Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Stimulation der elektrischen Aktivität von in-vitro-Zellkulturen mit sichtbarem Licht beschrieben, das auf der Verwendung organischer halbleitender Polymere basiert.

Zusammenfassung

Hybride Grenzflächen zwischen organischen Halbleitern und lebenden Geweben stellen ein neues Werkzeug für in-vitro und in-vivo Anwendungen dar. Insbesondere konjugierte Polymere weisen mehrere optimale Eigenschaften als Substrate für biologische Systeme auf, wie z. B. gute Biokompatibilität, hervorragende mechanische Eigenschaften, kostengünstige und einfache Verarbeitungstechnologie und die Möglichkeit der Abscheidung auf leichten, dünnen und flexiblen Substraten. Diese Materialien wurden für zelluläre Schnittstellen wie neuronale Sonden, Transistoren zur Anregung und Aufzeichnung neuronaler Aktivität, Biosensoren und Aktuatoren für die Wirkstofffreisetzung eingesetzt. Jüngste Experimente haben auch die Möglichkeit gezeigt, konjugierte Polymere für die rein optische Modulation der elektrischen Aktivität von Zellen zu verwenden. Es wurden mehrere Fälle von In-vitro-Studien berichtet, darunter primäre neuronale Netzwerke, Astrozyten und Zellen der sekundären Linie. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die durch organische Polymere vermittelte Signal-Phototransduktion die Lichtempfindlichkeit in degenerierten Netzhäuten wiederherstellt, was darauf hindeutet, dass diese Geräte in Zukunft für künstliche Netzhautprothesen verwendet werden könnten. Alles in allem stellen lichtempfindliche konjugierte Polymere einen neuen Ansatz zur optischen Modulation der zellulären Aktivität dar.

In dieser Arbeit werden alle Schritte beschrieben, die zur Herstellung einer Biopolymer-Grenzfläche zur optischen Anregung lebender Zellen erforderlich sind. Die Funktion des aktiven Interfaces besteht darin, den Lichtreiz in eine Modulation des Zellmembranpotentials umzuwandeln. Als Studienfall, der für In-vitro-Studien nützlich ist, wird ein Polythiophen-Dünnfilm als funktionelle, lichtabsorbierende Schicht verwendet, und menschliche embryonale Nierenzellen (HEK-293) werden als biologische Komponente der Grenzfläche verwendet. Es werden praktische Beispiele für die erfolgreiche Steuerung des Zellmembranpotentials nach Stimulation mit unterschiedlich langen Lichtimpulsen vorgestellt. Insbesondere wird gezeigt, dass in Abhängigkeit von der Dauer des Lichtreizes sowohl depolarisierende als auch hyperpolarisierende Effekte auf die Zellmembran erzielt werden können. Das berichtete Protokoll hat allgemeine Gültigkeit und kann ohne weiteres auf andere biologische Präparate ausgeweitet werden.

