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Methodenartikel

Seitenwurzel induzierbaren Systems in

13.8K Ansichten

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DOI:

10.3791/53481

⸱

14. Januar 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Systems Biology, VIB, Ghent, 2Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Lateral Root Inducible System (LRIS) ermöglicht die synchrone Induktion von Seitenwurzeln und wird für Arabidopsis thaliana und Mais vorgestellt.

Zusammenfassung

Die seitliche Wurzelentwicklung trägt wesentlich zum Wurzelsystem bei und ist daher entscheidend für das Pflanzenwachstum. Die Untersuchung der lateralen Wurzelinitiierung ist jedoch mühsam, da sie nur in wenigen Zellen innerhalb der Wurzel und auf unvorhersehbare Weise stattfindet. Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein Lateral Root Inducible System (LRIS) entwickelt. Durch die nachfolgende Behandlung der Sämlinge mit einem Auxin-Transporthemmer und einem synthetischen Auxin erfolgt eine hochgradig kontrollierte laterale Wurzelinitiierung synchron in der Primärwurzel, was eine reichliche Beprobung eines gewünschten Entwicklungsstadiums ermöglicht. Das LRIS wurde zunächst für Arabidopsis thaliana entwickelt, kann aber auch auf andere Pflanzen angewendet werden. Dementsprechend wurde es für den Einsatz in Mais (Zea mays) angepasst. Es wird ein detaillierter Überblick über die verschiedenen Schritte des LRIS in beiden Werken gegeben. Die Kombination dieses Systems mit vergleichender Transkriptomik ermöglichte es, funktionelle Homologe von Arabidopsis-lateralen Wurzelinitiationsgenen in anderen Spezies zu identifizieren, wie hier für das CYCLIN B1 dargestellt; 1 (CYCB1; 1) Zellzyklus-Gen in Mais. Abschließend werden die Grundsätze diskutiert, die bei der Entwicklung eines LRIS für andere Pflanzenarten zu berücksichtigen sind.

Einleitung

Das Wurzelsystem ist von entscheidender Bedeutung für das Pflanzenwachstum, da es sicherstellt, Verankerung und die Aufnahme von Wasser und Nährstoffen aus dem Boden. Weil die Expansion eines Wurzelsystem stützt sich hauptsächlich auf die Herstellung von Seitenwurzeln, ihre Einführung und Bildung weitgehend untersucht worden. Seitenwurzeln in einer bestimmten Untergruppe von Perizykel Zellen initiiert, die so genannte Gründerzellen 1. In den meisten Dikotyledonen wie Arabidopsis thaliana, sind diese Zellen an den Protoxylem Polen 2 angeordnet, wohingegen in Monokotyledonen wie Mais, werden sie an den Phloem Pole 3 gefunden. Gründer-Zellen werden durch eine erhöhte Auxin Reaktion 4 markiert, gefolgt von der Expression spezifischer Zellzyklusgene (zB CYCLIN B1; 1 / CYCB1; 1), wonach sie eine erste Serie von asymmetrischen anticlinal Divisionen 5 unterzogen werden. Nach einer Reihe von koordinierten Antiklinale und perikline Divisionen wird ein Seitenwurzel Primordium ausgebildet ist, dass schließlich wird als ein hervorutonomous Seitenwurzeln. Der Ort und Zeitpunkt des Seitenwurzel Initiation sind jedoch nicht vorhersehbar, da diese Ereignisse weder reichlich, noch synchronisiert. Dies erschwert die Verwendung von molekularen Ansätzen wie Transkriptomik, um diesen Prozess zu studieren.

