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Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

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DOI:

10.3791/53552

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2. April 2016

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Zusammenfassung

Enhancer steuern die Zellidentität, indem sie die gewebespezifische Genexpression positions- und orientierungsunabhängig regulieren. Diese Enhancer befinden sich oft distal vom regulierten Gen in intergenen Regionen oder sogar im Körper eines anderen Gens. Die positionsunabhängige Natur der Enhancer-Aktivität macht es schwierig, Enhancer mit den Genen in Einklang zu bringen, die sie regulieren. Die Deletion einer Enhancer-Region liefert einen direkten Beweis für die Enhancer-Aktivität und ist der Goldstandard, um die Rolle eines Enhancers bei der endogenen Gentranskription aufzudecken. Herkömmliche homologe rekombinationsbasierte Deletionsmethoden wurden durch die jüngsten Fortschritte in der Genome-Editing-Technologie übertroffen, die schnelle und präzise lokalisierte Veränderungen an den Genomen zahlreicher Modellorganismen ermöglichen. Die CRISPR/Cas9-vermittelte Genomeditierung kann verwendet werden, um das Genom in vielen Zelltypen und Organismen schnell und kostengünstig zu manipulieren, da Cas9 durch eine Leit-RNA aus einem maßgeschneiderten Expressionsplasmid leicht auf das Genom ausgerichtet werden kann. Die homozygote Deletion essentieller genregulatorischer Elemente könnte zur Letalität führen oder den zellulären Phänotyp verändern, während die monoallelische Deletion von Transkriptionsverstärkern die Untersuchung der cis-Regulation der Genexpression ohne dieses verwirrende Problem ermöglicht. Hier wird ein Protokoll für die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion in embryonalen Stammzellen (ES) der Maus (Mus musculus129 x Mus castaneus) vorgestellt. Die monoallelische Deletion, das Screening und die Expressionsanalyse werden durch Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) zwischen den beiden Allelen erleichtert, die in diesen Zellen durchschnittlich alle 125 bp auftreten.

Einleitung

Transkriptions - Regulationselemente sind entscheidend für die räumlich-zeitliche Feinabstimmung der Genexpression während der Entwicklung 1 und Modifikation dieser Elemente in Krankheits 2 aufgrund aberrant Genexpression führen kann. Viele krankheitsassoziierten Regionen durch genomweite Assoziationsstudien identifiziert sind in nicht-kodierenden Regionen und verfügen über Funktionen von Transkriptionsverstärker 3-4. Identifizieren Enhancer und passender sie mit den Genen regulieren sie ist kompliziert , da sie oft mehrere Kilobasen entfernt von den Genen liegen sie regulieren und kann 5-6 in einer gewebespezifischen Weise aktiviert werden. Enhancer Prognosen werden auf Histonmodifikation Marken, Mediator-cohesin Komplexe häufig basiert und Bindung von zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren 7-10. Validierung des vorhergesagten Verstärker wird am häufigsten durch einen vektorbasierten Assay durchgeführt , in dem der Verstärker 11-12 Expression eines Reportergens aktiviert. Diese Daten liefern valuable Informationen über das regulatorische Potential mutmaßlicher Enhancer-Sequenzen, aber nicht offenbaren ihre Funktion in ihrer endogenen genomischen Kontext oder zu identifizieren, die Gene, die sie regulieren. Genome Bearbeitung dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion von Transkriptionsregulationselemente in ihrer endogenen Zusammenhang mit loss-of-function-Analyse zu untersuchen.

