Methodenartikel

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

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DOI:

10.3791/53485

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8. Februar 2016

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1Human Immune Monitoring Laboratory, Earle A. Chiles Research Institute, Providence Cancer Center, Providence Portland Medical Center, 2Sony Biotechnology, 3Beckman Coulter, Inc. Life Sciences, 4Bristol-Myers Squibb

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Immunphänotypisierung im Vollblut ist für die Überwachung des menschlichen Immunsystems unverzichtbar. Die Anzahl der erforderlichen Reagenzien und die Instabilität bestimmter Fluorochrome in vorgemischten Cocktails erfordern jedoch eine tägliche Vorbereitung der Reagenzien. Hier zeigen wir, dass die halbautomatische Herstellung von Färbeantikörpercocktails dazu beiträgt, eine zuverlässige Immunphänotypisierung zu etablieren, indem sie die Variabilität bei der Reagenzienabgabe minimiert.

Zusammenfassung

Immunphänotypisierung von peripheren Blutfluss durch Zytometrie bestimmt Änderungen in der Frequenz und Aktivierungsstatus peripherer Leukozyten während Krankheit und Behandlung. Es hat das Potenzial therapeutische Wirksamkeit vorherzusagen und neue therapeutische Targets zu identifizieren. Vollblut-Färbung verwendet unmanipulierte Blut, die Artefakte minimiert, die während der Probenvorbereitung auftreten können. Allerdings müssen Vollblut Färbung auch auf frisch gesammelte Blut durchgeführt werden, die Integrität der Probe zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es am besten, Antikörper-Cocktails am selben Tag zu bereiten potentielle Instabilität von Tandem-Farbstoffe zu vermeiden und Reagenz Interaktion zwischen brillanten violetten Farbstoffe verhindern. Daher erfordert Vollblut-Färbung vorsichtig Standardisierung für Intra- und Inter-experimentellen Variabilität zu steuern.

Hier berichten wir Bereitstellung eines automatisierten Liquid Handler mit einem zweidimensionalen (2D) Barcode-Leser in einem Standardprozess Antibod macheny Cocktails für die Durchflusszytometrie. Die Antikörper wurden in Röhrchen mit Barcode 2D in einer 96-Well-Format angeordnet übertragen und deren Inhalte in einer Datenbank zusammengestellt. Das Liquid Handler könnte dann die Quell Antikörper Fläschchen finden, indem Sie in der Datenbank Antikörper Namen referenzieren. Unsere Methode eliminiert langwierige Koordination für die Positionierung der Quelle Antikörper Rohre. Vorgesehen Vielseitigkeit ermöglicht dem Benutzer, auf einfache Weise eine beliebige Anzahl von Details in den Antikörper Abgabevorgang ändern, wie beispielsweise spezifische Antikörper zu verwenden, Volumen und Ziel durch die Datenbank zu modifizieren, ohne für jeden Test die Skript in dem Softwareverfahren neu zu schreiben.

Ein Proof of Concept-Experiment erreicht hervorragende inter- und intra Assay-Präzision, demonstriert durch wiederholte Herstellung einer 11-Farben-17-Antikörper Durchflusszytometrie-Assay. Diese Methoden erhöht den Gesamtdurchsatz für die Durchflusszytometrie Assays und täglich Herstellung des Komplexes Antikörper-Cocktails, die für die detaillierte pheno erleichterttypic Charakterisierung von frisch gesammelten antikoaguliertem peripherem Blut.

Einleitung

Immunphänotypisierung von menschlichen peripheren Blut bestimmt quantitative und qualitative Veränderungen der Immunzelluntergruppen ein. Es gibt einen Einblick in Wirkmechanismen und Widerstand, unterstützt Entdeckung prädiktiver Biomarker, und erleichtert die Entwicklung von Immuntherapien Kombination. Daher ist die Validierung und Standardisierung von Immunophänotypisierung ein Gebiet von großem Interesse für die akademische Forschung, klinische Labors und Industrie.

Obwohl Immunphänotypisierung der peripheren Blut durch Durchflusszytometrie-Verfahren ist derzeit für die klinische Behandlung von hämatologischen Malignitäten verwendet 2,3 und Human Immunodeficiency Virus (HIV) 4,5, zuverlässige Immunphänotypisierung der peripheren Blut für die Immuntherapie Anforderungen spezifischen Überlegungen bei der Validierung und Standardisierung, weil es erfordert umfassendere Berichterstattung über Immunzelluntergruppen und die Aktivierung / inhibitorische Rezeptoren 1,6-8. successful Immunophänotypisierung erfordert eine sorgfältige Standardisierung Experiment zu Experiment Variabilität Geräteeinstellung und die Zelle Färbeverfahren 9,10 Bezug zu minimieren. Indem die Standardisierung von Geräteeinstellungen für die Durchflusszytometrie gut etabliert ist die ehemalige Sorge 9,11,12 anzugehen, bleibt es unklar, wie Variabilität Zellfärbung ohne Einschränkung Abdeckung der Immunzelluntergruppen und deren Aktivierungsstatus im Zusammenhang zu minimieren.

Da die Anzahl von Antigenen erhöht erkannt werden, tut dies auch die Möglichkeit für Fehler und Variabilität zu suboptimalen Reagenzabgabestation wegen und Kreuzkontamination. Methoden zur phenoptypic Analyse von antikoaguliertem Vollblut wurden in den späten 1980er Jahren für den Einsatz in der klinischen Labortests festgestellt. Dieselben Methoden dienen, die Bedürfnisse des Forschungslabors für die Probenvorbereitung. Wichtig ist, dass die Antikörper-Cocktails im klinischen Labor verwendet typischerweise weniger komplex und Available vorher titriert und vorgemischt vom Hersteller. Nur eine einzige Übertragung von den vorgemischten Antikörper-Cocktail ist nicht erforderlich. In der Forschung Einstellung, sind Antikörper-Cocktails von 10-16 Antikörper typisch. Jeder Cocktail muss für die Stabilität des Labors validiert werden oder frisch zubereitet vor jedem Test. mehrere Antikörper-Cocktails für eine Probe vorbereiten könnte das Pipettieren von 50 bis 80 einzelnen Antikörper mit sich bringen, eine Aufgabe, die sowohl mühsam und fehleranfällig ist.

Automation von Cocktail-Zubereitung mehrere Vorteile gegenüber manuellen Cocktail Vorbereitung wie weniger Fehler hat, erhöhte Genauigkeit von Pipettieren, und möglicherweise sogar gesunken Reagenz Verschwendung. Hier berichten wir über die erfolgreiche Einführung eines automatisierten Liquid Handler mit einem zweidimensionalen (2D) Barcode-Leser in die Zelle-Färbeprozess von Immunophänotypisierung Variabilität zu minimieren bezogene Vorbereitung zu probieren.

Protokoll

Erhebung und Nutzung von peripheren Blut in diesem Protokoll wurde von der Providence Health genehmigt & Services Institutional Review Board. Alle Versuchspersonen zur Verfügung gestellt ihre schriftliche Einverständniserklärung.

Hinweis: Beachten Sie allgemeine Vorsichtsmaßnahmen. Alle menschlichen Blut sollte mit der biologischen Sicherheitsstufe 2 Praktiken als ob infektiöse und behandelt entsprechend behandelt werden.