Einleitung

Die Möglichkeit, die Zellaktivität mit einer präzisen räumlichen und zeitlichen Auflösung Manipulation stellt eine wichtige Strategie in der neurowissenschaftlichen Forschung und bei der Behandlung von neurologischen und psychiatrischen Störungen. ¹ Herkömmliche Verfahren werden auf eine elektrische Stimulation von Zellen unter Verwendung von Elektroden in der Nähe oder in Kontakt mit positioniert basierend die gezielte System, ^{2, die} unterschiedlicher Komplexität sein kann (einzelne Zelle, Mobilfunknetzes, Hirnschnitten, In-vivo-Hirngewebe). Während des letzten Jahrhunderts, haben die Verwendung von Patch-Clamp, Metall und Substrat integrierten Elektroden ein detailliertes Bild von der Physiologie und Pathophysiologie von einzelnen Nervenzellen und der Funktionsmechanismen von neuronalen Netzen zur Verfügung gestellt. Allerdings leidet die elektrische Stimulation von wichtige Einschränkungen. Der erste wird mit einer allgemein schlechten räumlichen Auflösung aufgrund der physikalischen Abmessungen der Elektroden und deren fester Geometrie, die nicht ohne weiteres angepaßt werden kann bezogenenbis hin zu komplexen organisierte Systeme wie biologische Gewebe. Auch kann es zu Problemen mit den Elektroden-Impedanz und des Übersprechens zwischen Stimulations- und Aufzeichnungssysteme aus den Abschluss Signal-Rausch-Verhältnis der Messungen verschlechtert. ^{3 Auf der} anderen Seite kann die Verwendung von Licht zur Anregung helfen, viele Einschränkungen zu überwinden der elektrischen Ansatz. Zunächst einmal bietet sie völlig neue Raum (<1 um) und zeitliche Auflösung (<1 ms), so dass es möglich ist, spezifische Zelltypen oder sogar Unter Zellkompartimente zu zielen. Darüber hinaus ist es sehr nicht-invasive, da es keine physischen Kontakt mit dem Gewebe von Interesse vermeidet und entwirrt Stimulation von Aufnahme. Außerdem kann sowohl der Lichtintensität und der Wellenlänge genau reguliert werden und somit unterschiedlichen Stimulationsprotokolle angewendet werden kann. ^3,4

Allerdings wissen die meisten tierischen Zellen nicht vorhanden irgendeine spezifische Lichtempfindlichkeit. Mehrere Strategien für optische stimulation Damit haben vorgeschlagen, entweder in der Nähe oder innerhalb der Zellen auszunutzen lichtempfindliche molekulare Mediatoren oder mit photoaktiven Bauelementes außen gelegt, in der Nähe der Zelle. Die erste Kategorie bezieht sich auf endogene Mechanismen wie die Stimulation über sichtbares oder infrarotes (IR) Licht, wie auch die Verwendung von entweder photoisomerisierbare / photospaltbaren Verbindungen oder die genetische Expression von lichtempfindlichen molekularen Aktuatoren (Optogenetik). Letztere Klasse umfasst Techniken für die exogene Stimulation mit dem Einsatz von anorganischen Nano- / Mikropartikel oder photoleitende Siliziumsubstraten erreicht. ⁵ Doch alle diese Systeme haben helle Seiten und Nachteile. Insbesondere endogen Absorption von Zellen in dem sichtbaren Bereich schwach und nicht zuverlässig, und die damit verbundene Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies kann schädlich für die Zelle sein. Im allgemeinen wird IR zum Induzieren lokaler thermischer Erwärmung aufgrund der Wasserabsorption verwendet, aber die Extinktionskoeffizienten von Wasser gering ist, so st bedürftigenrong Infrarotlicht (von zehn bis hundert W ^/ mm 2), die schwer über Standard-Mikroskop-Optiken liefern und kann Sicherheitsbedenken für die In-vivo-Anwendungen stellen ist. Auf der anderen Seite, haben photoschaltbare Käfigverbindungen eine zeitlich begrenzte Wirkung und erfordern oft UV-Licht, die schwer zu liefern, ist aufgrund der begrenzten Gewebepenetration. Außerdem leiden sie unter Diffusionsproblemen der aktivierten Verbindungen durch Photolyse außerhalb des beleuchteten Bereichs. Schließlich haben optogenetische Werkzeuge Wissenschaftlern erlaubt, spezifische zelluläre Subpopulation und Unterfächer zielen und sich rasch zu einer der Schlüsseltechnologien in der neurowissenschaftlichen Forschung. , Einsetzen eines exogenen DNA-Segment über einen viralen Vektor wirft jedoch wichtige Fragen der Sicherheit, insbesondere im Hinblick auf die Annahme an menschlichen Patienten. ^5,6 Aus diesen Gründen ist die Forschung an neuen Materialien und Vorrichtungen, die Zellenlichtmanipulation ist ein extrem heißes Thema.

