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Methodenartikel

Orthotopische Hind Gliedmaßen Transplantation in der Maus

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DOI:

10.3791/53483

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12. Februar 2016

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses neuartige Modell für orthotoper hinteren Gliedmaßen Transplantation in der Maus, eine nicht-Naht Manschette Technik für supermikrovaskulären Anastomose Anwendung bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die in-vivo-mechanistisch zu vaskularisiert Verbund Allotransplantationen bezogene immunologische Forschung (VCA).

Zusammenfassung

In vivo Tiermodellsysteme, insbesondere Mausmodelle, haben sich zu leistungsfähigen und vielseitigen wissenschaftlichen Werkzeugen entwickelt, die für die Grundlagen- und translationale Forschung im Bereich der Transplantationsmedizin unverzichtbar sind. Eine breite Palette von Reagenzien ist exklusiv in dieser Umgebung erhältlich, darunter mono- und polyklonale Antikörper sowohl für diagnostische als auch für interventionelle Anwendungen. Darüber hinaus ermöglicht eine Vielzahl von genotypisierten, inzüchteten, transgenen und Knock-out-Stämmen eine detaillierte Untersuchung der individuellen Beiträge humoraler und zellulärer Komponenten zum komplexen Zusammenspiel einer Immunantwort und machen die Maus zum Goldstandard für die immunologische Forschung.

Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) beschreibt ein neuartiges Gebiet der Transplantation, bei dem Allotransplantate verwendet werden, um bei Patienten, die traumatischen oder angeborenen Gewebeverlust erlitten haben, "Gleiches durch Gleiches" zu ersetzen. Dieses chirurgische methodische Protokoll zeigt die Verwendung einer unnahtbaren Manschettentechnik für die supermikrovaskuläre Anastomose in einem orthotopen Maus-Transplantationsmodell für die Hintergliedmaßen. Das Modell ermöglicht insbesondere den Vergleich zwischen etablierten Paradigmen in der Organtransplantation mit einer neuartigen Form von Transplantaten, die aus verschiedenen Gewebekomponenten besteht. Einzigartig ist, dass dieses Modell die Transplantation eines lebensfähigen vaskularisierten Knochenmarkkompartiments und einer Nische ermöglicht, die das Potenzial haben, einen positiven Effekt auf das Gleichgewicht von Immunakzeptanz und -abstoßung auszuüben. Diese Technik bietet ein Werkzeug zur Untersuchung der Alloantigenerkennung und der Abstoßung und Akzeptanz von Allotransplantaten und ermöglicht die Durchführung von Studien zur funktionellen Nervenregeneration, um dieses neuartige Gebiet der Transplantation weiter voranzutreiben.

Einleitung

Die späten neunziger Jahre läuteten die Pioniertage der rekonstruktiven Transplantation ein, als 1998 die erste erfolgreiche Handtransplantation in Frankreich durchgeführt wurde. Seitdem wird der Einsatz von VCAs zur Rekonstruktion verheerender Gewebedefekte bei einem breiten Spektrum von Patienten erfolgreich eingesetzt. Bis heute zählt die Welt 76 Empfänger von 112 oberen Extremitäten sowie 31 Gesichtern 1-3. Darüber hinaus wurden mehrere andere Arten von VCAs wie Bauchdecke 4, Kehlkopf 5, Luftröhre 6, vaskularisierte Gelenke 7 und sogar Penis 8 durchgeführt. Darüber hinaus wurde kürzlich über die Lebendgeburt eines Babys nach einer Gebärmuttertransplantation berichtet 9. Diese wachsende weltweite Erfahrung ist ein Hinweis darauf, wie die rekonstruktive Transplantation zu einer validen therapeutischen Option für Patienten geworden ist, die an signifikanten funktionellen Gewebedefekten leiden, die für die konventionelle rekonstruktive und restaurative Chirurgie und Behandlung nicht geeignet sind.