Anmerkung: Immunphänotypisierung mit peripherem Vollblut wird durch Inkubation von Vollblut antikoaguliert mit fluoreszierenden-markierten monoklonalen Antikörpern durchgeführt, Zelloberflächenantigene zu erkennen, gefolgt von hypotonische Lyse der roten Blutzellen zu entfernen. Die Zellen werden gewaschen, und die Probe wird mit einem Durchflusszytometer analysiert. Das beschriebene Verfahren konzentriert sich hier auf die Vorbereitung der Antikörper-Cocktails des automatisierten Liquid Handler mit einem 2D-Barcode-Leser ausgestattet ist. Erstens, die "Basis Cocktail", die Immunzelluntergruppen und die "Aktivierung Cocktail", die ich überwacht identifiziertnducible Antigene separat (Tabelle 1) hergestellt. Dann werden beide Cocktails gemischt, um einen "Master Antikörper Cocktail" zu schaffen. Siehe Abbildung 1 für den Workflow.

1. Proben

  1. Sammeln peripheren Blut über Venenpunktion in einer Natrium-Heparin antikoaguliert Blutentnahmeröhrchen vorsichtig umdrehen mehrmals gute Durchmischung zu gewährleisten, und dann bei Raumtemperatur zu halten. Ablehnen Probe wenn geronnen oder 13 hämolysiert.

2. Laborartikel Vorbereitungs

  1. Label-2D-Barcode-Rohre mit Menschen lesbare Etiketten (Antikörper Name, Verkaufsautomaten, Katalognummer und Chargennummer).
  2. Übertragen gesamte Inhalt der Antikörper Ampullen aus dem Verkaufsautomaten (in Tabelle 1) zu 2D-Barcode-Rohre entsprechen.
    Hinweis: Achten Sie besonders vorsichtig zu nicht Blasen vorstellen als Blasen auslösen fälschlicherweise Flüssigkeitsfüllstandsmessung (LLS), die zu einer suboptimalen Übertragung von Reagenz führt.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jeder Antikörper vial verfügt über genügend Antikörper für den Lauf.
  3. Lesen Sie den 2D-Barcode für jedes Rohr von der 2D-Barcode-Leser.
  4. Machen Sie eine Tabelle, die die Antikörpernamen (AB) enthält und Barcode liest (BC) mit einem Tabellenkalkulationsprogramm und speichern Sie es in ein Komma getrennt (CSV) Datei als "AB_BC.csv" (Tabelle 2).
    Hinweis: Achten Sie darauf, zu formatieren Zellen als "Text" nicht "Nummer", um die erste "0" für die Barcode-Nummern zu halten, wenn jede (zB 0163562544). Hinzufügen "x, 0000000000" am Ende Ende der Daten zu spezifizieren.
  5. Screw LLS Metallplatten an den Rahmen des Decks im automatisierten Liquid Kurve zu ermöglichen LLS.

3. Programmierung für das Automated Liquid Handler

Anmerkung: a) ein Verfahren zur Herstellung von "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" in 3.1), und b) ein Verfahren zur Herstellung von "Master Antibo: Zwei Methoden werden in der Software für die automatisierte Flüssigkeitshandhabungs programmierbardy Cocktail "durch die Kombination" Basis Cocktail "und" Aktivierung Cocktail "in 3.2) (Bild 1).