Kürzlich wurde ein neuartigerAnsatz basierend auf der Verwendung von lichtempfindlichen konjugierter Polymere in der Lage, einen optischen Reizes effizient transduzieren zu einer Modulation der Zell elektrische Aktivität, vorgeschlagen worden. Die Zellstimulation durch Polymer Photoanregung (CSPP) Technik nutzt viele Schlüssel ermöglicht Funktionen typischer organischer Halbleiter: Sie eigen empfindlich auf Licht im sichtbaren Bereich sind; ⁷ sie biokompatibel, angenehm weich und anschmiegsam sind und deren mechanische Flexibilität ermöglicht eine intime Schnittstelle mit Gewebe sowohl In-vitro- und ^{In-vivo-8-10.} Abgesehen davon, können sie leicht funktionalisiert werden, um eine bessere Anpassung an die Schnittstelle mit lebenden Zellen und spezifische Anregung zu ermöglichen, Sondieren und Erfassungsfähigkeiten werden. ^11,12 Darüber hinaus unterstützen sie die elektronische als auch Ionentransport, wodurch sie ideal für die Kombination Elektronik ad Biologie. ^13,14 Interessant ist, sie in der Photovoltaik-Modus arbeiten kann, wodurch die Notwendigkeit, eine externe Bias-f anwendenoder effiziente Zell optische Stimulation. ¹⁵

Die Zuverlässigkeit der CSPP Technik wird bisher in mehreren Systemen bewiesen, einschließlich primären Neuronen, Astrozyten ^15,16, 17 sekundäre Zelllinien ^{18 und} explantierten Netzhautgewebe. ¹⁶ In dieser Arbeit, alle notwendigen Schritte, um eine lichtempfindliche Biopolymer herzustellen ^{Schnittstelle} 19 für optische Stimulation der In-vitro-Systeme sind im Detail beschrieben. Wie eine Studie Fall einer prototypischen organischen Photovoltaik Mischung aus regions regelmäßigen Poly (3-hexylthiophen) (rr-P3HT), der als der Elektronendonor und Phenyl-C61-Buttersäure-Säure-Methylester (PCBM), als amtierender die Elektronenakzeptor verwendet. Wie das biologische System, sind menschliche embryonale Nieren (HEK-293-Zellen) verwendet. Ein Beispiel eines Photo Protokoll mit der relativen Aufnahme von Zellaktivität über elektrophysiologische Messungen vorgesehen.

Die beschriebene Plattformist jedoch der allgemeine Gültigkeit, und es kann leicht auf die Verwendung von anderen konjugierten Polymeren ausgedehnt werden (durch geeignetes Einstellen der Lösung Herstellungsverfahren und die Abscheidungsparameter) für unterschiedliche Zelltypen (durch entsprechendes Ändern des Zellkulturprotokoll, Überzug Verfahren und die angeforderte für Zellaussaat und Proliferation) und verschiedene Stimulationsprotokolle (Lichtwellenlänge, Frequenz und Dauer Reize, Photoanregung Dichte).