Obwohl die Idee, "Gleiches durch Gleiches" zu ersetzen, klinische Begeisterung auslöste, herrscht anfängliche Skepsis hinsichtlich der Nebenwirkungen der konventionellen Hochdosis-Immunsuppression, die zur Aufrechterhaltung der Allotransplantate und ihrer Funktion erforderlich sind 10,11. Wie jedoch die bahnbrechende Arbeit von Lee et al. zeigt, ist es weniger wahrscheinlich, dass diese Komposittransplantate abstoßen als ihre einzelnen Komponenten, und darüber hinaus haben einige der Gewebekomponenten wie das vaskularisierte Knochenkompartiment Optimismus geschürt, da sie einzigartige immunologische Effekte auf das Gleichgewicht von Immunakzeptanz und -abstoßung ausüben könnten 12.

Unsere Gruppe leistete Pionierarbeit bei mehreren mikrochirurgischen Tiermodellen für die Transplantation solider Organe sowie bei der vaskularisierten Komposit-Allotransplantation 13-19. Hier beschreiben wir ein neuartiges chirurgisches Verfahren, bei dem eine unnahtbare Manschettentechnik verwendet wird, um eine supermikrovaskuläre Anastomose in einem orthotopen Maus-Hintergliedmaßentransplantationsmodell durchzuführen. Dieses Transplantationsmodell bietet ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung von Immunakzeptanz- und Abstoßungsmechanismen sowie der Rolle einzelner Gewebekomponenten, wie z.B. des vaskularisierten Knochenmarkkompartiments, bei der Toleranzinduktion in der immunologisch vielseitigen Umgebung der Mausspezies. Darüber hinaus eröffnet die orthotope Platzierung der Extremität die Möglichkeiten für die Nervenregeneration und funktionelle Ergebnisstudien, die für die Einstellung der VCA von entscheidender Bedeutung sind.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health (NIH) durchgeführt und wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee (JHUACUC) zugelassen. Die spezifischen Verfahren wurden im Rahmen der genehmigten ACUC Protokoll MO13M108 durchgeführt.

1. Spender Betrieb

  1. Verwalten Analgesie an der geeigneten Zeitpunkt für jeden pharmakologischen Formulierung vor der Operation. Gemäß dem genehmigten Tierpflege und Verwendung Protokoll Verwendung 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin subkutan 1 Stunde vor dem Hautschnitt.
  2. Sedate der Spender mit Isofluran durch eine Kammer aufgebracht auf einen Isofluran Verdampfer bei 4% befestigt; Sedierung und Anästhesie bei 2% durch ein Nasenkegel halten. Führen toe pinch Entzugs Reflexion der Narkosetiefe vor der Einleitung des Verfahrens zu überwachen.
  3. Tragen Masken, Einweg-Isolation Kleider und Handschuhe.
  4. Rasieren Sie die chirurgische area, insbesondere der hinteren Gliedmaßen und Leistengegend und die Vorbereitungs mit 10% Povidon - Jod.
  5. Verwenden Sie einen sterilen Bereich drapieren, autoklaviert Instrumente und eine hohe Vergrößerung Mikroskop (40x).
  6. Machen Leiste Hautschnitt Schere proximal bis zur Mitte des Oberschenkels mit und in Umfangsrichtung verbinden den Schnitt der hinteren Gliedmaßen aus dem Rest der Maus Körper abzugrenzen.
  7. Identifizieren und die Oberschenkelarterie, Vene und Nerv sezieren. Trennen Sie alle drei Strukturen mit einer Pinzette und Mikro-Schere.
  8. Sobald der Gefäßstiel seziert wird teilen die Schiffe auf dem Niveau des Leistenbandes mittels Micro-Schere.
  9. Mit einer Schere nächstes weiterhin die einzelnen ventral (gracilis und mediale Oberschenkelmuskulatur) und Rückenmuskelgruppen 20 proximal auf dem Niveau der Mitte des Oberschenkels zu unterteilen, das Transplantat aus dem Spendertier zu trennen.
  10. Durchschneiden den Oberschenkelknochen und schneiden in der Mitte des Oberschenkelschaft mit einer Schere.
  11. Euthanize Tier von Isofluran Überdosis followed durch Genickbruch. Bestätigen Einstellung von Herzschlag und Atmung.
  12. Spülen Sie das Glied mit 2 ml Heparin (30 IE) Kälte (4 ° C) Kochsalzlösung unter Verwendung einer 33 G Spülung Nadel auf einer Spritze befestigt (siehe Materialien Tabelle).
  13. Legen Sie eine Polyimid-Manschette auf die Oberschenkelvene und Arterie, respectively.
  14. Wickeln Transplantat in nassen Baumwollgewebe, in Petrischale und lagern bei 4 ° C bis zum Einsatz.