Um dies zu bewältigen, wurde ein Seitenwurzel induzierbare System (LRIS) entwickelt worden, 6, 7. In diesem System werden die Sämlinge zuerst mit N-1-Naphthylphthalamidsäure (NPA), der Auxin-Transport und die Akkumulation hemmt folglich blockiert Seitenwurzelinitiations behandelten 8. Durch anschließendes Überführen der Keimling zum Medium, das die synthetischen Auxin 1-Naphthalin Essigsäure (NAA), reagiert die gesamte Perizykel Schicht auf den erhöhten Auxin Ebenen dadurch massiv Induktionsseitenwurzel Einleitung Zellteilungen 6. Als solche führt dieses System, um schnelle, synchrone und umfangreiche Seitenwurzeln Einweihungen, was eine einfache Sammlung von Wurzelproben für eine bestimmte Stufe der späten angereichertral Wurzelentwicklung. Anschließend kann diese Proben verwendet werden, um genomweite Expressionsprofile während der seitlichen Wurzelbildung zu bestimmen. Die LRIS hat bereits bedeutende Wissen über Seitenwurzel Einleitung in Arabidopsis und Mais 9-13, aber die Notwendigkeit ergab, dieses System auf andere Pflanzenarten gelten wird noch deutlicher, da mehr Genome sequenziert werden, und es gibt ein wachsendes Interesse an Wissen, um wirtschaftliche Bedeutung zu übertragen Spezies.

Hier werden die detaillierten Protokolle des Arabidopsis und Mais LRISs angegeben. Als nächstes wird ein Beispiel für die Verwendung des Systems vorgesehen ist, die darstellt, wie Transkriptomik Daten aus dem Mais LRIS gewonnen kann verwendet werden, um funktionelle Homologe, die eine konservierte Funktion während der seitlichen Wurzel Einleitung in verschiedenen Pflanzenarten zu identifizieren. Schließlich Richtlinien, um die LRIS Optimierung für andere Pflanzenarten vorgeschlagen.

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Protokoll

1. Arabidopsis LRIS Protocol

Hinweis: Der Text bezieht sich auf "klein" oder "groß" angelegten Experimenten. Kleinen Maßstab Versuche, wie Markierungslinie Analyse und histologischen Färbung 6, 14, erfordern nur ein paar Proben. Großversuche, wie die quantitative Echtzeit-qRT-PCR, Mikroarrays 9-11 oder RNA-Sequenzierung, erfordern eine größere Menge von Proben. Als solche wird eine Menge von etwa 1000 Sämlinge pro Probe wurde durch Vanneste et al. 11 verwendet, um Mikroarray nach Wurzelsegment Dissektion durchführen.