Jüngste Fortschritte in der Genombearbeitung, nämlich die CRISPR / Cas9 Genom Editing-System, ermöglichen die Untersuchung der Genomfunktion. Der CRISPR / Cas9 System ist einfach zu bedienen und anpassungsfähig für viele biologische Systeme. Das Cas9 Protein wird durch eine Führungs RNA (gRNA) 13 in das Genom an einer bestimmten Stelle ausgerichtet sind . Der SpCas9 / gRNA Komplex durchsucht das Genom für seine Ziel genomischen Sequenz , die 5 'angrenzend Motiv (PAM) Sequenz, NGG 14-15 zu einem protospacer sein muss. Basenpaarung der gRNA zu seinem Ziel, eine 20 Nukleotid (nt) Sequenz, die komplementär zu der gRNA aktiviert SpCas9 Aktivität Nuklease in einem Doppe ergebe Strangbruch (DSB) 3 bp stromaufwärts der PAM-Sequenz. Die Spezifität wird durch vollständige Basenpaarung in der Seed-Region gRNA erreicht, die 6-12 nt neben dem PAM; Umgekehrt Mismatches 5 'des Saatgutes werden üblicherweise 16-17 toleriert. Das eingeführte DSB repariert werden können, entweder durch die nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) DNA-Reparatur oder Homologie gerichteten Reparatur (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-Reparatur oft Einfügen / Löschen (indels) von wenigen bp an der Zielstelle erzeugt, die stören können der offene Leserahmen (ORF) eines Gens. Um größere Deletionen im Genom zwei gRNAs erzeugen, welche die Region von Interesse flankieren, können 18-19 verwendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Untersuchung der transkriptionalen Enhancer geclustert in Locus - Kontrollregionen oder super-Enhancer , die größer sind als herkömmliche Enhancer 9,18,20-22.

Monoallelic Streichungen sind ein wertvolles Modell für cis -Regelung der Transkription zu studieren. Die beobachtete change in Transkriptebene nach monoallelic Deletion eines Enhancers korreliert mit der Stellung dieser Enhancer in Genregulation ohne die verwirrende Wirkungen, die potenziell Zell fitness Beeinflussung beeinträchtigt wird, wenn die Transkription von beiden Allelen auftreten können. reduzierte Expression Auswertung ist schwierig, jedoch ohne die Fähigkeit, die gelöscht aus dem Wildtyp-Allel zu unterscheiden. Weiterhin ohne die Fähigkeit , an jedem Allel - Deletionen Genotypisierung die beiden Allele zu unterscheiden , ist eine Herausforderung, insbesondere für große Deletionen von> 10 kb bis 1 Mb 23 , in dem es schwierig ist, die gesamte Wildtyp - Region durch PCR zu amplifizieren. Die Verwendung von F1 - ES - Zellen erzeugt durch Kreuzen Mus musculus 129 mit Mus castaneus können die zwei Allele durch allelspezifische PCR 18,24 unterscheiden. Das Hybrid-Genom in diesen Zellen erleichtert Allel-spezifische Deletion Screening und Expressionsanalyse. Im Durchschnitt gibt es eine SNP alle 125 bp zwischen diesen beiden GenomeFlexibilität für den Ausdruck und die Genotypisierung in Primer-Design, Untersuchungen. Die Anwesenheit eines SNP können die Primer Schmelztemperatur (T m) beeinflussen und Zielspezifität in real-time quantitative PCR (qPCR) Amplifikation unter Berücksichtigung Unterscheidung der beiden Allele 25. Weiterhin ist ein Mismatch innerhalb des Endes des Primers '3 beeinflußt stark die Fähigkeit der DNA - Polymerase aus dem Primer verhindert Amplifikation des Allels unerwünschten Ziel 26 zu erstrecken. Beschrieben in dem folgenden Protokoll ist die Verwendung von F1 - ES - Zellen für die Allel - spezifische Enhancer - Deletionen von mehr als 1 kb und anschließende Expressionsanalyse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 Genom Editiersystem (Abbildung 1).

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Abbildung 1. Enhancer Löschen mit CRISPR / Cas9 cis -REG zu studierenulation der Genexpression. (A) F1 ES durch eine Kreuzung zwischen Mus musculus sind 129 und Mus castaneus erzeugten Zellen für Allel - spezifische Löschen zu ermöglichen. (B) Zwei Führungs RNAs (gRNA) verwendet , um eine große Cas9-vermittelte Deletion des Enhancer - Region zu induzieren. (C) werden Primer - Sets verwendet , um große mono- und bi-allelische Deletionen zu identifizieren. Die orangefarbenen Primer sind die inneren Primer sind die lila Primer die äußeren Primer und die grünen Primer werden die gRNA flankierenden Primer. (D) Änderungen in der Genexpression verwenden allelspezifischen qPCR überwacht. RFU bezeichnet relative Fluoreszenzeinheiten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protokoll