Protokoll

1. Herstellung von Photoaktive Substrate

1. Vorbereitung einer P3HT: PCBM Lösung (1: 1 w / w) in Chlorbenzol bei einem P3HT Konzentration von 20 g / L. Mische die Lösung mit einem Magnetrührer mindestens 4 Stunden bei 60 ° C. Betrachten wir ein Volumen von 150 ul der Lösung für jedes Substrat hergestellt werden soll.
2. Sauberes ITO-beschichtete Glasobjektträger (R _{s =} 10 Ω / sq, 18x18 mm ^2, Dicke 170 um) mit aufeinanderfolgenden Bädern von entionisiertem Wasser, Aceton und Isopropanol in ein Ultraschallbad (10 Minuten für jeden Schritt). Trocknen Sie die Deckgläser mit einem Stickstoff-gun. Setzen Sie die Proben in einem Plasma cleaner bei 100 W Leistung für 10 min.
3. Abzuscheiden einen dünnen Film der aktiven Schicht auf den gereinigten Substraten durch Spin-Beschichtung.
   1. Mit einer Diamantspitze, schneiden ein Mikroskopglasträger (Dicke ≈ 1 mm), um den gleichen lateralen Abmessungen der ITO-beschichteten Substrate. Entfernen Sie die P3HT: PCBM-Lösung von der Heizplatte und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen.
   2. Stellen Sie eine Zwei-steps Spincoater Programm: i) 30 Sekunden bei 800 Umdrehungen pro Minute; ii) 30 sec bei 1600 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie die Folie auf dem Spannfutter der Spin-Coater und starten Sie das Vakuum, um es zu beheben. Einen Tropfen Aceton auf der Folie und dann das gereinigte Substrat, wobei die ITO-beschichtete Seite nach oben. Starten Sie den Spin-Coater Drehung des überschüssigen Aceton loszuwerden.
   3. Setzen Sie 150 ul P3HT: PCBM-Lösung auf den Substraten und starten erneut die Spin-Coater (verwenden Sie in 1.3.2 beschrieben das gleiche Protokoll).
   4. Nach dem Schleuderbeschichtungsvorrichtung beendet ist, entfernen Sie die Probe und vorsichtig lösen das beschichtete Substrat aus dem Glasobjektträger. Reinigen Sie die Rückseite des Substrats mit einer Reinraum-Tupfer in Aceton getaucht.
      Hinweis: Die photoaktiven Substraten kann für ein paar Tage in einem dunklen Kasten gelagert werden, bis sie verwendet. Für längere Zeiträume, halten sie in einem Handschuhfach mit Inertgas.

2. Herstellung von Zellkulturmedium Electrophysiology Lösungen

1. Bereiten Sie die komplette Wachstumsmedium (CGM) fürHEK-293-Zellen: Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) nicht hitzeinaktiviert, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. Sterilisieren des Mediums mit einem 0,2 & mgr; m-Filtersystem und bei 4 ° C.
2. Bereiten Sie den extrazellulären Lösung in ultrareinem Wasser (Konzentration in mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 Glucose, 1,8 _CaCl 2, 1 _MgCl2. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Sterilisieren der Lösung mit einem 0,2 & mgr; m-Filtersystem und bei 4 ° C.
3. Vorbereitung der intrazellulären Lösung in ultrareinem Wasser (Konzentration in mM): 12 KCl, 125 K-Gluconat, 1 MgCl _2, 0,1 CaCl _{2, 10} EGTA, 10 HEPES, 10 _ATP-Na 2. Beachten Sie, dass _ATP-Na 2 ist hitzeempfindlich und letzten hinzufügen. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Sterilisieren der Lösung mit einem 0,2 & mgr; m-Filtersystem, aliquoten in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C.