TAG 1

  1. Sterilisation von Arabidopsis-Samen
    Hinweis: Wählen Sie eine der folgenden Verfahren für die Saatgut Sterilisation. Einer von ihnen ist geeignet für die nächsten Schritte des Protokolls. Gassterilisation (1.1.2) stellt zwei Hauptvorteile gegenüber Flüssigkeitssterilisation (1.1.1): Es dauert weniger Zeit beim Umgang mit einer großen tauber von Saatgut, weil kein Pipettieren muss für die einzelnen Proben auftreten; und die sterilisierten Samen können für einen längeren Zeitraum gelagert werden. Es erfordert jedoch einen Exsikkator und sorgfältige Handhabung.
    1. Flüssigkeitssterilisation
      1. Gießen Sie die gewünschte Anzahl von Samen in Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie bis zu 20 mg (~ 800 Samen) in einem 1,5-ml-Röhrchen oder 40 mg (~ 1600 Samen) in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. 1 ml 70% Ethanol. Invertieren oder schütteln für 2 min.
      3. Ersetzen Sie die 70% Ethanol mit 1 ml Sterilisationslösung für 15 min. (Bereiten Sie frische Sterilisationslösung: 3,85 ml Natriumhypochlorit (NaOCl) stock (12%) (ACHTUNG: Dunstabzug), 5 ul Tween 20, bis zu 10 ml mit Wasser Kehren Sie die Röhrchen mehrere Male, um sicherzustellen, dass alle Samen zu kommen. in Kontakt mit der Lösung.
      4. In einem laminaren Luftstrom Schrank, ersetzen Sie die Sterilisationslösung mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser und spülen Sie die Samen 5 mal für 5 Minuten durch wiederholtely Austausch mit 1 ml frischem sterilem destilliertem Wasser.
    2. Gassterilisation
      1. Gießen der gewünschten Anzahl von Samen in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einzelne Rohre bei der Arbeit mit mehreren unabhängigen Linien, und ordnen sie in einem Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen Box oder Halter eröffnet. Wenn die Anzahl von Samen in einem Rohr 500 übersteigt (12,5 mg), unterteilen die Samen in die entsprechende Anzahl von Rohren zur erfolgreichen Sterilisation zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, die Kappen der Nachbarrohre einander nicht decken. Zusammenpassen, die Deckel der Kiste auf dem Boden, wie es braucht, um im Exsikkator als auch für die Sterilisation ist.
      2. Legen Sie die Box in der Schüssel mit einem Exsikkator, zusammen mit einem Becherglas (ACHTUNG: Dunstabzug).
      3. Füllen Sie das Becherglas mit 100 ml von 12% NaOCl (ACHTUNG: Abzugshaube). Setzen Sie den Deckel auf dem Exsikkator, aber lassen Sie eine kleine Öffnung, wo das Becherglas platziert.
      4. 3 ml 37% ige Salzsäure (rauchende) (CAUTION: Verwendung Dunstabzug) in das Becherglas durch die kleine Öffnung und der Exsikkator schnell zu schließen. Die Lösung perlt seit einiger Zeit aufgrund von Cl 2 -Gas-Formation. Lassen Sie das System geschlossen O / N (oder zumindest 8 h).
      5. Entfernen Sie den Deckel des Exsikkator. Nehmen Sie die Box und bedecken Sie es mit dem Deckel, um eine Verunreinigung während des Transports zu vermeiden.
      6. Legen Sie die Box in einem laminaren Luftstrom Kabinett, entfernen Sie den Deckel und lassen Sie die Samen für etwa 1 h bei RT, um Gas-Release zu ermöglichen.
        Hinweis: Seeds sicher trocken in geschlossenen Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 ° C gelagert werden bis zu 2 Wochen.
  2. Laterale Wurzelinduktion in Arabidopsis
    1. Seitenwurzel Inhibition (NPA-Behandlung)
      1. Vorzubereiten Wachstumsmedium für in-vitro-Wachstum. Das Medium von halber Stärke Murashige und Skoog Salzgemisch 15, 0,1 g / l Myo-Inositol, 10 g / l Saccharose enthält und mit 0,5 gepuffertg / L 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES).
      2. Passen Sie mit 1 M KOH den pH-Wert auf 5,7. Hinzufügen von 8 g / l von Pflanzengewebe Agar und autoklaviert das Medium für 20 Minuten bei 121 ° C.
      3. Bereiten Sie eine 25 mM Stammlösung von NPA in Dimethylsulfoxid (DMSO) (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). In laminarem Luftstrom kühlt man das autoklavierte Medium auf etwa 65 ° C (das ist die Temperatur, bei welcher die Flasche mit der Hand gehalten werden soll), und geben 25 mM NPA-Stammlösung, um eine Endkonzentration von 10 uM NPA erhalten.
      4. Homogenisierung nach Zugabe durch leichtes Schütteln der Flasche für 10 Sekunden. Gießen Sie 50 ml Medium pro Quadratpetrischale (12 cm x 12 cm).
        Hinweis: Bei der Großversuch, tragen Sie eine Nylon-Mesh (20 um), um einfache Übertragung zu gewährleisten. Vorbereitung einer Masche (9 cm x 9 cm) zum Autoklavieren (Figur 1A). Wenn autoklaviert das Armierungsgewebe in das Wachstumsmedium mit sterilen Pinzetten (1B). Schieben Sie die Masche in das Wachstumsmedium mit einem sterilized drigalsky sicherstellen, dass es in gutem Kontakt mit dem Wachstumsmedium (1B) ist (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen).