1. Planen und Bauen der gRNA

  1. Transkriptions Enhancer-Regionen verwenden zwei gRNAs, ein 5 'und ein 3' der Region von Interesse zu löschen. Verwenden Sie die Maus UCSC Genom - Browser Spur durch das Labor Zhang generierte eindeutige gRNA Sequenzen (http://www.genome-engineering.org 15) zu identifizieren. Überprüfen Next diese gRNAs und ihren benachbarten PAM für SNPs und indels mit Online - Tools vom Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28 zur Verfügung gestellt. Um beide Allele mit gleicher Effizienz abzielen, vermeiden gRNA / PAM-Sequenzen, die einen SNP oder indel enthalten.
    1. Während die gRNA Wahl, überprüfen die Machbarkeit der Gestaltung Allel-spezifischen Primer, die für die Löschung Genotypisierung. Siehe Abschnitt 5 für Allel-spezifische Primer-Design.
  2. Montieren Sie die zwei gRNA Plasmide basieren auf dem Protokoll beschrieben in Mali et al. 2013 15. Integrieren Sie die ausgewählte einzigartige 20 bp Zielsequenz into die 61mer - Oligonukleotide , wie gezeigt (in 5 sind 'nach 3' Orientierung und die fett gedruckten Basen sind die 20 bp - Zielsequenz, die reversen Komplemente voneinander angezeigt Sequenzen) in Tabelle 7.
    1. Mischungs 10 ul von 10 uM gRNA Primer_F und 10 ul 10 uM komplementären Primer_R in einem Rohr.
    2. Annealing der Primer durch den Primer-Gemisch bei 100 ° C für 5 min inkubiert und dann abkühlen 1 ° C / sec bis 25 ° C. Für diesen Schritt verwenden, um eine PCR-Maschine oder das Rohr in kochendem Wasser legen und lassen Sie es auf RT abkühlen.
    3. Um den angelagerten Primers Mischung, fügen Sie die folgende Reaktionsmischung und Inkubation bei 72 ° C für 30 min jeden Primer zu verlängern: 18,5 ul Wasser, 10 ul 5x HF-Puffer, 1 ul 10 mM dNTP Mix und 0,5 ul Hoch fidelity DNA-Polymerase.
    4. Führen 10 ul Zielfragment auf einem 2% Agarosegel, das 100 bp-Fragmente zu bestätigen Führungs produziert.
    5. Linearisieren der gRNA Vektor (ein Geschenk von George Kirche; Addgene Plasmid # 41824) 15 mit Afl II durch die folgende Reaktion mit ein: 5 ul gRNA Vektorgerüst (2-4 ug), 5 ul 10x - Puffer, 3 ul Afl II (20 Einheiten / ul) und 32 ul aus Wasser. Inkubieren der Reaktionsmischung für 3 h bei 37 ° C.
    6. Führen Sie das verdaute Produkt auf einem 1% Agarose-Gel und zu reinigen, die DNA-Bande zu den 3,5 kb entspricht, die durch folgende Anweisungen des Herstellers gRNA Vektor mit einem Gel-Extraktions-Kits linearisiert.
    7. Set up Reaktionen Gibson Montage 29-30 linearisierte Vektor unter Verwendung gRNA und Zielfragment aus Schritt 1.2.3 wie folgt: 1 ul linear gRNA Vektor (50 ng / ul), 1 ul Zielfragment wurden 10 ul 2x Gibson Montage Mastermix und 8 ul Wasser. Inkubieren Reaktionen bei 50 ° C für 60 min.
  3. Die Transformation von E. coli - Zellen , die mit Assembled gRNA Vector.
    1. Mix 1 & mgr; l des zusammengesetzten Vektors aus gRNA 1.2.7und 50 ul DH5a (E.coli - Stamm) Zellen in einem Rohr. Transformieren die DH5a Zellen durch Hitzeschock-Verfahren, indem die Zellen auf 42 ° C für 45 sec ausgesetzt wird.
    2. Snap-Chill die Röhrchen auf Eis für 5 min; dann 400 & mgr; l SOC-Medium hinzufügen und 45 Minuten lang in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C inkubiert.
    3. Verbreiten Sie 100 ul der DH5a Zellen auf einer LB-Kanamycin (50 ug / ml) Platte für positive Selektion von transformierten Zellen und Inkubation O / N bei 37 ° C.
  4. Screening Positive E. coli - Kolonien für gRNA Einfügen.
    1. Wählen Sie eine Kanamycin-resistente Kolonie und Resuspendieren in 3 ml LB, enthaltend 50 ug / ml Kanamycin. Wiederholen Sie das gleiche für 6-8 Kolonien und Inkubation alle Röhrchen bei 37 ° CO / N in einem Schüttelinkubator.
    2. Extrahieren Plasmiden vom O / N gezüchteten Kultur Plasmid Mini prep Kits nach Herstelleranleitung folgende.
    3. Bereiten Sie eine EcoR I Verdauung Reaktionsmischung für gRNA Sequenz Einsatz zu prüfen ,in dem Plasmid. Für jede Probe herzustellen , die Reaktionsmischung wie folgt: 2 & mgr; l Enzympuffer, 1 ul EcoR I, 15 ul Wasser. Aliquot der Reaktionsmischung in 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 2 ul Plasmid. Inkubieren der Röhrchen bei 37 ° C für 2 Stunden.
    4. Führen Sie das verdaute Produkt auf einem 1,5% Agarosegel.
      Hinweis: Die Proben mit Einsatz wird ein 475 bp Band Größe anzuzeigen, ohne Einsätze 100 bp höher als die Klone ist.
      Hinweis: Alternativ können die positiven Klone durch Kolonie gescreent werden unter Verwendung von PCR Sp6 (vorwärts) und T7 (rückwärts) Primer (Tabelle 7) , daß binden an die Vektorsequenz Einsatz eine 642 bp Größe Fragment in Gegenwart einer gRNA zu geben. Die Kolonie - PCR - Ansatz ist von Vorteil , wenn ein in der gRNA Sequenz EcoR I - Restriktionsstelle ist.
  5. Bestätigen Sie die Reihenfolge der gRNA Einfügen von DNA-Sequenzierung unter Verwendung des T7 Primer.