2. Empfänger Betrieb

  1. Entfernen des Hind Gliedmaßen
    1. Verwalten Analgesie an der geeigneten Zeitpunkt für jeden pharmakologischen Formulierung vor der Operation. Gemäß dem genehmigten Tierpflege und Verwendung Protokoll Verwendung 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin SC 1 Stunde vor dem Hautschnitt.
    2. Sedate der Spender mit Isofluran durch eine Kammer aufgebracht auf einen Isofluran Verdampfer bei 4% befestigt; Sedierung und Anästhesie bei 2% durch ein Nasenkegel halten. Führen Zehe Prise Rückzug Reflexion der Abteilung zu überwachenh der Anästhesie vor der Einleitung des Verfahrens.
    3. Verwenden Veterinär Salbe auf die Augen der Maus Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    4. Rasieren Sie die OP-Bereich, insbesondere der hinteren Gliedmaßen und Leistengegend und prep mit 10% Povidon - Jod.
    5. Machen Leiste Hautschnitt Schere proximal bis zur Mitte des Oberschenkels mit und in Umfangsrichtung verbinden den Schnitt der hinteren Gliedmaßen aus dem Rest der Maus Körper abzugrenzen.
    6. Identifizieren und die Oberschenkelarterie, Vene und Nerv sezieren und trennen alle drei Strukturen mit einer Pinzette und Mikro-Schere.
    7. Sobald der Gefäßstiel seziert wird, klemmen die Oberschenkelgefäße auf der Ebene des Leistenbandes.
    8. Schneiden Sie die Gefäße distal auf der Ebene der oberflächlichen Oberbauchschlagader.
    9. Danach setzen die einzelnen ventralen (gracilis und medialen Oberschenkelmuskulatur) und Rückenmuskelgruppen 20 proximal auf Höhe der Mitte des Oberschenkels zu unterteilen die native Hinter li zu trennenmb aus den Empfängertieren mit einer Schere.
    10. Durchschneiden den Oberschenkelknochen in der Mitte des Oberschenkelschaft mit einer Schere.
    11. Cauterize zuvor durchtrennten Oberschenkelmuskulatur Entlüften der Präparation Website zu verhindern und somit Verlust Empfängerblut.
  2. Implantation
    1. Minimieren des Flüssigkeitsverlusts durch das Operationsfeld mit warmer Kochsalzlösung Bewässerung (37 ° C) und 0,3 ml warmer Kochsalzlösung Injektion vor und nach der Operation.
    2. Legen Sie das Transplantat auf eine Weise, die genaue anatomische Lage des Mutter hinteren Gliedmaßen reflektiert durch den Oberschenkelknochen des Empfängers ausgerichtet und das Transplantat und verbinden sie eine 20 G Spinalnadel als Markstab verwenden.
    3. Coapt die ventralen und dorsalen Muskelgruppen resorbierbares Nahtmaterial (6-0 Polysorb).
    4. Schließen Sie die Oberschenkelgefäße die nicht-Naht Manschette Technik; im Detail, die Empfängerseite des Schiffes ziehen über vorher die Handschellen an der Gefäßenden der graf montiertt. Verwenden Sie einen 10-0 Nylonfaden und führen eine umlaufende Bindung der übernehmenden Schiff auf der Manschette zu befestigen.
    5. Release im nächsten die Klammern. In diesem Stadium visuell Manschette Rotation und optimale Positionierung überprüfen mis-Rotation und Abknicken der Gefäße zu verhindern.
    6. Führen sorgfältige Blutstillung mittels Elektrokauter mit einem besonderen Fokus auf den Muskel Empfänger Geberschnittstelle und den Knochenenden.
    7. Schließen Sie die Haut mit nicht-resorbierbaren Nylonnähten (6-0 Ethilon).
    8. Stellen normothermic Bedingungen, indem man das Tier in seinem Käfig unter einer Wärmelampe zu erholen. Weiter regelmäßige Überwachung für mindestens 4 Stunden, bevor es mit dem Gehäuse Anlage zurück.
    9. Geben postoperative Analgesie mit Buprenorphin in einer Dosis von 0,1 mg / kg SC alle 6-8 Stunden für 3 Tage.

