In dieser Studie wird ein Schritt-für-Schritt-Videoprotokoll der apikalen Resektion demonstriert. Die apikale Resektion ist ein kürzlich vorgestellter chirurgischer Ansatz in der Forschung zur Herzregeneration von Säugetieren. Diese Studie kann die Anwendung der apikalen Resektion als Standardmethode in der Erforschung des Mechanismus, der der Herzregeneration zugrunde liegt, fördern.
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Methodenartikel
Wurzelspitzenresektion Mausmodell zur frühen Säugetierherzregeneration Studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Herz-Kreislauf-Krankheit plagt die ganze Welt durch intensive Lifestyle-Änderungen. Herzregeneration birgt ein großes Versprechen für die Reparatur und Wiederherstellung der Herzmuskelzellen wegen Verletzung und Krankheit verloren. Im Gegensatz zu der robusten kardialen Regeneration von bestimmten niederen Wirbeltieren, erwachsenen Säugetier-Herzen zeigen in der Regel eine minimale Kapazität für Herz Regeneration und Reparatur. Allerdings haben jüngste Studien beträchtliche wissenschaftliche Interesse mit der Feststellung, dass zwischen postnatalen Tag 1-7 (P1 bis P7), behält der neonatalen Mäuseherz signifikante Regenerationspotential nach Wurzelspitzenresektion (dh Amputationen und Belichtung des linken ventrikulären Apex) ausgelöst. Eine wichtige Kontroverse über diesen Befund könnte durch die vielfältigen Operation bezogene Verfahren bei den Bemühungen zu replizieren oder zu erweitern auf diese wichtige Erkenntnis verwendet wird. Diese Anweisungen dynamisch für Wurzelspitzenresektion in einem Mausmodell zeigen die Materialien und Methodik. Die wesentlichen Schritte dieses Nagetier Survival Chirurgie beinhalten Hypothermie Anästhesie, Thorakotomie, chirurgische Amputation der Herzkammerspitze, und das Nahtmaterial und Rückgewinnung von Mäusen. Die beschriebene könnte die Anwendung der Wurzelspitzenresektion Mausmodells für die kardiovaskuläre Forschung zu erweitern Ansatz.
Einleitung
Eine verlängerte menschliche Lebenserwartung führt zu verschiedenen alters- und lebensstilbedingten Krankheiten, einschließlich Herzinsuffizienz, einer der Haupttodesursachen. Ohne Ersatz verlorener oder dysfunktionaler Herzmuskelzellen können die derzeitigen Therapeutika die Herzfunktion jedoch nur vorübergehend verbessern1, 2. Daher ist es notwendig, innovative Strategien für die Herzregeneration und -reparatur zu entdecken und zu entwickeln. Das Herz eines erwachsenen Säugetieres hat ein begrenztes Regenerationspotenzial. Studien an niederen Wirbeltieren wie Urodele-Amphibien und Teleostfischen haben beispiellose Einblicke in die molekularen und zellulären Mechanismen geliefert, die der Herzregeneration zugrunde liegen3, 4. Vor kurzem ist ein neonatales Mausmodell der Herzregeneration entstanden, das die Identifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter pathophysiologischer Ereignisse ermöglichen könnte, die für die menschliche Herzregeneration erforderlich sind5.
Apikale Resektion bezieht sich auf die chirurgische Entfernung der linksventrikulären Spitze. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner hohen Letalität bei älteren Mäusen auf 1 bis 7 Tage alte (P1 bis P7) Mäuse beschränkt6. Es wird erwartet, dass der kardiale Regenerationsprozess bei neonatalen Mäusen nach apikaler Resektion wie folgt abläuft: (I) schnelle und effektive Bildung eines Hämatoms, um die Spitze zu versiegeln und eine Blutung zu verhindern; (II) Regeneration von Kardiomyozyten und Wiederherstellung der systolischen Funktion5, 7. Jüngste Arbeiten haben eine Debatte über die Bedeutung und Effizienz dieses Modells8-11 angeregt. Daher ist es wichtig, die apikale Resektion klar und detailliert darzustellen. Zu diesem Zweck beschreibt dieses Protokoll anschaulich und spezifisch ein Video, wie ich die apikale Resektion auf der Grundlage eines früheren Protokollsdurchgeführt habe 6.
Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der kardialen Regeneration zugrunde liegen, ist wichtig für die Behandlung von Herzerkrankungen, die durch Verlust und/oder verletzte Kardiomyozyten gekennzeichnet sind, wie z.B. Herzinsuffizienz1, 2. Angesichts der aktuellen und vielversprechenden Fortschritte der apikalen Resektion in der Erforschung der kardialen Regeneration könnte diese Studie den Einsatz dieser Technik und ihre Verwendung in der kardiologischen Regenerationsforschung fördern.
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Protokoll
Alle Maus-Experimente wurden von der Animal Care und Verwenden Programm an der National Institutes of Health (NIH) mit Protokollnummer H0083R3 genehmigt. Das NHLBI IACUC genehmigt das Protokoll ohne Analgetika.