3. Überzug HEK-293 Zellenauf die aktive Untergründe

1. Platzieren des photoaktiven Substrat in einem Becherglas mit Aluminium oder einer verschlossenen Petrischale abgedeckt und in einen Ofen gegeben bei 120 ° C für 2 h zur Sterilisation. Von diesem Zeitpunkt an, führen alle Operationen unter sterilen Bedingungen. Setzen Sie die Proben in einem sterilen Haube und lassen Sie sie abkühlen.
2. Beschichten des photoaktiven Substrat mit einer Haftschicht, um die Oberflächenhydrophobie zu vermindern und die Zelladhäsion fördern.
   1. Legen Sie die aktiven Substraten in einer P35 Petrischale oder ein 6 Multiwellplatte. Angesichts der Hydrophobie der konjugierten Polymerschicht, stellen ein Polydimethylsiloxan (PDMS) auch, um die Probe zu fixieren und beschränken die Lösungen.
      1. Mischungs PDMS und Katalysator in einem 10: 1-Verhältnis mit einem Glasstab, um eine viskose Aufschlämmung zu erhalten.
      2. Gießen der Aufschlämmung in eine Multiwell-Platte 6, Abgeben einer ausreichenden Menge, um die Hälfte der Vertiefungen bedecken.
      3. Warten PDMS Polymerisation bei RT.
      4. Schneiden Sie die gehärtete PDMS in der Mitte für OBTAining eine quadratische Form mit den gleichen Abmessungen der Polymerprobe.
      5. Sterilisieren PDMS Vertiefungen durch Eintauchen in eine 70% Ethanol-Wasser-Mischung für mindestens 30 min.
   2. Wenn mit den PDMS gut, Kratzer auf der photoaktiven Schicht entlang der gesamten Grenze zwischen dem mit spitzen Pinzette, um die Ablösung der gesamten Schicht zu vermeiden, wenn das Entfernen der PDMS auch nach Zellkultivierung.
   3. Decken die gesamte Oberfläche jeder Probe mit einer Fibronektin-Lösung (2 mg / l in PBS). Ein Volumen von 500 bis 750 & mgr; l pro Probe ist normalerweise ausreichend, wenn ein PDMS auch verwendet wird (klare Oberfläche der Wanne: 15x15 ^mm 2). Ohne die PDMS gut, sind notwendig, um die Probe vollständig einzutauchen etwa 2 ml Fibronektin-Lösung; darauf achten, dass das Substrat nicht zu schweben, während die Zugabe der Lösung. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für mindestens 1 Std.
   4. Entfernen Sie die Fibronektin-Lösung mit einer Glaspipette und einmal mit 2 ml PBS waschen.
3. Plaß HEK-293-Zellen an Fibronektin behandelten Proben mit einer Dichte von 15.000 Zellen / cm ^{2 in} vollständigem Wachstumsmedium. Verwenden ein Volumen von 750-1.000 ul CGM für jede Probe, ob ein PDMS auch verwendet, ansonsten 2-3 ml CGM notwendig sind. Die Zellen für 24-48 Stunden bei 37 ° C und 5% _CO 2.