  1. Erstellen Sie eine Methode für die Herstellung der "Basis Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" (Abbildung 2).
    1. Mit dem Tabellenkalkulations-Software, machen Sie eine Tabelle, die für "Base-Cocktail" mit P50-Tipps (BASE_CT_P50 Information für die Antikörper-Namen (AB_NAME), Ziel Schlauchstelle (GUT-BASE oder WELL-ACT) und Lautstärke (VOL) in ul hat: Tabelle 3) oder P200 Spitzen (BASE_CT_P200: Tabelle 4) und "Aktivierung Cocktail" mit P50-Tipps (ACT_CT_P50: Tabelle 5) oder P200 Spitzen (ACT_CT_P200: Tabelle 6). Speichern Sie diese als CSV-Dateien. Für "well-BASE" und "GUT-ACT" Lage, beziehen sich auf Zahlen in Abbildung 3.
      Hinweis: VOL = Titer x (Anzahl der Färbung + 2) ul. Die Titer in Tabelle 1 sind chargenspezifisch. Betreiber sollten eine tit bestimmener für jeden Antikörper wie von anderen 14 beschrieben.
    2. Klicken Sie auf ein Symbol, um die Software für die automatisierte Liquid Handler auf dem Computer zu starten, ein Verfahren zur Herstellung "Basis Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" zu schaffen.
      Hinweis: Die folgenden Schritte 3.1.3-3.1.7 die Laborgeräte definieren: die Rohrgestell mit 2D-Barcode-Röhren (Abbildung 4). Die Messungen werden als Referenz zur Verfügung gestellt. Die Ermittler sollten für jedes Instrument bestimmen und einstellen.
    3. In der Werkzeugleiste unter "Projekt" die Option "Labware-Typ-Editor". Rechtsklick auf ein Objekt für einen 96-Loch-Flachplatte, wählen Sie "Kopieren" und in einem Pop-up-Fenster "Matrix_OneML_TubeRack" ein.
    4. Doppelklick auf das Objekt "Matrix_OneML_TubeRack" das Dialogfenster zu öffnen. Markieren Sie "Basisinformationen", setzen 12,775 cm (X) und 8,546 cm (Y) für "Span" und 4,625 cm für "Höhe". (4A).
    5. Als nächstes Highlight "Dialyse bewegenent Informationen ". Legen Sie Gripper Offset 0 (X), 0 (Y) und 0,3 (Z), Gripper Squeeze -0.1cm, Gripper Unsqueeze 2,6 cm, 75 Speed ​​Limit%, und dann" den Greifer Sensor verwenden "(Abbildung 4B).
    6. Dann markieren Sie "Well_1". Wie folgt festgelegt: "Nun Offset"; 1,5 cm (X) und 1,13 cm (Y): "Nun Count"; 12 (X) und 8 (Y): "Nun Spacing"; 0,9 (X) und 0,9 (Y), "Maximale Lautstärke"; 1500 ul, Format ", regelmäßige," Colum 2 Offset "; 0, und" Default Volume "; 0 (4C).
    7. Schließlich drücken Sie "Edit ..." Button auf der rechten Seite "Nun Configuration" (4C). In einem Pop-up-Fenster, wie folgt festgelegt: "Shape"; Runde, "Ober Radius"; 0,37 cm, "Lower Radius"; 0,37 cm, und "Höhe"; 3,9 cm. Check "unteren Bereich" und setzen Sie "Form"; Kegel, "Radius"; 0,37 cm, und "Höhe"; 0,4 cm (4D).
      Hinweis: Die folgenden Schritte 3.1.8-3.1.11 die Laborgeräte zu definieren: das Rohr Rack mit Mikrozentrifugenröhrchen. Die Messungen werden als Referenz zur Verfügung gestellt. Die Ermittler sollten für jedes Instrument bestimmen und einstellen.
    8. In der Werkzeugleiste unter "Projekt" die Option "Labware-Typ-Editor". Rechtsklick auf ein Objekt für einen 24-Position Rack, wählen Sie "Kopieren" und geben Sie "SmallTuberack_microfugetubes".
    9. Doppelklick auf das Objekt "SmallTuberack_microfugetubes" das Dialogfenster zu öffnen. Markieren Sie "Basisinformationen", Set 12,75 cm (X) und 8,5 cm (Y) für "Span" und 3,95 cm für "Höhe".
    10. Als nächstes Option "Well_1". Wie folgt festgelegt: "Nun Offset"; 1,621 cm (X) und 1,181 cm (Y): "Nun Count"; 6 (X) und 4 (Y): "Nun Spacing"; 1.9 (X) und 1,9 (Y), "Maximale Lautstärke"; 1000 ul, Format ", regelmäßige," Colum 2 Offset "; 0, und" Default Volume "; 0.
    11. Schließlich drücken"Edit ..." Button auf der rechten Seite "Nun Konfiguration". In einem Pop-up-Fenster, wie folgt festgelegt: "Shape"; Runde, "Ober Radius"; 0,3345 cm "Lower Radius"; 0,274 cm, und "Höhe"; 3,6728 cm. Check "unteren Bereich" und setzen Sie "Form"; Hemisphäre, und "Radius"; 0,1575 cm.
      Hinweis: Die folgenden Schritte 3.1.12-3.1.35 wird erklärt, wie die "Neue Methode" zu programmieren, für die Herstellung der "Basis Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" (Abbildung 2).
    12. Klicken Sie auf die "Neue Methode" Symbol und offen.
    13. Ziehen Sie ein "IF" Symbol zwischen einem "Start" und "Finish" in der neuen Methode (Abbildung 2). Klicken Sie und markieren Sie den "IF" -Symbol. Geben Sie den folgenden für Bedingung:. Create ( "World.EngineObject") simuliert
      Hinweis: Dadurch wird die Software von der Durchführung Fehlerprüfung zu verhindern und dieses Verfahren ermöglichen zu arbeiten. Ohne diesen Schritt werden die software für Datensatzes fehlende Informationen aufmerksam als Barcode liest nur verfügbar sind, nach dem Schritt "VisionMate: Lesen von Barcodes" beschrieben in 3.1.20). Da dieser Schritt in die Software, um die Überprüfungsschritt deaktiviert, müssen Betreiber bestätigen gibt es genügend Hinweise und Reagenz auf dem Deck zur Durchführung dieses Verfahrens.
    14. Legen Sie eine "Geräte Setup" Symbol zwischen dem "Dann" Symbol und dem ersten "Ende" -Symbol unter dem "IF" -Symbol (Abbildung 2).
      Hinweis: Für alle folgenden Schritte, ziehen Symbole zwischen dem "Else" Symbol und dem zweiten "Ende" Symbol unter dem "IF" Symbol, so dass Schritte werden in der "Else" gekapselt.
    15. Ziehen Sie den "Geräte Setup" -Symbol unter dem "Else" in der Methode (Abbildung 2).
    16. Klicken Sie auf "Geräte-Setup" in der Methode, um die Fenster zu öffnen. Konfigurieren labwares von Icons für P50 LLS Filterspitzen, P200 LLS Filterspitzen ziehen, P1000 Tipps, "Matrix_OneML_TubeRack", zwei "SmallTuberack_microfugetubes", und das Reservoir an entsprechenden Deck Lage der Symbolliste.
    17. Öffnen Sie das Dialogfenster für die "Matrix_OneML_TubeRack" und Namen wie "AB_BOX". Öffnen Sie das Dialogfenster für die "SmallTuberack_microfugetubes" und nennen ein als "BASE_CT" für Base Cocktails und die andere als "ACT_CT" für Aktivierung Cocktails (Abbildung 5).
    18. Ziehen Sie ein Symbol "Transfer" auf das Verfahren (Abbildung 2) einen Schritt hinzuzufügen, für die Übertragung von Puffer aus dem Reservoir in Mikrozentrifugenröhrchen für "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail". Transfervolumen = 25 & mgr; l x (Anzahl der 2-Färbung) für "Base-Cocktail" und = 25 & mgr; l x (Anzahl der 2-Färbung) für "Aktivierung Cocktail".
    19. In Schritten zum Bewegen des "Matrix_OneML_TubeRack" auf den 2D-Barcode-Leser. Ziehen Sie ein "VisionMate Move" Symbol der Methode (FiAbbildung 2), und geben Sie den Übergang von der anfänglichen Deck Position in die Barcode-Leser Position auf dem Deck.
    20. Ziehen Sie ein "VisionMate: Lesen von Barcodes" -Symbol auf das Verfahren (Abbildung 2). Öffnen Sie das Dialogfeld, und wählen Sie "VisionMate", wie das Gerät und den Namen des Datensatzes als "BC_Read".
    21. Ziehen Sie ein "User Pause" (Abbildung 2), wählen Sie "Pause das ganze System und zeigt diese Botschaft" und geben Sie einen Kommentar in das Feld Benutzer daran erinnern, was bestätigt, dass alle Barcodes, bevor Sie mit dem nächsten Schritt gelesen werden.
      Hinweis: Die folgenden Schritte 3.1.22-3.1.26 verbinden wird zwischen Wannen-Stellen und Antikörper Namen Barcode-Informationen mit. Dies ermöglicht die automatisierte Flüssigkeitshandhabungs einen Ort des bestimmten Antikörpers an den Antikörper Namen "AB" auf der Grundlage zu finden.
    22. Ziehen Sie einen "Reporting Schritt" -Symbol auf das Verfahren (Abbildung 2).
    23. Erstellen Sie eine Textdatei eine Textprogramm und speichern Sie esals "BC_Readout" im Dokumentordner auf dem Computer.
    24. Öffnen Sie das Dialogfeld für "Reporting Step", wählen Sie "Textdatei" für Berichtstil, und wählen Sie die "BC_Readout" Datei durch Browsing.
      Hinweis: Die daraus resultierende "BC_Readout" Dateiinformationen für alle labwares auf dem Deck außer Tipps wie konfiguriert in 3.1.16 einschließlich Informationen für Barcode-Lesevorgänge für 2D-Barcode-Rohre und auch Stellen in der "Matrix_OneML_TubeRack" enthalten wird.
    25. Fügen Sie ein "Create Data Set" Schritt Barcode und auch Informationen zu verknüpfen. Ziehen Sie den "Create Data Set" -Symbol auf das Verfahren (Abbildung 2), klicken Sie das Dialogfenster zu öffnen, wählen Sie "Lesen aus einer Datei" und wählen Sie "AB_BC.csv" (Tabelle 2 erstellt in 2.4), aktivieren Sie "Komma- Getrennt "und" Die Datei hat eine Kopfzeile ".
      Hinweis: In der Datei Vorschaufenster, Antikörper Namen (AB) und Barcode liest (BC) gesehen werden sollte.