      5. Die Saat auf den NPA-Platten.
        Hinweis: Bei einem Großversuch ist geplant, säen 2 dicht und gut ausgerichteten Reihen mit 50 Samen, um die Probenahme zu erleichtern (siehe 1.2.2.3).
        1. Im Falle von flüssigen Sterilisation, die Saat auf NPA-Platten mit einer 200 ul-Pipette. Abgeschnitten 3-4 mm von dem Ende der Pipettenspitzen in sterilen Bedingungen (oder vor der Sterilisation der Spitzen), um in der Lage, um die Samen pipettieren sein. Pipette nach oben und unten ein paar Mal, um erneut zu suspendieren die Saat, so pipettieren etwa 150 & mgr; l sterilem Wasser mit 10 - 20 Samen und warten, bis der Samen Sediment am Boden der Spitze. (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen)
          Hinweis: Beim Berühren der Agar oder die Maschen sanft mit der Spitze, wird ein Wassertropfen mit einem Startkapital von ihm (1C) freigegeben werden.
        2. Im Falle der Gassterilisation, die Saat mit autoklaviert toothpicks.Pinch den Zahnstocher in den Agar, bevor die Samen, um eine klebrige Oberfläche zu gewährleisten. Nehmen Sie den Samen einer nach dem anderen mit dem Zahnstocher und verteilen die Samen auf den Platten (1D). Alternativ fügen sterilem Wasser auf den Samen, und säen, wie in 1.2.1.5.1 beschrieben (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen).
      6. Verschließen Sie die Platten mit atmungs Klebeband und speichern sie Platten bei 4 ° C im Dunkeln für mindestens 2 Tage und höchstens eine Woche. Dies ist für die Schichtung und stellt sicher, synchronisiert und effizienter Keimung erforderlich.
        Anmerkung: Alternativ können Samen vor der Aussaat geschichtet, in destilliertem Wasser in Mikrozentrifugenröhrchen, die weniger Kühlraum benötigt getaucht. In diesem Fall speichern Sie die Röhrchen für mindestens eine Woche bei 4 ° C, und bewegen Sie die Platten auf die Wachstumskammer unmittelbar nach der Aussaat (siehe 1.2.1.7).
        TAG 3
      7. Bewegen die Platten an der Wachstumskammer (Dauerlicht (110 & mgr; E m -2 s -1), 21 ° C) für 5 Tage (2 Tage der Keimung und 3 Tagen Wachstum) in einer fast vertikalen Position (80 bis 90 °) Wurzelwachstum auf, und nicht in dem Medium zu gewährleisten.
        TAG 8
    2. Laterale Wurzelinduktion (NAA Treatment)
      1. Bereiten Sie die gleichen Wachstumsmediums, wie in 1.2.1.1 und 1.2.1.2 beschrieben. Bereiten Sie eine 50 mM Stammlösung von NAA in DMSO (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). Kühlen Sie das autoklavierte Medium auf 65 ° C und fügen NAA Lösung für das Medium, um eine Endkonzentration von 10 & mgr; M zu erhalten NAA (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen).
        1. Homogenisierung nach Zugabe durch leichtes Schütteln der Flasche für 10 Sekunden. Gießen Sie 50 ml Medium pro Quadratpetrischale (12 cm x 12 cm).
      2. Übertragen Sie die Sämlinge aus den Platten, die Wachstumsmedium mit 10 & mgr; M NPA ergänzt um jene supgänzt mit 10 uM NAA.
        1. Haken Sie die Arme des gebogenen Pinzette unter den Keimblättern des Keimlings und nehmen Sie es vorsichtig von der Platte. Nur übertragen Sämlinge von denen die Wurzeln vollständig in Kontakt mit der NPA-Wachstumsmedium und vorzugsweise nach unten gewachsen.
        2. Überfliegen die Wurzel über die NAA-enthaltenden Wachstumsmedium Oberfläche über eine kleine Distanz. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzenwurzeln sind in gutem Kontakt mit dem Wachstumsmedium. Falls erforderlich, drücken Sie die Wurzel vorsichtig in das Wachstumsmedium Fläche mit der Pinzette.
          Hinweis: Bei einem Großexperiment, entfernen Sie alle Sämlinge, die in Kontakt mit dem Netz und Übertragung durch Anheben des Mesh an den beiden oberen Ecken mit einer Pinzette nicht. Sicherzustellen, dass die Maschen in guten Kontakt mit dem NAA haltigen Medium durch Abschöpfen des Netzes über die Agaroberfläche über einen kleinen Abstand (1E).
      3. Verschließen Sie die neuen Platten mit atmungsBand und legen Sie sie in der Wachstumskammer (conDauerlicht (110 & mgr; E m -2 s -1), 21 ° C) in einer vertikalen Position für die gewünschte Zeit nach der Induktion bis zur Probenahme.
        Hinweis: Bei einem Großexperiment, mit einem Skalpell, um die Wurzelsegmente auf einmal direkt auf dem Netz geschnitten und probieren Sie sie durch sanftes Abkratzen der Oberfläche des Netzes.