4. Optische Stimulation Protokoll und elektrophysiologische Messungen

1. Setzen der extrazellulären Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C bis zu thermalisieren; tauen die intrazelluläre Lösung, steckte es in eine 1 ml-Spritze mit einer 34-Gauge-Nadel und halten Sie sie in Kontakt mit Eis, um den Abbau des ATP zu vermeiden.
2. Werfen Sie einen Zell beschichtete Substrat aus dem Inkubator, sorgfältig Entfernen der PDMS auch, falls vorhanden. Entfernen Sie das Wachstumsmedium mit einer Glaspipette und spülen Sie die Probe mit extrazellulären Lösung. Gehen Sie langsam auf Zellablösung zu vermeiden.
3. Legen Sie das Gerät in den Probenhalter des Elektrophysiologie-Station mit extrazellulären solution und die Referenzelektrode. Bereiten Sie frische Glasmikropipetten für Patch-Clamp mit einem Abzieher (ideal Widerstand im Bereich von 2-4 MOhm). Füllen Sie die Hälfte der Pipette mit intrazellulären Lösung und montieren es auf dem Mikromanipulator.
4. Suchen Sie nach einer gesunden Zelle, um das Gerät zu patchen. Um unerwünschte Anregung des photoaktiven Substrats zu vermeiden, die IR-Beleuchtung für die Abbildung, indem ein Langwellenlängenpassfilter (zum Beispiel kann ein Kantenwellenlänge λ = 750 nm für Polymere absorbieren im sichtbaren verwendet werden) vor der Mikroskopleuchte.
5. Patch die ausgewählte Zelle und wenden das gewünschte Protokoll für optische Stimulation durch Liefern Licht an die Probe über die Fluoreszenzanregung Gang des Mikroskops (1). Eine detaillierte Beschreibung der patch-clamp-Protokoll kann in dem Bezugszeichen 20 festgestellt werden.
   1. Positionieren Sie die Patch-Pipette in unmittelbarer Nähe zu der Zellmembran mit einem mikrometrischen Manipulator. Während der Positionierung gelten overpressure auf die Pipette, um Schmutz kleben an der Spitze zu vermeiden. Die Pipette sollte wenige Mikrometer über der Zelle sein.
   2. Starten Absenken der Pipette auf die Zellmembran, während die Pipette Widerstand auf der Patch-Steuerungssoftware. Wenn die Pipettenwiderstand hat etwa 1 M erhöht wird, entfernen Sie den Überdruck aus der Pipette, während eine sanfte Saugwirkung, um die undurchlässige Verbindung von der Pipette und der Zellmembran bilden (dh, der gemessene Widerstand sollte bei Werten zu erhöhen mehr als 1 G & Omega;) .
   3. Anwenden eines negativen Potentials an die Pipette in der Nähe der erwarteten Zellenruhepotential (für HEK293-Zelle ein Potential von -40 mV verwendet werden kann), um die Stabilisierung der Dichtung. Kompensation der kapazitiven Transienten aufgrund der Pipette Kapazität mit den relativen Befehle auf der Patch-Verstärker und / oder dem Patchsteuerungssoftware.
   4. Brechen Sie die Membran in elektrische Zugang zum Zytoplasma der Zelle durch Anlegen eines kurzen und intensiven Saugimpuls ermöglichenan der Pipette. Gesetzt den Patch Verstärker aktuellen Clamp-Modus (I = 0, das heißt, kein Strom in die Zelle injiziert), um den Zellmembranpotential verfolgen. Einige Minuten warten, um zu sehen, wenn die Zellspannung stabil ist.
   5. Bringen die gewünschten Beleuchtungsablauf zur Zelle und Aufzeichnung der Wirkung auf das Membranpotential.
      Anmerkung: Die Beleuchtung kann auf die Probe entweder von unten oder von oben zugeführt werden, abhängig von der Mikroskop-Architektur.
      1. Wählen einer Anregungswellenlänge, die auch von dem aktiven Material absorbiert wird; für die P3HT: PCBM Mischung kann eine Wellenlänge in dem 450-600 nm-Bereich verwendet werden. Geeignete Photoanregung Dichten liegen im Bereich von 10-100 mW ^/ mm 2.
         Anmerkung: Kurze Pulse von Licht (unterhalb 10-20 msec) führen zu einer vorübergehenden Depolarisation der Zelle, während bei längerem Beleuchtung (hundert Millisekunden oder mehr Impulse) eine anhaltende Hyperpolarisation beobachtet wird, bis das Licht ausgeschaltet wird.

Ergebnisse

Zellen können auf P3HT leicht gezüchtet werden: PCBM Substrate, sofern eine geeignete Haftschicht abgeschieden wird (wie das in Schritt 3.2 der beschriebenen Protokoll verwendet Fibronektin). P3HT: PCBM optischen Absorptionsmaxima im grünen Teil des sichtbaren Spektrums; aber andere lichtempfindliche konjugierte Polymere können ausgewählt werden, gemäß der bevorzugten Photowellenlängen-Bereich (Abbildung 2). Biokompatibilität dieser Substrate wurde gezeigt, nicht nur mit...

Diskussion

Kritischen Schritte der gemeldeten Protokoll für in-vitro optische Stimulation von Zellen die Wahl des lichtempfindlichen Polymers, der thermischen Sterilisationsparameter, die Intensität und die Dauer der Lichtreize hauptsächlich betreffen. Eine P3HT: hier wurde PCBM dünnen Film ausgewählt, weil es eine gute zeitliche und elektrochemische Stabilität garantiert. Allerdings sollte man beachten, dass nicht alle lichtempfindliche Polymere können analoge Leistungen insbesondere bei Beleuchtung ^bieten, 22...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-beschichtete Substrate	Nano-CS	IT10300100
Fibronektin	Sigma Aldrich	F1141
Chlorbenzol	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
Aceton	Sigma Aldrich	270725
Isopropylalkohol	Sigma Aldrich	563935
HEK-Zellen	LGC Standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC Standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-FBS
	LGC Standards srl	ATCC-30-2020