    26. In der Same Dialogbox für "Create Data Set" in 3.1.25, wählen Sie "VM1" für die Laborgeräte Lage und "0" für Stapeltiefe, wählen Sie "Spiel der Proben-ID", und verwenden Sie das Feld "BC" mit den Daten zu entsprechen Set "BC_Read". Wählen Sie "AB" und "BC" für "Daten erstellt werden Sets" (Bild 6).
    27. Ziehen Sie ein "VisionMate Move" Symbol der Methode (Abbildung 2) und geben Sie den Zug vom Barcodeleser Position "VM1" zurück in die Ausgangsposition Deck auf dem Deck.
      Hinweis: Die folgenden Schritte 3.1.28-3.1.33 werden Übertragungsschritt für "Base-Cocktail" definieren.
    28. Ziehen Sie eine "Arbeitsliste" -Symbol (Abbildung 2) und durchsuchen Sie die Worklist-Datei "Base_CT_P50" zu wählen (Tabelle 3) erstellt in 3.1.1. Überprüfen Sie "Loop gesamten Arbeitsliste".
    29. Ziehen Sie das Symbol "Transfer" direkt unterhalb des "Arbeitsliste" -Symbol (Abbildung 2).
    30. Klicken Sie auf das Symbol "Transfer" die Spezifikation Feld zu öffnen. Wählen Sie einfach eine der Sonden, P50 LLS Spitzen gefiltert, wählen Sie "entladen sie", wenn die Übertragung abgeschlossen ist, und klicken Sie auf "Ändern Spitzen zwischen Überweisungen". In Quelle indem Sie auf "Klicken Sie hier um eine Quelle hinzufügen", wählen Sie "Matrix_OneML_TubeRack" als Laborgeräte, und wählen Lage auf dem Deck mit Namen "AB_BOX".
    31. In der Beschreibung Feld für "Transfer", "Zoom" auf dem Diagramm der 96 Löcher mit einem Rechtsklick und wählen Sie "AB" unmittelbar nach "Use Data Set" und wählen, wo seine Werte "gleich" und "= AB_NAME" . Wählen Sie eine Übertragungstechnik der Wahl.
      Hinweis: Die Verwendung von LLS wird dringend empfohlen zu vermeiden gefällt Trümmer in der Nähe von Boden zu bekommen.
    32. In der Beschreibung Feld für "Transfer", Ziel auswählen, indem Sie auf "Hier klicken, um ein Ziel zu addieren", rechts klicken zum Vergrößern und wählen Sie "SmallTuberack_microfugetubes "als Laborgeräte, Volumen als" = VOL ", und die Lage auf dem Deck mit Namen" BASE_CT ". Nach Herauszoomen, wieder der rechten Maustaste auf" Geben Sie Auswahl als Text ", und klicken Sie auf" Geben Sie die Ziele mit dem Ausdruck unten: "und geben Sie" = WELL_BASE "als eine Variable für eine Zielplattform Position.
    33. Wiederholen 3.1.29-3.1.32 ähnlich für "Base-Cocktail" mit P200 Tipps, um die CSV-Datei "Base_CT_P200" wählen (Tabelle 4) dann sowie entsprechende Pipette Technik für P200 LLS Filterspitzen Filterspitzen P200 LLS wählen.
      Hinweis: Die folgenden Schritte 3.1.34 und 3.1.35 werden Übertragungsschritt für "Aktivierung Cocktail" definieren.
    34. Wiederholen 3.1.29-3.1.32 ähnlich für "Aktivierung Cocktail" mit P50-Tipps, indem Sie die CSV-Datei "ACT_CT_P50" (Tabelle 5) und wählen Sie "ACT_CT" als Ziel. Rechtsklick auf Ziel und klicken Sie auf "Geben Sie Auswahl als Text";. Check "Geben Sie die Ziele mit dem Ausdruck unten:" und geben Sie "= WELL_ACT" als eine Variable für eine Zielposition.
    35. Wiederholen 3.1.34 ähnlich für "Aktivierung Cocktail" mit P200 Tipps, um die CSV-Datei auswählen "ACT_CT_P200" (Tabelle 6) und P200 LLS Filterspitzen.
      Hinweis: Das Verfahren zur Herstellung von "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" kann nach dem Speichern geschlossen werden.
  2. Erstellen Sie ein neues Verfahren zur Herstellung von "Master Antikörper-Cocktail" von "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" in 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen (Abbildung 7) kombiniert werden.
    Hinweis: Die folgenden Schritte 3.2.1-3.2.6 werden die Laborgeräte zu definieren: das Rohr Rack mit 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen. Die Zahlen werden als Referenz zur Verfügung gestellt. Die Ermittler sollten für das Instrument bestimmen und einstellen.
    1. In der Werkzeugleiste unter "Projekt" die Option "Labware-Typ-Editor". Rechts-click auf ein Objekt für die 24-Position Rack, wählen Sie "Kopieren" und geben Sie "BiocisionCoolRack_XT" in einem Pop-up-Fenster.
    2. Doppelklick auf das Objekt "BiocisionCoolRack_XT" das Dialogfenster zu öffnen.
    3. Markieren Sie "Basisinformationen", Set 12,78 cm (X) und 8,57 cm (Y) für "Span" und 7,93 cm für "Höhe".
    4. Markieren Sie "Well_1". Wie folgt festgelegt: "Nun Offset"; 1,55 cm (X) und 1,33 cm (Y): "Nun Count"; 6 (X) und 4 (Y): "Nun Spacing"; 1,95 (X) und 1,97 (Y), "Maximale Lautstärke"; 2000 ul, Format ", regelmäßige," Colum 2 Offset "; 0, und" Default Volume "; 0.
    5. Öffnen Sie "Nun Konfiguration" zu bearbeiten. Wie folgt festgelegt: "Form"; Runde, "Ober Radius"; 0,5375 cm "Lower Radius"; 0,48 cm, und "Höhe"; 7,07 cm. Check "unteren Bereich" und setzen Sie "Form"; Hemisphäre, und "Radius"; 0,45 cm.
      Hinweis: Die folgenden Schritte3.2.6-3.2.7 werden Übertragungsschritte definieren und 3.2.14 in Schritt verwendet werden.
    6. Erstellen Sie eine CSV-Datei "AB_MACT" (Tabelle 7) für die Herstellung von Antikörper-Cocktail mit folgenden Überschriften: a) "SRC_BASE"; ein Laborgeräte Name für "Basis-Cocktail", "WELL_BASE" b); auch Stellen in der Laborgeräte für "Base-Cocktail", c) "VOL_BASE"; Transfervolumen für "Base-Cocktail" in ul, d) "SRC_ACT"; ein Laborgeräte Name für "Aktivierung Cocktail", e) "WELL_ACT"; auch Stellen in der Laborgeräte für "Aktivierung Cocktail", f) "VOL_ACT"; Transfervolumen für "Aktivierung Cocktail" in ul, g) "DEST_MACT"; Deck Positionsinformationen für "Master Antikörper-Cocktail", und h) "WELL_MACT"; auch Informationen in das Rohr Rack positionieren für "Master Antikörper-Cocktail".
    7. Füllen Sie Informationen unter Überschriften in 3.2.6 erstellt) (Tabelle 7) wie folgt: a) verwenden "BASE_CT"unter SRC_BASE, b) Liste und Standortinformationen für "WELL_BASE", wie in 3A, c) Liste Gesamtvolumen von Antikörpern (25 ul Puffer + Summe aller Basis Antikörpertiter für einzelne Färbung) unter "VOL_BASE" gezeigt, d) verwenden "ACT_CT" unter SRC_ACT, e) Liste und Standortinformationen für "WELL_BASE", wie in 3B gezeigt, f) Liste Gesamtvolumen von Antikörpern (25 ul Puffer + Summe aller Aktivierung Antikörpertiter für einzelne Färbung) unter "VOL_ACT". Transfer 25 ul Puffer für T-Cell FM3. Siehe Tabelle 1 für Tests 1-3, g) verwenden "SPL_TUBES_1" (siehe 3.2.10) für "DEST_MACT", und h) Liste und Standortinformationen für "WELL_MACT", wie in 8 gezeigt.
      Hinweis: Die folgenden Schritte 3.2.8-3.2.15 das Verfahren programmieren für die Herstellung von "Master Antikörper-Cocktail"
    8. Öffnen Sie ein neues Verfahren (Abbildung 7).
    9. Ziehen Sie das "Instrment Setup "Symbol der neuen Methode (Abbildung 7).
    10. In der Beschreibung Bereich "Geräte Setup", ziehen Symbole für P1000 Tipps, zwei "SmallTuberack_microfugetubes" und "BiocisionCoolRack_XT" auf das Deck Diagramm. Öffnen Sie das Dialogfenster für die beiden "SmallTuberack_microfugetubes" und Namen wie "BASE_CT" und "ACT_CT" sind, wie in 3.1.17 festgelegt. Öffnen Sie das Dialogfeld für "BiocisionCoolRack_XT" und Namen wie "SPL_TUBES_1", wie angegeben in 3.2.7 (Abbildung 9).
    11. Hinzufügen eines neuen "Gruppe" durch eine "Gruppe" Symbol der Methode (Abbildung 7) ziehen.
    12. Ziehen Sie den "Transfer aus der Datei" Symbol direkt unter der "Gruppe" Symbol zu übertragen "Basis Cocktail" für die Herstellung von "Master Antikörper Cocktail" (Abbildung 7).
    13. In der Beschreibung Feld für "Transfer Aus Datei", wählen Sie die P1000-Tipps im Einsatz, sAuserwählten "entladen sie", wenn die Übertragung abgeschlossen ist, und klicken Sie auf "Ändern Spitzen zwischen Überweisungen".
    14. In der Beschreibung Feld für "Transfer Aus Datei", wählen Sie die Datei "AB_MACT" (Tabelle 7) durch Surfen, klicken Sie auf "Datei hat eine Kopfzeile". Wählen Sie "SRC_BASE" für Quelle Laborgeräte Position und "WELL_BASE" für gut Informationen in der Quelllaborgeräte, wählen Sie "DEST_MACT" für die Ziel-Laborgeräte und "WELL_MACT" für gut Informationen im Ziellaborgeräte, und wählen Sie "VOL_BASE" für Volumeninformationen (Abbildung 10). Wählen Sie geeignete Übertragungstechnik für P1000 Tipps.
      Anmerkung: LLS kann für diesen Prozess nicht erforderlich.
    15. Einen weiteren hinzufügen "Transfer Aus Datei", indem sie es direkt unter "Gruppe" ziehen zu übertragen, die "Aktivierung Cocktail", der mit dem "Basis Cocktail" für die Herstellung von "Master Antikörper-Cocktail" (Abbildung 7 gemischt werden soll </ Strong>). Ähnlich dem Übertragungsschritt wie in 3.2.13 und 3.2.14 eingerichtet. Ausnahmen sind wie folgt: a) Wählen Sie "SRC_ACT" für Quelle Laborgeräte Position, b) "WELL_ACT" für gut Informationen in der Quelllaborgeräte, und c) "VOL_ACT" für Volumeninformationen.