2. LRIS Maize Protocol

  1. Schichtung der Maiskörner
    1. Maiskörner Inkubieren bei 4 ° C im Dunkeln für mindestens 1 Woche.
      Hinweis: Dieses Protokoll wurde mit dem B73 Maisinzuchtlinie entwickelt.
  2. Sterilisation von Maiskörnern
    TAG 1
    Anmerkung: Obwohl Maissämlinge müssen nicht unter sterilen Bedingungen gezüchtet werden, wird empfohlen, um die Maiskörner zu sterilisieren und mit Sterilgutes von Pilzwachstum in der Papierrolle zu verhindern,System.
    1. Legen Sie die erforderliche Anzahl von Maiskörnern in einem sterilisierten Glasbecher.
    2. 100 ml Sterilisationslösung (6% NaOCl in Wasser) (ACHTUNG: Abzugshaube).
    3. Fügen Sie einen Magnetrührstab und das Becherglas auf einem Magnetrührer bei niedriger Rührgeschwindigkeit (ca. 250 UpM) bei Raumtemperatur für 5 min.
    4. Fünfmal für 5 min gründlich durch Ersetzen der Lösung mit 100 ml frischem sterilem Wasser.
  3. Aussaat Maiskörner
    1. Setzen Sie auf Handschuhe, um das Risiko einer Kontamination zu verringern, und nehmen Sie eine Rolle Papiertücher.
    2. Reißen Sie zwei Strecken der Handtuchpapier mit einer Gesamtlänge von zwei Blätter (ungefähr 92 cm x 24 cm), und legen Sie sie auf der jeweils anderen auf einer sauberen Oberfläche (2A).
    3. Falten Sie die Blätter zu verdoppeln über die Länge (ungefähr 92 cm x 12 cm) (2A).
    4. Verwenden einer Pinzette zu 10 Kerne in etwa 2 cm von der Spitze über t verteilener gesamten Länge des Papiers, ohne dabei einen Zwischenraum von 8 cm zwischen jedem Kernel und 8 cm an beiden Enden frei (2B). Sicherstellen, dass die Keimwurzel des Kernels nach unten und in Richtung des Papiers (2B).
    5. Sanft rollen Sie das Papier über die Länge, während die Samen an Ort und Stelle (2B). Um den Roll zu erleichtern, ist es optional, ersten sprühen Sie das Papier mit sterilem Wasser.
    6. Setzen Sie die Papierrollen in sterilisierte Glasröhren von ca. 6 cm Durchmesser und 14 cm Höhe (zB 250 ml Zentrifugenröhrchen) und legen Sie sie in einem Rack (2C).
  4. Laterale Wurzelinduktion in Mais
    1. Bereiten Sie eine 50 mM NPA-Stammlösung (gelöst in DMSO) (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe).
    2. Für jedes Rohr, einen 50 uM NPA Lösung durch Zugabe von 125 ul von 50 mM NPA Stammlösung zu 125 ml sterilem Wasser in einem sterilisierten Glasbecher.
    3. Gut mischen undPour 125 ml der 50 uM NPA-Lösung über der Papierrolle in das Rohr. Die Papierrolle wird die Lösung absorbieren und völlig durchnässt.
      Hinweis: Bei Verwendung von Papierrollen und Rohre mit anderen Dimensionen, die Lautstärke entsprechend an. Die Flüssigkeit sollte auf halber Strecke das Rohr zu erreichen, um eine ausreichende Aufnahme zu gewährleisten.
    4. Legen Sie die Papierrollensystem in einer Wachstumskammer für drei Tage (27 ° C, Dauerlicht, 70% relative Luftfeuchtigkeit). Stellen Sie sicher, dass die Papierrollen bleiben Hinzufügen von zusätzlichen 50 uM NPA-Lösung eingeweicht, da die Lösung im Laufe der Zeit (2D) verdampft.