2. Transfection

Hinweis:Elektroporation ist eine effiziente Methode von Plasmiden in ES-Zellen transfiziert. Das hier beschriebene Verfahren verwendet Mikroporator Transfektions-Technologie.

  1. Wachsen F1 - ES - Zellen in einer 10 cm mit Gelatine beschichteten Schale mit 10 ml ES - Zellmedium (Tabelle 1) bei 37 ° C / 5% CO 2. Wenn die Zellen 85% erreichen Konfluenz die Medien entfernen und 2 ml Trypsin hinzuzufügen. Für 5 min in dem CO 2 -Inkubator bei 37 ° C inkubieren.
    Hinweis: F1 ES - Zellen wurden erhalten von Barbara Panning 24 und sind auf Anfrage erhältlich.
  2. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 10 ml Spin Medium (Tabelle 2). Pipette wiederholt die Zellen vollständig zu lösen.
  3. Sammeln Sie alle Zellen in einem 15-ml-Tube und Spin bei 300 g für 5 min. Resuspendieren in 3 ml PBS und zählen Sie die Zellen einer Zählkammer oder automatisierten Zellzähler verwendet wird.
  4. Pellet 1 x 10 6 ES - Zellen in einem 1,5 ml - Röhrchen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 Minuten und Resuspendieren in 100 & mgr; l R (Aufwirbelung) Puffer wie von der Modellhersteller geliefert.
  5. In jeweils 5 ug von pCas9_GFP (ein Geschenk von Kiran Musunuru; Addgene Plasmid # 44719) 31, 5 'und 3' gRNA Plasmide zum Löschen des Zielgebiets und vorsichtig mischen mit einer Pipette die Einführung von Blasen zu vermeiden.
  6. Verwenden Sie die elektronische Pipettenspitze 100 ul der Elektroporation Mischung abzusaugen, wobei darauf geachtet, eine Blase in der Spitze zu vermeiden.
  7. Programm der Volt, Breite und Impulse für die Elektroporation. Für ES-Zellen F1, verwenden Sie 1400 V, 10 msec für 3 Impulse.
  8. Während die Elektroporation wird die Spitze laufen beobachten für jegliche Funken in der Lösung zu beobachten. Ein Funke zeigt das Vorhandensein einer Luftblase und mit der Transfektion stören.
  9. Auswerfen der transfizierten ES - Zellen in einer 10 cm mit Gelatine beschichteten Schale mit 10 ml ES - Zellmedium (Tabelle 1) und Inkubation bei 37 ° C / 5% CO 2.