4. Operating Procedure

  1. Erstens, doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, um die 2D-Barcode-Leser auf dem Computer zu starten.
  2. Dann doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, um den automatisierten Liquid Handler auf dem Computer zu starten.
  3. Unter "Instrument", wählen Sie "Home Alle Achsen" zu grundieren Spritzen des automatisierten Liquid Handler. Sicherstellen, dass alle Spritzen keine sichtbaren Luftblasen enthalten.
    Hinweis: "Home Alle Achsen" gibt das Gerät auch einen Bezugspunkt, von dem nachfolgenden Züge zu machen.
  4. Öffnen Sie das Verfahren zur Herstellung des "Basis Cocktail" und die "Aktivierung Cocktail" (Abbildung 2) in der Software für die einutomated Liquid Handler.
  5. Platzieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in "SmallTuberack_microfugetubes" für "BASE_CT" und "ACT_CT" entsprechend der Anzahl von "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" gemacht werden (Abbildung 3). Dann legen sie auf dem Deck nach dem "Geräte Setup" (Abbildung 5).
  6. Legen Sie das Reservoir mit Puffer auf dem Deck nach dem "Geräte Setup".
  7. De-Cap-2D-Barcode-Röhrchen, die die Antikörper mit einem 8-Kanal-Schraubverschluss Entdeckler enthält. Halten Kappen in genau dieser Reihenfolge auf einer Kappe hält Tablett, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Platzieren Sie den "Matrix_OneML_TubeRack" auf dem Deck nach dem "Geräte Setup" (Abbildung 5).
  8. Platz P50 LLS Filterspitzen, P200 LLS Filterspitzen, und P1000 Tipps auf dem Deck nach dem "Geräte Setup" (Abbildung 5).
  9. Starten Sie das Verfahren durch die grüne Tri klickenwinkelförmige Startsymbol. Wie durch den Popup-Fenster aufgefordert, stellen Sie sicher, dass alle Elemente auf dem Deck der "Geräte Setup" entsprechen, wie in der Methode definiert. Nehmen Sie keine Gegenstände, die sich nicht im "Geräte-Setup" auf dem Deck aufgeführt sind, da dies die Kapsel und / oder den Greifer vernichten könnte. Drücken Sie auf "OK", um fortzufahren.
  10. Nach dem "Matrix_OneML_TubeRack" wird auf den 2D-Barcode-Leser bewegt und Barcodes gelesen werden, wird ein weiteres Popup-Fenster gefragt, ob alle Barcodes gelesen werden. Gehen Sie mit "OK" einmal bestätigt drücken.
  11. Nach Abschluss der Übertragung durch den automatisierten Liquid Handler, rekapitulieren die 2D-Barcode versehene Rohre mit einem 8-Kanal-Schraubverschluss Entdeckler verwenden, und setzte sie wieder auf 4 ° C.
  12. Vortex alle Mikrozentrifugenröhrchen kräftig für 20 Sekunden, und bringt sie in die Glaseinsätze.
    Hinweis: Zu wenig Verwirbelung in suboptimalen Färbung von Zellen führen kann.
  13. Schließen Sie das Verfahren zur Herstellung von "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail". Öffnen Sie dann das Verfahren für "Master Antikörper Cocktail" zu machen.
  14. Richten Sie voretikettierten 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen auf dem "BiocisionCoolRack_XT" (Abbildung 8) und legen Sie es auf dem Deck. Die Etiketten sollten angeben, was "Basis Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" vermischt werden, sowie die entsprechenden Patienten-ID.
  15. Zeigen Rohrgestelle für "Basis-Cocktail", "Aktivierung Cocktail", und P1000 Tipps auf dem Deck (Bild 9). Starten des Verfahrens (Abbildung 7). Wie durch den Popup-Fenster aufgefordert werden, stellen Sie sicher, dass Gegenstände auf dem Deck Spiel Instrumental-Setup in dem Verfahren (Abbildung 9). Drücken Sie auf "OK", um fortzufahren.
  16. Wenn das obige Verfahren durchgeführt wird, manuell hinzufügen 50 ul Blutproben in je 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen, die die Antikörper-Cocktail enthält.
  17. Vortex Probenröhrchen in einem Klasse-II-biologischen Sicherheitsschrank und 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Take Sorgfalt an den Seiten der Röhren Streifen Blut zu vermeiden, da dies zu einer uneinheitlichen Färbung führt. Entfernen Sie vorsichtig alle Streifen von Blut von Baumwolle mit Durchflusswaschpuffer angefeuchteten Wattestäbchen.
  18. 1 ml der RBC Lysispuffer manuell und Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln.
  19. 2 ml Flusswaschpuffer (0,1% Natriumazid, 1% BSA, 10 U / ml Heparin in 1x HBSS) und Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 x g. Überstand verwerfen in einem Klasse-II-biologischen Sicherheitswerkbank. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang. Resuspendieren gefärbten Zellen in 0,5 ml Waschpuffer Fluss.
  20. Richten Sie ein Durchflusszytometer, dass mit Mehl Lasern und entsprechenden Filtern ausgestattet und laufen Proben unter Verwendung von 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen. Verwenden Sie Standard-Zytometer Kalibrierung und Fluoreszenz Kompensationsverfahren für die Datenerfassung 12,15. Sammeln Sie alle aufgeführten Parameter in "Fluorophor" in Tabelle 1.
    Hinweis: geeignete Kontrollmaterialien sollten in jedem Lauf verwendet werden, um richtige Esel, um sicherzustellen,ay Leistung.
  21. Nach dem Ausführen von Proben, erworben Exportdaten wie FCS-Dateien.
  22. Analyse von Daten geeignete Software. Identifizieren T-Zell-Untergruppen ein Gating-Strategie von der Human Immunology Projekt 1 skizziert werden.