      TAG 4
    5. Bereiten Sie eine 50 mM NAA-Stammlösung (gelöst in DMSO) (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe).
    6. Für jedes Rohr, bereiten eine 50 uM NAA Lösung durch Zugabe von 125 & mgr; l aus der 50 mM NAA Lager zu 125 ml sterilem Wasser in einem sterilisierten Glasbecher.
    7. Sanft Großteil der verbleibenden NPA-Lösung von den Papierrollen und legen Sie diem in sterilem Wasser für 5 Minuten, um es zu waschen (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). Sanft das meiste Wasser aus der Papierrollen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
    8. Gut mischen und gießen Sie die 50 uM NAA-Lösung über die Papierrollen in den Rohren. Sicherstellen, dass sie völlig durchnässt werden.
    9. Legen Sie die Papierrollensystem in der Wachstumskammer (27 ° C, Dauerlicht, 70% relative Feuchtigkeit) nach der Induktion der gewünschten Dauer.
  5. Laterale Wurzelinduktion in Zufälliges Crown Wurzeln von Mais
    Hinweis: Die LRIS wie oben beschrieben induziert Seitenwurzeln in der Primärwurzel. Doch in Mais und anderen Monokotyledonen, der primären Wurzel und den embryonalen Samen Wurzeln, zusammen mit ihren Seitenwurzeln, sind während der Keimlingsentwicklung vor allem wichtig. Zu einem späteren Zeitpunkt in das Pflanzenwachstum ergeben sich die post-embryonale Adventivwurzeln auf dem Stamm und zu entwickeln Seitenwurzeln, eine neue Wurzelsystem 16 bilden auch. Die LRIS kann auch nützlich seind, um Seitenwurzeln auf diesen post-embryonale zufällige Krone Wurzeln, indem Sie einige kleinere Anpassungen an der LRIS auf der embryonalen Primärwurzel zu induzieren.
    1. Um die Papierrollen zu machen, erstellen Sie ein Sandwich von Papieren mit jeweils zwei Schichten aus Handtuchpapier auf der Außenseite und zwei Lagen Papier Keimung innerhalb. Legen Sie die sterilisiert Kernel (siehe Schritte 2,1 bis 2,2) in zwischen den beiden Platten der Keimung Papier. Keimung Papier, verglichen mit Handtuch Papier, wird weniger anfällig für durch die Wurzelhaare und Seitenwurzeln, die machen die Öffnung der Papierrollen später leichter durchdrungen werden können. Auf der anderen Seite werden die beiden äußeren Schichten Handtuchpapier Absorption der Flüssigkeit zu erleichtern.
    2. Legen Sie die Brötchen in 700 ml Glasröhrchen und gießen sterilem Wasser ohne NPA über sie. Sicherstellen, dass sie völlig durchnässt werden.
    3. Keimen die sterilisierten Kerne in der Wachstumskammer (siehe Schritt 2.4.9).
    4. Wachsen die Setzlinge bis die zufällige Kronenwurzelnbeginnen zu entstehen (6 Tage B73). Sicherstellen, dass die Papierrollen werden nass zu jeder Zeit durch Zugabe von sterilem Wasser, wenn nötig gehalten wird.
    5. Transfer in ein 25 & mgr; M NPA-Lösung für 4 Tage (siehe Schritte 2.4.1 bis 2.4.4), gefolgt von einem ähnlichen Induktion Seitenwurzel Initiierung durch Ersetzen der NPA-Lösung mit einer 50 & mgr; M NAA Lösung nach einem Waschschritt (siehe Schritt 2.4 0,5 bis 2.4.9).