1. Hypothermie Anästhesie in neugeborenen Mäusen
- Sterilisieren, Schwämme und chirurgische Geräte in einem Autoklaven vor der Operation. Bereiten Sie alle chirurgischen Materialien und schalten auf eine heiße Perle Sterilisator 15-20 Minuten vorher auf 240 ° C bis 270 ° C zu erreichen.
- Übertragen Sie alle C57BL / 6 Welpen (Alters P1) von ihren stillenden Mutter in eine saubere Maus Käfig mit frischer Bettwäsche und Nistmaterial. Sobald die Welpen werden in einen Operationssaal genommen, führen Sie die Apikalchirurgie unverzüglich zu minimieren ihre Zeit damit verbracht von der Mutter getrennt und das Risiko der Mütter Kannibalisierung zu reduzieren.
- Setzen Schwämme auf einem Eis-Bett und legen Sie dann einen Welpen auf dem Schwamm für ~ 3 min zu Unterkühlung Anästhesie zu erreichen. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachtung apnea und Akinese und Kneifen einen hinteren Fuß. Überprüfen Sie den Status des Neugeborenen häufig, weil zu wenig Zeit nicht den Welpen akinetischen und Apnoen, und eine übermäßige Dauer der Anästhesie kann die Überlebensrate 12 niedriger zu machen.
2. Thorakotomie
- Bringen Sie den Welpen aus dem Eis Bett auf eine chirurgische Tischbereich und verwenden Sie Klebeband um seine Arme, Beine und Schwanz in Rückenlage zu immobilisieren.
- Desinfizieren Sie die Brust mit Betadin und reinigen Sie sie mit einem 70% igem Alkohol prep Pad sanft.
- Einen Querhautschnitt entlang des hervorZwischenRippenBereich des Brusthöhle mit einem Vannas Frühling Scissor und dann stumpf sezieren die hervorZwischenRippenMuskeln, um Zugang zum Herzen zu erleichtern.
HINWEIS: Die Überlebensraten zu verbessern, wenn der Blutverlust wird während des chirurgischen Prozesses minimiert.
3. Chirurgische Amputation des Herzens ventrikuläre Apex
- Von Hand, vorsichtig anwenden Druck auf den Bauch, um die exteriorisierenApex des Herzens. Blut aufnehmen um den OP-Bereich mit einem sterilen Wattestäbchen für klare Visualisierung. Für scheinoperierten Kontroll Neugeborenen, gehen Sie direkt zu Schritt 4 (Naht und Wiederherstellung von Mäusen).
- Unter einem Vergrößerungslampe und mit Iridektomie Schere vorsichtig auszuführen stück Resektion des linken Ventrikels (LV), bis der LV Kammer ausgesetzt ist. Seien Sie vorsichtig, um die reseziert Teile des LV minimieren. Etwa 15% Resektion ist notwendig, um eine optimale Belichtung der LV Kammer zu erreichen.
- Sicherzustellen, dass das Herz wieder in den Brustraum, sobald der LV Kammer ausgesetzt ist.
4. Naht und Wiederherstellung von Mäusen
- Naht der Rippen und Muskeln zusammen, um die Brusthöhle zu versiegeln mit sterilen Proline 6-0 Nahtmaterial, und dann sorgfältig schließen Sie die Hautschnitt Site mit Hautkleber.
- Erwärmen Sie die Neugeborenen unter einer Wärmelampe für ca. 3 min für die Wiederherstellung, und klicken Sie dann reinigen das Blut und Leimspuren mit einem 70% igem Alkohol prep Pad before Wiedereinführung seine Wurfgeschwister. Versuchen Sie, den gesamten chirurgischen Eingriffs innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen werden, da die Minimierung der Zeitaufwand von der Mutter getrennt verbessert pup Überleben nach Wurzelspitzenresektion.
- Nach jeder Operation, legen die chirurgischen Werkzeuge in Kontakt mit den Wülsten des heißen Wulst Sterilisator für etwa 20 sec für die vollständige Sterilisation. Lassen Sie die chirurgische Instrumente auf RT vor jeder Operation zu kühlen.
- Nach Abschluss der Operationen für alle Welpen in einem Wurf, mischen Sie die Welpen mit Bettwäsche und Kot der Mutter, bevor sie dann wieder in Nest der Mutter.
HINWEIS: Im Allgemeinen sind ICR / CD-1-Mäusen besser Pflegemütter als C57BL / 6, aber auch bei stillenden Müttern mit dem gleichen genetischen Hintergrund, variieren Förderung Instinkte. Wenn Ändern einer stillenden Mutter ist notwendig, um die Sterblichkeit durch mütterliche Kannibalisierung zu reduzieren, entfernen Sie die P0 Welpen auf eine stillende Mutter und führen Sie dann Wurzelspitzenresektion an P1. Entweder den Schein-Operation oder die apikale r nur durchführenesection in einem Wurf von Welpen, weil das Mischen Schein und chirurgische Jungtieren konnte die Überlebensraten der chirurgischen Gruppe von Welpen 6 zu verringern.