Ergebnisse

Das Ziel von Vollblut Immunphänotypisierung ist quantitativ (die Abgrenzung von Immunzelluntergruppen) und qualitative (Aktivierungsstatus detection) Informationen auf Immunzellen zu erhalten. Wir haben ein wenig die T-Zell-Immunophänotypisierung Gremium vorgeschlagene vom Human Immunology Projekt 1 zu verbessern, die Gesamtleistung unserer Methode (Tabelle 1) geändert. Unsere T-Zell-Panel zielt darauf ab, naiv, Zentralspeicher (CM), Effektor-Memory (EM) und Effektor-T-Zellen zu identifizieren. Kurz gesagt, unterscheiden wir auf FCS-A und FCS-H basiert Dubletten. Dann Gate wir auf Lymphozyten basierend auf Seitenstreuung und CD45 Ebenen. T-Zellen werden dann durch Expression von CD3 identifiziert. CD3 + T-Zellen werden in γδ T Zellen differenziert und αβ T-Zellen. αβ T-Zellen werden weiter unterteilt in CD4 + und CD8 + T-Zellen. CD4 + und CD8 + T-Zellen werden dann auf ihre Untergruppen basierend auf expressio analysiertn von CD45RA und CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + Naive, CD45RA + CCR7 - Effektor, und CD45RA - CCR7 - EM T-Zellen ein. Darüber hinaus beobachten wir auch ihre Expression von Aktivierungsmarkern wie CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1 BB, CD69, NKG2D und OX40 qualitative Informationen zu erhalten.

Um die Genauigkeit dieses Verfahrens zu demonstrieren, wir gefärbten peripheren Vollblutproben von 4 gesunden Spendern 5 Mal an einem Tag. 11 zeigt die Beziehung zwischen Prozent T-Zell-Subpopulation auf gated Lymphozyten und Prozent Variationskoeffizient (% CV). Eine detaillierte Aufstellung von Prozent T-Zell-Subpopulationen auf gated Lymphozyten und% CV für jede Untergruppe wird in Tabelle 8 gezeigt. Die Daten aus Tests 2 und 3 nicht in Figur 11 und Tabelle 8 der Einfachheit halber enthalten. Weniger als 25% CVzwischen Lauf (Inter-Assay-Präzision) wurde für Akzeptanzkriterien für phänotypische Biomarker-Tests für Forschungszwecke 10 vorgeschlagen. Alle Messungen erfüllt diese Kriterien mit Ausnahme ICOS + γδ T-Zellen (26,64 bis 46,39%. Tabelle 8) und ICOS + CD8-T-Zellen (14,64 bis 58,39%. Tabelle 8). Diese Werte werden zu Demonstrationszwecken gezeigt. Wir verwenden diese Messungen nicht, weil ICOS hauptsächlich eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von CD4 T-Zellen 16 spielt. Der Trend der höheren% CV in Populationen, die einen geringen Anteil der Gesamtbevölkerung umfassen wurde von anderen 7 beobachtet. Für den Fall, Ermittler bei der Überwachung der seltenen Ereignisse interessiert sind, untersucht Bedarf die Anzahl der Zellen erhöht, um größer zu sein Ungenauigkeit zu überwinden 17. Zusammen zeigen unsere Daten, die den erfolgreichen Einsatz von Automatisierung in der Probenvorbereitung von Vollblut Immunophänotypisierung.

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Abbildung 1. Workflow zur Immunphänotypisierung mit peripheren Vollblut. Schritt für Schritt Workflow immunphänotypischer Assay gezeigt. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Überblick über das Verfahren zur "Basis Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" zu machen. Die Schritte in dem Verfahren zur "Basis Cocktail" und "Aktivierung Cocktail" in der Software für die automatisierte Liquid Handler machen werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier zu sehen eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3. Plan für das Rohrgestell mit BACE_CT und ACT_CT. (A) zeigt das Layout für das Rohrgestell "BACE_CT". (B) zeigt das Layout für das Rohrgestell "ACT_CT". Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Labware-Definition für die Rohrgestell mit Barcode-Rohre 2D. Schritt für Schritt mit 2D-Barcode-Rohre der Rohrgestell zu definieren. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Die Geräteeinstellung für das Verfahren zur Herstellung von "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail". Es zeigt die Deckslayout für das Verfahren zur Herstellung von "Base-Cocktail" und "Aktivierung Cocktail". Bitte hier klicken, um eine größere Version davon zu sehen Zahl.

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Abbildung 6. Einrichtung für "Create Data Set". Es zeigt detaillierte Einstellungen für "Create Data Set". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Figu Wieder 7. Überblick über das Verfahren für "Master Antikörper Cocktail" zu machen. Die Schritte in dem Verfahren zum "Master Antikörper-Cocktail" in der Software für die automatisierte Liquid Handler machen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 8. Layout für die Rohrgestell mit 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen. Es zeigt das Layout für das Rohrgestell "SPL_TUBES_1". FM3 bedeutet Fluoreszenz minus 3 (brillanten violett 421, Phycoerythrin, und Allophycocyanin). Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 9. Instrument Setup für das Verfahren zur Herstellung von "Master Antikörper-Cocktail". Es zeigt die Deckslayout für das Verfahren zur Herstellung von "Master Antikörper-Cocktail". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 10. Einstellungen für "Transfer Aus Datei". Es zeigt detaillierte Einstellung für "Transfer Aus Datei". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 11. Low Vari Fähigkeit, in halbautomatischen Vollblut Immunophänotypisierung. Einzel CV-Werte von allen Zellpopulationen aus vier gesunden Spendern untersucht werden als blau offenen Kreis dargestellt. Regressionskurve ist in der blauen Linie gezeigt. Red gestrichelten Linien 95% zuversichtlich Bands und Gier punktiert 95% Vorhersagebänder zeigen. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 12. Ein Beispiel für suboptimal Färbung. Die Färbung wurde mit ausreichend oder mangelhafte Verwirbelung der Mikrozentrifugenröhrchen aus "BACE_CT" und "ACT_CT" durchgeführt. Es gibt zwei Wohnbevölkerung in B. Die kleine Bevölkerung mit schwach CD45-Färbung darstellt Zellen, die nicht optimale Färbung bekommen haben.g12large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

GRUPPE MARKER Fluorophor Klon Titer (ul / Färbung)
BASE COCKTAIL TCELL CD45 FITC 2D1 0,4
CD3 Alexa700 UCHT1 1
CD8 APC-H7 SK1 0,4
CD4 PerCP-CY5.5 SK3 2
CCR7 PE-CF594 150503 1
CD45RA PE-Cy7 L48 1
TCRab BV786 T10B9.1A-31 1
TCRgd BV650 B1 5
AKTIVIERUNG COCKTAIL-1 TEST1 HLA-DR BV421 G46-6 5
CD278 (ICOS) PE DX29 5
CD38 APC HB7 1
AKTIVIERUNG COCKTAIL-2 TEST2 CD279 (PD1) BV421 EH12.1 2.5
CD357 (GITR) PE eBioAITR 5
CD137 (41BB) APC 4B4-1 10
AKTIVIERUNG COCKTAIL-3 TEST3 CD69 BV421 FN50 1
CD314 (NKG2D) PE 1D11 2
CD134 (OX40) APC ACT35 5

Tabelle 1. Antikörper Liste für den modifizierten T-Zellen-Panel.