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Ergebnisse

Anwendung des LRIS um des Seitenwurzel Initiation Prozess durchzuführen Vergleichs Transcriptomics

Eine Anwendung der LRIS ist der Vergleich und die Korrelation von Genexpressionsprofilen in seitlichen Wurzelbildung in verschiedenen Arten. Vergleichende Transkriptomik nähert schaffen die Möglichkeit, orthologen Genen in der lateralen Wurzelentwicklung in verschiedenen Spezies beteiligt lokalisieren. Seitenwurz...

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Diskussion

Im Arabidopsis LRIS Protokoll ist es wichtig, nur die Keimlinge, die vollständig in Kontakt mit der NPA-enthaltenden Wachstumsmedium gezüchtet wurden übertragen. Dies stellt sicher, daß Seitenwurzelinitiierung über den gesamten Wurzellänge blockiert. Um Verwundung der Pflänzchen bei der Übertragung zu verhindern, können die Arme der Pinzette unter gekrümmte den Kotyledonen der Sämling eingehängt werden. Bei der Übertragung, stellen Sie sicher, dass die Sämling Wurzeln sind in ausreichenden Kontakt mit dem NAA-h...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken Davy Opdenacker für die technische Unterstützung und die Fotografie. Wir danken Dr. Annick Bleys herzlich für hilfreiche Vorschläge zur Verbesserung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde finanziert durch das Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 "MARS" des belgischen Föderalen Büros für Wissenschaftspolitik, durch das FWO Grant G027313N und durch die Agentur für Innovation durch Wissenschaft und Technologie, IWT (IR).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ARABIDOPSIS LRIS
Saatgut
Arabidopsis SaatgutCol-0 ecotype
Gassterilisation von Saatgut
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mlSIGMA-ALDRICH0030 125.215Eppendorf Mikroröhrchen 3810X, PCR clean
Mikrozentrifugenröhrchen 2 mlSIGMA-ALDRICH0030 120.094Eppendorf Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen
SalzsäureMerck KGaA1,003,171,00037% (Rauch) für die Analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu
GlasexsikkatorSIGMA-ALDRICHPyrex
Glasbecher
Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen Box oder Halter
Bleiche Sterilisation von Saatgut
EthanolChem-Lab nvCL00.0505.1000Ethanol, abs. 100% a.r. verdünnt auf 70%
Natriumhypochlorit (NaOCl)Carl Roth9062.312%
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379
steriles Wasser
Wachstumsmedium
SalzgemischDUCHEFA Biochemie B.V.M0221-0050
Myo-InositolSIGMA-ALDRICHI5125-100G
2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES)DUCHEFA Biochemie B.V.M1503.0100
SaccharoseVWR, International LLC27483.294D(+)-Saccharose Ph. Eur.
KOHMerck KGaA1050211000Pellets für die Analyse (max. 0,002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Plant Tissue Culture AgarLabM LimitedMC029
Laterale Wurzelinduktionschemikalien
N-1-naphthylphthalamsäure (NPA)DUCHEFA Biochemie B.V.Nr. N0926.025010 µ M (Arabidopsis)
1-Naphthalinessigsäure (NAA)DUCHEFA Biochemie B.V.Nr. N0903.005010 µ M (Arabidopsis)
Dimethylsulfoxid (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
Herstellung eines Netzes für Transfer
Nylon-MeshProsep bybaSynthetisches Nylon-Mesh 20 & micro; m
Aussaat und Setzlingshandlingquadratische Petrischalenplatten
GOSSELINBP124-0512 x 12 cm
50 ml DURAN RöhrchenSIGMA-ALDRICHCLS430304Corning  50 ml Zentrifugenröhrchen
drigalskiCarl RothK732.1
Pipette
geschnittene PipettenspitzenDaslab162001XUniversal 200, 5 mm Spitze vor dem Autoklavieren abschneiden
atmungsaktives Klebeband 3M Deutschland GmbHKat.-Nr. 1530-1
PinzetteFiers nv/saK342.1; K344.1Dumont Pinzette Typ A Nr. 5; Dumont Pinzette Typ e Nr 7
Wachstumsbedingungen
Wuchs Raum21 > C, continuous light
MaterialsCompanyKatalog<>Kommentare
MAIZE LRIS
Saatgut
MaiskörnerB-73
Bleichsterilisation von Kernen
Glasbecher
Magnetrührer Fiers nv/saC267.1
Natriumhypochlorit (NaOCl)Carl Roth9062.312%
steriles Wasser
Lateralwurzelinduktionschemikalien
N-1-naphthylphthalamsäure (NPA)DUCHEFA Biochemie B.V.Nr. N0926.025050 µ M (Mais-Primärwurzel), 25 & Mikro; M (Adventituswurzel Mais)
1-Naphthalinessigsäure (NAA)DUCHEFA Biochemie B.V.Nr. N0903.005050 µ M (Mais)
Dimethylsulfoxid (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
Aussaat und Sämlingshandhabung
PapierhandtücherKimberly-Clark Professional*6681SCOTT Handtücher - Rolle / Weiß; Blattformat (24 x 46 cm)
SaatgutkeimpapierAnchor Paper Company10 X 15 38# Saatgutkeimpapier
PinzetteFiers nv/saK342.1; K344.1Dumont Pinzette Typ A Nr. 5; Dumont Pinzette Typ e nr 7
250 ml (Zentrifuge) RöhrchenSCHOTT DURAN2160136ca. 5,6 cm Durchmesser und 14,7 cm Höhe 
700 ml RöhrchenDURAN GROUP213994609Zylinder, Rundfußrohr, D 60  x 250
Gestellfür Maisrohre, hausgemachtes
steriles Wasser
Wachstumsbedingungen
Schrank27 &/Grad; C, Dauerlicht, 70% relative Luftfeuchtigkeit
, Wachstum