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Ergebnisse

Darstellende vaskularisierten Verbund Allotransplantation in einem Maus-Modell eine nicht-Nahtmanschette Technik ermöglicht eine ausgezeichnete und langfristige Transplantat und das Überleben der Tiere zu erzielen, wie in 1 gezeigt ist. Darüber hinaus ist es, ein zuverlässiges Verfahren zum Erhalten reproduzierbarer Ergebnisse der schrittweisen Transplantatabstoßung in vaskularisierten Verbund darstellt Allotransplantation wie durch die Bilder dokumentiert in Fig...

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Diskussion

Vaskularisierte Verbund Allotransplantation, wie der oberen Extremitäten und im Gesicht Transplantation für den Wiederaufbau der verheerenden Gewebedefekten hat sich als eine gültige Behandlungsmöglichkeit entwickelt für Patienten, die nicht abänderbar zu herkömmlichen rekonstruktive Eingriffe. Der technische Fortschritt im Bereich der rekonstruktiven Mikrochirurgie sowie eine langjährige Erfahrung mit immunsuppressiven und immunmodulatorischen Therapien im Bereich der Organtransplantation, ermöglicht jetzt langfristige...

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Offenlegungen

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Armee, Marine, NIH, Luftwaffe, VA und Health Affairs unterstützt das AFIRM II Aufwand, unter Auszeichnung Nr W81XWH-13-2-0053 zu unterstützen. Die US-Armee Medical Research Acquisition Activity, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21702-5014 ist die Vergabe und Verwaltung von Erwerb Büro. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und nicht notwendigerweise durch das Department of Defense unterstützt.

Die Autoren möchten Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM und Julie Watson, DVM für ihre ausgezeichnete Veterinär Unterstützung während dieser Studie danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Nahtmaterial, 6-0 NylonMWI31849
Nahtmaterial, 6-0 PolysorbMWI72667
Nahtmaterial, 10-0 NylonAero SurgicalTK-107038
Polyimidschlauch, Größe 25Vention Medical141-0023
Polyimidschlauch, Größe 27Vention Medical141-0015
Mikrovaskuläre Klemmen (einzeln)Synovis00396
Mikrogefäßklemmen (doppelt)Synovis00414
MikroschereSynovisSAS-18
MikrozangeSynovisFRS-15 RM-8
MikrodilatatorenSynovisFRS-15 RM-8d.1
MikronadeldreherSynovisC-14
Micro-Clamp ApplikatorSynovisCAF-4
Micro-Flushing NeedleHamilton10MM, 30°, 33G
Laktierte Ringer LösungFisherScientific NC9968051
BuprenorphinDEA Anzahl erforderlich; Bezogen aus der Krankenhausapotheke.
Enrofloxacin; BaytrilBayer Health Care186599
HeparinGewonnen aus der Krankenhausapotheke

Referenzen

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