AB BC
CD45_FITC 0163562388
CD3_Alexa700 0163562110
CD4_PerCP_CY5.5 0163562364
CD8_APC-H7 0163562363
CCR7_PE-CF594 0163562387
CD45RA_PE-Cy7 0163562091
TCRab_BV786 0163562069
TCRgd_BV650 0163562108
A_HLA-DR_BV421 0163562339
A_CD278 (ICOS) _PE 0163562082
A_CD38_APC 0163562317
A_CD279 (PD1) _BV421 0163562340
A_CD357 (GITR) _PE 0163562093
A_CD137 (41BB) _APC 0163562315
A_CD69_BV421 0163562341
A_CD314 (NKG2D) _PE 0163562314
A_CD134 (OX40) _APC 0163562316

Tabelle 2. Antikörper Namen mit 2D-Barcode-Nummern.

GRUPPE WELL_BASE AB_NAME VOL
TCELL 1 CD8_APC-H7 7.2
TCELL 1 CD45_FITC 7.2
TCELL 1 CD3_Alexa700 18
TCELL 1 CCR7_PE-CF594 18
TCELL 1 CD45RA_PE-Cy7 18
TCELL 1 TCRab_BV786 18

Tabelle 3. Eine Datei "BASE_CT_P50": Antikörper Namen und Volume-Informationen.

GRUPPE WELL_BASE AB_NAME VOL
TCELL 1 CD4_PerCP_CY5.5 36
TCELL 1 TCRgd_BV650 90

Tabelle 4. Eine Datei "BASE_CT_P200": Antikörper Namen und Volume-Informationen.

GRUPPE WELL_ACT AB_NAME VOL
TEST1 7 A_HLA-DR_BV421 30
TEST1 7 A_CD278 (ICOS) _PE 30
TEST1 7 A_CD38_APC 6
TEST2 13 A_CD279 (PD1) _BV421 15
TEST2 13 A_CD357 (GITR) _PE 30
TEST3 19 A_CD314 (NKG2D) _PE 12
TEST3 19 A_CD69_BV421 6
TEST3 19 A_CD134 (OX40) _APC 30

Tabelle 5. Eine Datei "ACT_ CT_P50": Antikörper Namen und Volume-Informationen.

GRUPPE WELL_ACT AB_NAME VOL
TEST2 13 A_CD137 (41BB) _APC 60

Tabelle 6. Eine Datei "ACT_CT _P200": Antikörper Namen und Volume-Informationen.

SPENDER# SRC_
BASE 		BASE COCKTAIL GUT_
BASE 		VOL_
BASE 		SRC_ACT ak-
VATION
COCKTAIL 		GUT_
HANDLUNG 		VOL_ACT DEST_MACT GUT_
MIST
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 1
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 7
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 13
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 19
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 2
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 8
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 14
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 20
HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 3
HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 9
HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 15
HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 21
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 4
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 10
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 16
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 22

Tabelle 7. Eine Datei "AB_MACT": Quelle und Ziel-Informationen für "Master Antikörper-Cocktail".

Bevölkerung # in Abb. 1 ich ii iii iv v
Bevölkerung Namen CD3 + ab T-Zellen gd T-Zellen CD3 + CD4 + CD3 + CD8 +
% Der Lymphozyten Heathly Spender # 1 79.80 75.20 2.70 49.60 22,30
Heathly Spender # 2 69,40 61.90 5,85 44,40 16.20
Heathly Spender # 3 75.80 69,60 4,75 42.00 23.50
Heathly Spender # 4 77.20 73.50 1.98 52.70 18.90
%LEBENSLAUF Heathly Spender # 1 1,42 1,58 3.70 2,50 1,56
Heathly Spender # 2 2,48 2.39 5,74 2,82 2.41
Heathly Spender # 3 1.15 1,40 6.32 1,42 2,72
Heathly Spender # 4 0,81 0,94 5.45 1.20 1,44
Durchschnittlich 1,47 1,58 5.30 1.99 2.03
Standardabweichung 0,72 0,61 1.13 0,79 0,63

Tabelle 8. Rohdaten% der Lymphozyten und% CV für jede Teilmenge aufgetragen in Figur 4. Man beachte, daß Daten für die Tests 2 und 3 nicht gezeigt in 5 und Tabelle 8 Datendarstellung zu vereinfachen.

Diskussion

Immunphänotypisierung der peripheren Blut ist von entscheidender Bedeutung für Einblicke in individuelle Reaktionen auf die Immuntherapie gewinnt. Die Herausforderung liegt in Test Standardisierung Experiment zu Experiment Variabilität 1,14 zu steuern. Eine Hauptquelle der Veränderlichkeit liegt im menschlichen Manipulation von Proben. Daher ist es denkbar, dass eine teilweise oder vollständige Automatisierung der Probenaufbereitung eine dramatische Reduktion in Experiment zu Experiment Variabilität 1,14 erleichtert. In diesem Protokoll, können wir unsere erfolgreichen Bemühungen Assay Variabilität zu minimieren, indem eine automatisierte Flüssigkeitshandhabungs ausgestattet mit 2D-Barcode-Leser für die Probenfärbung im Vollblut Immunophänotypisierung einzuführen.

Im Design ist unser Verfahren vielseitig und kann durch Hinzufügen zusätzlicher "Basis Cocktails" zu definieren sie andere Immununtergruppen überwachen. Solche Untergruppen umfassen T-Helferzellen, T regulatorischen Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, dendritische Zellen und Monozyten (Manuskript inVorbereitung) 18. Wir passten die empfohlene Antikörper-Panels des Konsortiums durch zusätzliche Marker eingeführt werden 1. Zellpopulationen wurden mit "Basis Cocktail" konjugiert mit Fluorochromen mit minimalen Emissionen in der brillanten Violett 421 (BV421), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC) Detektoren identifiziert, wie wir diese Kanäle für den Nachweis der induzierbaren Antigene zu reservieren wollte. Diese Funktion sorgt nicht nur für die höchste Empfindlichkeit Aktivierungsstatus von Immunzellen zu überwachen, sondern ermöglicht auch eine flexible Unterkunft neuer Aktivierungsmarker wie diese drei Fluorochrome werden am häufigsten mit Antikörpern gegen induzierbare Marker konjugiert. Deshalb ist unsere Methode nicht nur für Cocktail Vorbereitung für Vollblut Immunphänotypisierung geeignet, sondern ist auch nützlich zum Anfärben anderen Proben einschließlich peripheren mononukleären Blutzellen und von disaggregierten Gewebe gewonnenen Zellen (zB Tumor).

erfolgreiche IntroHerstellung unserer Methode erfordert den Schritten in Labware Herstellung und Programmierung und Ausführung des Verfahrens besondere Aufmerksamkeit. Herstellung der Rohre 2D-Barcode enthält Markierung mit für Menschen lesbaren Etiketten und Überführen der Antikörper an den dafür vorgesehenen Tuben. Um die Einführung von Fehlern zu vermeiden, wird empfohlen, tun wir das mit zwei Personen. Jedes Mal, wenn Tabellen ändern, sollten die Ermittler prüfen, ob das Verfahren korrekt funktioniert. Die Wahl geeigneter Pipettiermethoden während Programmierung sorgt für erfolgreiche Flüssigkeitstransfer. LLS ermöglicht Pipettieren ohne von der Unterseite des Antikörper Rohre gefällte Schmutz immer, für die wir entweder P50 oder P200 leitfähige Spitzen verwenden. LLS kann nicht eine gute Option für P1000 Tipps, wie LLS empfindlicher mit P1000 Tipps und manchmal fälschlicherweise durch die Anwesenheit von Luftblasen ausgelöst. Heights in Laborgeräte Definition sollte für jedes Instrument als suboptimal Flüssigkeitsübertragung auftreten kann, zum Beispiel eingestellt werden, wenn es nicht genug Platz zwischen dem Rand der Tipps istund die Unterseite der Rohre. Wie in 12 gezeigt, wenn der "Basis Cocktail" und / oder "Aktivierung Cocktail" sind nicht gut verwirbelt, kann es zu einer suboptimalen Flecken führen.