Referenzen

  1. Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation. Development. 140, 4301-4310 (2013).
  2. Dolan, L., et al. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development. 119, 71-84 (1993).
  3. Bell, J. K., McCully, M. E. A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays. Protoplasma. 70, 179-205 (1970).
  4. Benkova, E., et al. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell. 115, 591-602 (2003).
  5. Beeckman, T., Burssens, S., Inzé, D. The peri-cell-cycle in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).
  6. Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inzé, D., Beeckman, T. Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).
  7. Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize. Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).
  8. Casimiro, I., et al. Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. Plant Cell. 13, 843-852 (2001).
  9. Himanen, K., et al. Transcript profiling of early lateral root initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).
  10. De Smet, I., et al. Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root. Science. 322, 594-597 (2008).
  11. Vanneste, S., et al. Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).
  12. De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).
  13. Jansen, L., et al. Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize. Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).
  14. Parizot, B., et al. Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation. Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  16. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  17. Grunewald, W., Parizot, B., Inzé, D., Gheysen, G., Beeckman, T. Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms? Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).
  18. Parizot, B., Beeckman, T. Genomics of root development. Root Genomics and Soil Interactions. Crespi, M. , 3-28 (2012).
  19. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  20. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15, 583-596 (2003).
  21. Ludwig, Y., Hochholdinger, F. Laser microdissection of plant cells. Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).
  22. Beeckman, T., Engler, G. An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).
  23. Ditengou, F. A., et al. Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).
  24. Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation. J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).
  25. Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid. Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).
  26. Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings. J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).
  27. Beyer, E. M., Morgan, P. W. Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C. Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).
  28. Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells. Planta. 198, 532-541 (1996).
  29. Bailey-Serres, J. Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers. Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).
  30. Perez-Torres, C. A., et al. Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor. Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).

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