-Bit Graustufen umwandeln.
    2. Verwenden Sie das "Oval" in der Werkzeugleiste das Testfeld Analysebereich zu wählen. Wählen Sie "Analysieren" im Menü commands, und wählen Sie "Messen" Farbintensität zu analysieren. Nehmen mittlere Intensität Ergebnisse.
  5. Stellen Sie die Standardkurven von Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Assays (2I).
    1. Zeigen verschiedene Konzentrationen von Standard Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Lösungen und korrelierte mittlere Intensität Ergebnisse auf einem zweidimensionalen Koordinatensystem stastical Software.
    2. Den Standardkurve für einen Nitrit-Assay durch ein quadratisches Modell und die Standardkurven für Gesamtprotein und Urobilinogen Assays durch lineare Regressionsmodelle.

5. Bestimmen Unbekannte Probenkonzentrationen mit etablierten Standardkurve Werte

  1. Um zu bestimmen, Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Konzentrationen in unbekannten Lösungen, verwenden Sie das Gerät wie zur Messung Standardlösungskonzentrationen und Ersatz gemessene Intensität Ergebnisse für Nitrit, Gesamtprotein beschrieben, und urobilinogen Assays in die Gleichungen der integrierten Modelle in Schritt 2 aus.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben gezeigt , erfolgreich die Entwicklung von Baumwolle-basierten Analysegeräte von durch hydrophile (inneren Teil) und hydrophoben (Außenbereich) Eigenschaften (1A) gekennzeichnet kommerziell erhältliche Reinigungs Baumwolle verwenden. 3 sind die Ergebnisse der Kontaktwinkelmessung zeigt. Die hydrophobe Oberfläche von außen Baumwolle war 127,35 ° ± 4,73 °. Von einer benutzerfreundlichen Perspektive hier verwendeten farbmetrischen Assays direkt mit...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische Schritte in diesem Protokoll enthalten, die geeignete Kombination aus Baumwollmaterial zu bestimmen (mit unterschiedlicher Hydrophobizität / Hydrophilie) und Filterpapier (Chromatographie Filterpapier oder quantitative Filterpapier). Eine gut geplante und durchgeführte Gerätedesign macht die beste Leistung für kolorimetrische Assays Attribute. Aus unserer Farbtestergebnisse, die auf Baumwollbasis hier vorgestellten Analysegerät zeigt großes Potenzial als Plattform für mehrere Krankheitserkennung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. S.C.L., C.M.K., F.G.T. und C.M.C. sind Erfinder eines Patents (Patent Nr.: US 8691162 B1), das der National Tsing Hua University auf der Grundlage der in diesem Manuskript berichteten Arbeiten gehört. S.C.L., C.M.K., F.G.T. und C.M.C. haben Patente in Taiwan und China angemeldet, die auf den in diesem Manuskript berichteten Arbeiten basieren. M.Y.H. erklärt keinen potenziellen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus Taiwan Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)) und Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RinderserumalbuminSigma-Aldrich, USNr. 9048468≥ 99%
Nitrit Sigma-Aldrich, USNr. 7632000&ge&ge> 99%
Urobilinogen Santa Cruz Bio, US-Nr. SC-296690
CitratSigma-Aldrich U.S. Nr. 6132043≥ 99%
TetrabromphenolblauSigma-Aldrich U.S. Nr. 4430255≥ 99%
SulfanilamidSigma-Aldrich U.S. Nr. 63741≥ 99%
Zitronensäure Sigma-Aldrich U.S. Nr. 77929≥ 99,5%
  N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-dihydrochloridSigma-Aldrich U.S. Nr. 1465254≥ 98%
4-(Dimethylamin)benzaldehydAlfaAesar, U.S. Nr. A11712≥ 98%
Methylrot-Natriumsalzsigma, U.S. Nr. 114502≥ 95%
BromthylblauSigma, US-Nr. 114413≥ 95%
Shiseido ReinigungsbaumwolleShiseido, JapanNr. 79014
ChromatographiepapierGE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UKNr. 30306132
, MASA4216 mm x 303 mm
ScannerMicrotek Scanmaker  i2400
PapierschneiderLife PapierschneiderNr.306
LaminiergerätAURORA 
KaschierfolieUNI LAMI4A
Kunststoffsubstrat-LaminierfolieLM4231H

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
  2. Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
  3. Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
  4. Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105(2011).
  5. Lin, S., et al. Cotton-based Diagnostic Devices. Scientific reports. 4, 6976-6976 (2013).
  6. Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
  7. Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
  8. Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
  9. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
  10. Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
  11. Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R. Understanding Urinalysis. medscape. 7 (3), 269-279 (2012).
  12. Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
  13. Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
  14. Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
  15. Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Cotton Analytical DeviceLateral Flow AssayContact Angle MeasurementLamination Film PackagingChromatography Paper DiscsColorimetric Reaction AnalysisImageJ SoftwareLimit Of DetectionUrinalysis Strip FabricationHydrophobic Interface Testing

Verwandte Artikel