Wir dachten an gefriergetrockneten Reagenzien für die Zellfärbung als Alternative Ansatz zur Reduzierung der Variabilität im Zusammenhang mit Reagenz 19 zu verzichten. Allerdings Polymer-Konjugate von brillanten violetten Farbstoffen sind bekannt mit einander zu verursachen unspezifische Signale zu interagieren. Als solche Zugabe von mehr als zwei Polymer-Konjugate (zB BV421 und BV650 etc.) in lyophilisierten Reagenzien unspezifische Signalisierung verursachen kann (zum Beispiel, Erhöhung der BV650 Hintergrundsignal in BV421 + Bevölkerung) 20. Darüber hinaus fehlt lyophilisierten Reagenzien Flexibilität für neue Färbung einschließlich. Sie sind in der Regel teurer und erfordern einen Großauftrag. Aus diesen Gründen haben wir uns für den automatisierten Liquid Handler mit den Barcode-Rohre 2D ausgestattet zu verwenden. Obwohl es takes Zeit einzurichten und bringt eine Vorab-Investition, das Instrument zu kaufen, wird auf die Dauer solcher Faktoren für die Steigerung der Produktivität und Reproduzierbarkeit von Tests kompensiert werden. In der Tat, berichtet ein paar Gruppen zuvor die erfolgreiche Integration des automatisierten Liquid Handler in ihren Workflow von Immunphänotypisierung oder ähnliche Anwendungen 21,22. Automatisierte Lösungen für die Durchflusszytometrie-Analyse sind auch im Handel erhältlich (FACS SPA III Automatische Cocktail Vorbereitung Workstation und FlowStainer). Dies zeigt, weiter gibt es einen großen Bedarf an automatisierter Cocktail Vorbereitung für Immunphänotypisierung.

Nachdem diese Technik zu beherrschen, stellen wir uns, dass die Entwicklung von vollständig Vollblut Immunophänotypisierung automatisiert wird weiteres Experiment zu Experiment Variabilität reduzieren und könnte Vollblut Immunophänotypisierung möglich sogar in einer multizentrischen klinischen Studie Einstellung 23 machen. Wir haben bereits eine Lyse begonnen Verwendung warh Assistent die Lyse und Waschschritte zu automatisieren. Wir sehen auch, dass automatische Bestimmung des Volumens der Antikörper in den 2D-Barcode-Rohre und die Verfolgung von Reagenzienzugabe stark Inventar von Antikörpern zu verbessern und die Qualität Kontrolle über unsere Methode auf.

Offenlegungen

YK, ILG, TLM, WLM, DPH und KSB: Keine konkurrierenden finanziellen Interessen. ANT ist ein Mitarbeiter von Beckman Coulter, Inc. Die Veröffentlichung dieses Video-Artikel wird von Beckman Coulter, Inc. gesponsert

Danksagungen

Wir danken Hannah Puzas für die Unterstützung beim Systemdesign und der Konfiguration und Kevin Khovananth für die technische Beratung. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von den Hearst Foundations und der Providence Portland Medical Foundation zur Verfügung gestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BD LSRFortessaBD BiosciencesDurchflusszytometer
NXp Span-8 Labor-Automatisierungs-Workstation Beckman CoulterA31839Workstation für Laborautomatisierung
Einsatz, Röhrchen, 11 mm, weiß, für 1,5 ml Mikrofugenröhrchen (25 Stück)Beckman Coulter373696Zubehör für 24-Positionen-Röhrchengestell zur Aufnahme von Mikrofugenröhrchen.
LLS-KitBeckman Coulter719262Befestigen Sie die Unterseite des Decks in der Laborautomatisierungs-Workstation, um die Füllstandsmessung zu ermöglichen
24-Positionen-RöhrchengestellBeckman Coulter373661Röhrchengestell zur Aufnahme von Mikrofuge-Röhrchen für Antikörper-Cocktails oder Blut
BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 ZOLL REDLabMartM111416Einweg-Autoklavenbeutel für die Laborautomatisierungs-Workstation
VisionMate Hochgeschwindigkeits-2D-Barcode-LesegerätThermo ScientificAB-18502D-Barcode-Lesegerät
8-Kanal-Handheld-Schraubverschluss-Verschließer/EntdeckelerThermo Scientific4105MATZum Entdeckeln und Verschließen von 2D-Barcode-Röhrchen 
MikrozentrifugenröhrchenFisher Scientific02-681-335Zur Herstellung von Cocktails oder zur Zuführung von Blutproben an die Laborautomation
Workstation CoolRack XT CFT24BiokommunikationBCS-534Zur Aufnahme von Probenröhrchen.
1,0 ml Matrix-Röhrchen mit Schraubverschluss in Latch-RacksThermo Scientific3741AMB2D-Barcode-Röhrchen zur Aufbewahrung von fluoreszierenden Farbstoff-kojugierten Antikörpern
Biomek Span-8 P1000 Spitzen, leitfähig, vorsteril mit Barriere, 1.025 &; Mikro; lBeckman Coulter987925Tipps für Laborautomatisierungs-Workstations 
Biomek Span-8 P50 Spitzen, leitfähig, vorsteril mit Barriere, 50 & Mikro; l (Gehäuse mit 10 Racks)Beckman CoulterB01091Tipps für Laborautomatisierungs-Workstation 
Biomek Span-8 P250 Spitzen, leitfähig, vorsteril mit Barriere (Karton mit 10 Racks)Beckman Coulter394627 Spitzen für Laborautomations-Workstation 
BD FACS Lyselösung 10x KonzentratBD Biosciences349202Erythrozytenlyse
Falcon Polystyrolröhrchen mit rundem BodenFisher Scientific14-959-5Probenröhrchen
Anti-CD45 FITCBD Biosciences347463Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-CD3 Alexa Fluor 700eBioscience56-0038-42Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-CD4 PerCPCy5.5BD Biosciences341654Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-TCRgd BV650BD Biosciences564156Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-TCRab BV786BD Biosciences563825Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-CD8 APC-H7BD Biosciences560179Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-CCR7 PE-CF594BD Biosciences562381Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-CD45RA PE-Cy7BD Biosciences337167Effektor T-Zell-Panel (Basis)
Anti-HLA-DR BV421BD Biosciences562804Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD278(ICOS) PEBD Biosciences557802Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD38 APCBD Biosciences340439Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD279(PD1) BV421BD Biosciences562516Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD357(GITR) PEeBioscience12-5875-42Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD137(41BB) APCBD Biosciences550890Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD69 BV421BD Biosciences562884Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD314(NKG2D) PEBD Biosciences557940Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)
Anti-CD134(OX40) APCBioLegend350008Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)
BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen aus Kunststoff mit Natrium-Heparin: Konventioneller StopperFisher Scientific02-689-6Zur Blutentnahme
Albumin, Rinderserum, Fraktion V, RIA und ELISAEMD Millipore126593Für Fließwaschpuffer
NatriumazidSigma-AldrichS8032Für Fließwaschpuffer
Heparin, NatriumsalzAffimetrix16920Für Fließwaschpuffer
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, mit Calcium, Magnesium, ohne PhenolrotGE Healthcare Life SciencesSH30588.02Für Flow-Wash-Puffer

Referenzen

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