3. FACS Sortierung transfizierter Zellen

  1. Nach 48 Stunden lösen die Zellen durch Zugabe von 2 ml Trypsin und Inkubation für 5 min bei 37 ° C im CO 2 Inkubator.
  2. Neutralisieren Sie die Platte durch Zugabe von 10 ml Sammelpuffer (Tabelle 3). Sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Tube und Spin bei 300 g für 5 min.
  3. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Sortierpuffer (Tabelle 4). Zählen Sie die Zellen und verdünnte auf der Basis der Sortierplattform. Verdünne die Zellen zu 0,5-1 x 10 6 Zellen / ml für die in 15 - ml - Röhrchen Sortieren und zum Sortieren direkt einzelnen Zellen in 96-Well - Platten verdünnt , die Zellen zu 2-5 x 10 6 Zellen / ml.
  4. Sortieren Cas9-GFP + ES - Zellen eine FACS Durchflusszytometer 32 verwendet wird . Sammeln Zellen in bulk in Röhrchen mit 2 ml Rückgewinnungsmedium (Tabelle 5) und die Platte wie in 3.5 für Kolonieaufnahme beschrieben, oder Sortier einzelnen Zellen direkt in mit Gelatine beschichteten 96-Well - Platten , enthaltend 100 & mgr; l Zellmedium ES / well ( Tabelle 1).
  5. Seed 1-1,5 x 10 4 GFP + ES - Zellen in einer 10 cm mit Gelatine beschichteten Schale mit 10 ml ES - Zellmedium (Tabelle 1). bei dieser niedrigen Dichte Überzug erleichtert einzelnen ES-Zellkolonien Kommissionierung.

4. Anzucht Klone für die Genotypisierung, Expressionsanalyse und Freezing Zell Stocks

  1. An Tag 4-5 nach der Sortierung, jede Vertiefung direkten sortiert 96-Well-Platten auf die Anwesenheit von ES-Zellkolonien erzielen.
    1. Distanzieren ES-Zellkolonien durch die Medien Entfernen und Hinzufügen von 30 ul Trypsin. für 5 min bei 37 ° C inkubieren. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 170 & mgr; l von ES - Zell - Medien (Tabelle 1), und Pipette nach oben und unten für eine vollständige Dissoziation der Kolonie in einzelne Zellen. Wachsen die Zellen bei 37 ° C / 5% CO 2 , bis die meisten Vertiefungen sind über 70% konfluent (üblicherweise 2-3 Tage).
  2. Pick Alternativ einzelnen ES-Zellkolonien aus 10 cm-Schalen mitein inverses Mikroskop. Nachdem die Kolonie in die Pipettenspitze folgen Schritt Ansaugrauchmelder 4.1.1 jede Kolonie in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte, vorbehandelt mit Gelatine platzieren und 30 ul Trypsin enthält.
    Hinweis: Die Kolonien in Trypsin bei RT sitzen kann, während eine ganze Reihe von Kolonien gerichtet.
  3. Sobald alle Kolonien wurden gepickt und dissoziiert in Medien , die die Zellen bei 37 ° C im CO 2 -Inkubator wachsen , bis die meisten Vertiefungen sind über 70% konfluent (gewöhnlich 2 Tage).
  4. Wenn die 96-Well-Platten zum Spalten bereit sind, entfernen Sie die Medien, 30 ul Trypsin hinzufügen und 5 min bei 37 ° C inkubiert. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 180 & mgr; l von ES - Zell - Medien (Tabelle 1) in jede Vertiefung und Pipette nach oben und unten für eine vollständige Dissoziation in einzelne Zellen.