5. Post-OP-Analyse
- Einen Tag nach der Operation, die Welpen zu überwachen, stellen Sie sicher, dass es keinen Unterschied zwischen Schein und chirurgische Gruppen und zählen die Anzahl der Welpen, um die Überlebensrate zu messen. Wenn die Operationen richtig durchgeführt wird, sollte die Überlebensraten ähnlich und mehr als 60% sowohl in der Schein-und chirurgischen Gruppen sein.
- Herz Isolierung und Fixierung.
- Euthanize die Welpen an den Tagen 1 und 2 nach der Operation über die Enthauptung und Tag 21 nach der Operation von CO2 mit der Versicherung des Todes durch Genickbruch, dann reinigen Sie die Brust mit einem 70% igem Alkohol prep.
- Einzuschneiden die Mittellinie Haut und Muskeln der Brust und öffnen Sie die Brust.
- Verbrauchsteuern Das gesamte Herz aus dem Brustraum und befestigen Sie das gesamte Herz einer jeden Probe in 5 ml 4% Paraformaldehyd O / N bei RT.
- Am nächsten Tag, übertragen Sie die Proben auf 70% Ethanol. Die Proben können bis zu einer Woche vor dem Paraffineinbettung gespeichert werden.
- Slice 5 um dicke Paraffinschnitte durch das gesamte Herzkammer und führen Sie Standard Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Massons Trichrom-Färbung, um die regenerative Antwort 5, 7 zu untersuchen. Insbesondere H & E-Färbung wird verwendet, um Muskelersatz zu prüfen und Massons Trichrom-Färbung verwendet um fibrotische Reaktionen 5 zu untersuchen.
- Wählen Sie den Bereich von Interesse und mindestens drei Foci pro Probe manuell mit einem Dia-Scanner eingestellt. Bild und analysieren die Färbung Folien bei 40-facher Vergrößerung nach den Anweisungen des Herstellers mit Standardparametern.
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Ergebnisse
Maus Welpen eingeschläfert 1, 2, und 21 Tage nach der Wurzelspitzenresektion, und ihre Herzen wurden für die H & E und Massons Trichrom gesammelt. Blaue Farbe in Massons Trichrom-Färbung zeigt die Ablagerung von epikardialen extrazellulären Matrix 5. Mit erfolgreichen Wurzelspitzenresektion, ist ein Blutgerinnsel effektiv gebildet, um die LV 1 Tag nach Wurzelspitzenresektion abzudichten, wie in 1A gezeigt. Eine allmähliche Resorption des Blutgerinnsels und frühen Herzfibrose beobachtet wi...
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Diskussion
Die kardiale Regeneration zeigt Potenzial für die Behandlung und Prävention von Herzinsuffizienz1, 2. Tiermodelle sind unverzichtbar und spielen eine entscheidende Rolle für das Verständnis, wie die kardiale Regeneration abläuft3-6. Viele Amphibien und Fische regenerieren Herzgewebe als Reaktion auf Verletzungen, was einen Einblick in unser Verständnis von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen gibt13, 14. Im Hinblick auf die Evolution sollte die Pathophysiologie jedoch zwischen einem ...
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Offenlegungen
Publikationskosten für diesen Artikel wurden von einem Geschenk von Fine Science Tools, um Dr. Jian Hou gesponsert.
Danksagungen
Die Autoren danken Drs. James Hawkins, Zu-Xi Yu Xuan und Qu aus dem National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) für ihre Unterstützung bei der Maus-Operation und Vorbereitung und Färbung von Paraffinschnitten. Die Autoren sind dankbar, dass die NIH Fellows Editorial Board für die redaktionelle Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Olsen-Hegar Nadelhalter mit Schere, 1,5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Federschere - 2 mm Cutting | Edge Fine Science Tools | 15000-03 | Iridektomieschere |
| Bead Sterilisator | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Irispinzette, gerade, gezahnt | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris-Pinzette, gebogene, gezackte | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea-Schere - gebogen/stumpf-stumpf/12 cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Nahtbindezange mit rundem Griff, gerade | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Vannas Federschere mit rundem Griff | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hämostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Lupenleuchte | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heizlampe | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene Nahtmaterial | Ethicon | 8889H | |
| Hautkleber-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Applikatoren mit Baumwollspitze | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alkohol-Vorbereitungspad | Covidien | 6818 | Medium 2-lagig, 200/BOX, gesättigt mit 70% Isopropylalkohol |
| Curity Allzweckschwämme | Covidien | 9024 | Vlies 4-lagig, 4"x4" (10,2cm&mal; 10,2 cm) |
| Schutzblatt für die Tischplatte | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19,5" (45,72 cm x 49,53 cm) x 50 |
| 0,9 % Natriumchlorid, 250 ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadin-Lösungsstäbchen | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoklav | TOMY Digital Biology | SX-700 | HOCHDRUCK-DAMPFSTERILISATOR |
| Objektträgerscanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
Referenzen
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- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
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- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
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- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
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Nachdrucke und Genehmigungen