  5. Aus der erhaltenen 210 & mgr; l, Samen 70 ul in drei gelatinebeschichteten Platten mit 96 Vertiefungen mit jeweils 130 & mgr; l von ES - Zellmedium / Vertiefung (Tabelle 1). Verwenden Sie diese Platten für genotyping, Expressionsanalyse und Gefrierzelle Aktien für jeden Klon, wie unten beschrieben.
  6. Wenn die Genotypisierung Platte 70-85% Konfluenz erreicht hat, behandeln die Platte, wie in Kapitel 6 "Genotyping das Löschen".
  7. Wenn die Expressionsanalyse Platte 70-85% Konfluenz erreicht, entfernen Sie die Medien, versiegeln Sie die Platte mit Dichtband und bei -80 ° C, bis die Klone genotypisiert wurden.
    Hinweis: Die Expressionsanalyse Platte nützlich ist bei frühen Passagen der Klone Veränderungen in der Genexpression zu analysieren. Genexpressionsanalyse von der 96-Well-Platte ist möglich, aber da die Zellzahlen niedrig sind ein RNA Mikro Extraction Kit empfohlen.
  8. Herstellung von 96-Well-Platte Freeze-Lager:
    1. Wenn die Platte für gefrorene Zell Aktien (Aktien-1) 70-85% Konfluenz erreicht, aspirieren die Medien, 30 ul Trypsin hinzufügen und 5 min bei 37 ° C inkubiert.
    2. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 100 & mgr; l von ES - Zellmedium (Tabelle 1) to jede Vertiefung und Pipette nach oben und unten für eine vollständige Dissoziation in einzelne Zellen.
    3. Transfer 15 ul der suspendierten Zellen aus jeder Vertiefung zu zwei Gelatine beschichteten 96-Well - Platten, die jeweils 185 & mgr; l von ES - Zellmedium (Tabelle 1) und damit bei 37 ° C / 5% CO 2 wachsen.
      Hinweis: Dies ist für Lager-2 und -3-Platten, die die Zellen ab Lager-1 wiederzubeleben zusätzliche Back-up-Klone im Falle sind nicht erfolgreich.
  9. Inzwischen wurde in den 100 & mgr; l der verbleibenden Zellen in 96-Well - Platte (Lager-1), 100 & mgr; l 2x Einfrieren Medien (Tabelle 6). Verschließen Sie die Platte mit einem Dichtungsband und schnell Platte umdrehen 4-5 mal für die richtige Mischung. Lagern Sie die Platte bei -80 ° C bis Klone genotypisiert werden.
  10. Wenn die Lager-2 und Lager-3-Platten für das Einfrieren aspirieren die Medien bereit sind, 30 ul Trypsin hinzufügen und 5 min bei 37 ° C inkubiert. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 70 & mgr; l von ES - Zell - Medien (TLage 1) in jede Vertiefung und Pipette nach oben und unten für eine vollständige Dissoziation in einzelne Zellen.
  11. 100 l Einfriermedien 2x, versiegeln Sie die Platte mit Dichtband und schnell Platte umdrehen 4-5 mal für die richtige Mischung. Lagern Sie die Platte bei -80 ° C bis diese Platten benötigt werden.

5. Allelspezifische Primer-Design

  1. Design 4 Sätze von Primern (1C) , die Klone für die gewünschte Löschung zu screenen: innen Grundierungen, außerhalb Primer und gRNA flankierende Primer (für beide 5 'und 3' gRNA Zielstellen) , wie unten beschrieben.
    1. Beziehen Sie die SNP-Spur entsprechend den 129 und Guss Genotypen bei http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. Die gegebene Spur zeigt Basenaustausche zwischen 129 und Cast bei den Koordinaten in der mm9 Mausgenom Montage.
      Hinweis: Der Link auf der oben genannten Seite an den Browser UCSC Genom umleiten wird, und fügen Sie eine benutzerdefinierte Spur die SNPs zwischen den 129 enthält und Guss geGaue.
    2. Geben Sie die Koordinaten der Region gelöscht werden. Zoom auf einen Bereich von etwa 500 bp in der Mitte der gewünschten Deletion mit> 3 SNPs.
    3. Gehen Sie zu Ansicht> DNA in der Optionsleiste und klicken Sie bekommen DNA, welche die Zielsequenz in Großbuchstaben-Format zum Download bereit.
    4. Erstellen Sie zwei FASTA-Sequenzen; eine für 129 und eine für Cast von Base an der SNP-Position Substitution. Markieren Sie die SNPs durch einen Kleinbuchstaben.
    5. Zum Primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) und fügen Sie die SNP-129-Sequenz ersetzt. Verwenden Sie die Standardeinstellungen Primer zu entwerfen.
    6. So entwerfen die Innen Allel-spezifischen Primer, die in der Task-Drop-Menü wählen Primer_List und klicken Sie auf Grundierungen Auswahl. Wählen Sie eine Vorwärts- oder Rückwärts-Primer, die ein SNP 'Ende oder innerhalb von 4 Basen vom 3'entweder in der 3 hat und fällt innerhalb der Region gelöscht werden.
      Hinweis: Die Primer, die ein SNP am 3'-Ende-Anzeige erhöht Allel-Spezifität in qPCR haben.
    7. Um den zweiten Primer Rückkehr zur Hauptseite auszuwählen, wählen Sie Erkennung in der Task-Drop-Menü und fügen Sie den ersten Primer-Sequenz in das entsprechende Feld am unteren Rand der Seite. Auf der Registerkarte Allgemeine Einstellungen die Einstellung für Bereich Produktgröße 80-200 bp ändern und klicken Sie auf Grundierungen Auswahl. Wählen Sie eine Grundierung aus den genannten Primerpaare gesetzt; Diese werden die 129 innerhalb allelspezifischen Primern sein.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.5 bis 5.1.7 Primer zu entwerfen, für das Cast-Allels.
    9. Zurück zur Genom-Browser UCSC und geben Sie die Koordinaten der Region gelöscht werden. Gehen Sie zu Ansicht> DNA in der Optionsleiste unter Sequence Retrieval Region Optionen hinzufügen 1000 bp stromaufwärts und stromabwärts klicken DNA erhalten, um die Zielsequenz herunterladen.
    10. Markieren Sie die gRNA Zielsequenz in Klammern. Speichern Sie diese gesamte Sequenz, bevor Sie fortfahren.
    11. So entwerfen die äußeren Primer die Sequenz zwischen den beiden gRNA Zielsequenzen zu entfernen. Wiederholen Sie Schritt 5.1.4-5.1.8 die außerhalb allelspezifischen Primer zu entwerfens aber die Produktgröße von 400 bis 800 bp ändern.
    12. Spaltete die in Schritt 5.1.10 in zwei Sequenzen erhaltenen Sequenz, die jeweils mit 500 bp 5 'und 3' der gRNA Zielsequenz. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.5 bis 5.1.7 Gestaltung nicht Allel-spezifische Primer für gRNA flankierenden Regionen, sondern die Produktgröße von 400 bis 800 bp ändern.
      Anmerkung: Für nicht-Allel spezifische Primer, entweder 129 oder Guss Sequenz verwendet werden kann und Primer gewählt werden sollte, die keine ein SNP. Es ist ratsam, eine Produktgröße von 400 bis 800 bp zu setzen für außerhalb der Gestaltung und gRNA flankierenden Primer. Dies erlaubt eine Verstärkung, auch wenn kleine indels vorhanden sind.
  2. Testen Sie die inneren Primer für die Allel-Spezifität von qPCR reinen 129 und Guss Stamm genomischen DNA bei 2 ng / ul verwendet. Folgen Sie Schritt 6,2-6,4 die qPCR Reaktion einzurichten.
    Hinweis: Wenn der 129-Genotyp in der Zielregion der gleiche wie C57BL / 6J ist, DNA, die aus C57BL / 6J kann an Stelle von 129 DNA verwendet werden. Allelspezifischen Primer sollten mindestens 5 Zyklen anzuzeigenDifferenz zwischen dem Ct (cycle threshold) Wert auf die korrekte gegen die falsche Genotyp. Die äußeren Primer können sie die Löschung unter Verwendung Cas9 / gRNA transfizierten ES-Zellen zu verstärken, um sicherzustellen, getestet werden, und F1 genomische DNA jeweils als positive und negative Kontrollen. Die Allel-Spezifität von außen Primer können getestet werden, sobald die monoallelic Klone wurden identifiziert.

6. Die Genotypisierung der Deletion

  1. Extrahieren genomischer DNA aus der Genotypisierung 96-Well-Platte mit der Platte aus Stufe 4.6, die nach dem Kolonie Expansion erzeugt wird.
    1. Bereiten Sie die genomische DNA-Extraktion-Mix: 89 & mgr; l Wasser, 10 ul 10x-Puffer und 1 ul Extraktionsreagenz (vom Hersteller geliefert). 100 l genomische DNA-Extraktion Mischung in jede Vertiefung und versiegeln Sie die Platte mit einem Dichtungsband.
    2. Inkubieren der Platte bei 75 ° C für 5 min von 95 ° C für 5 min.
    3. Lassen Sie die Platte durch Inkubation auf Eis für ein paar Minuten ein abkühlend dann Zentrifuge kurz jegliche Kondensation auf den Boden des Bohrlochs zu begleichen. Dies dient als Template-DNA Platte zum Löschen Screening.
  2. Stellen Sie für jeden Klon die qPCR Reaktionen in doppelter Ausführung wie folgt zusammen: 5 ul 2x SYBR qPCR-Mix, Vorwärts- und Rückwärts-Primer (3 uM) jeweils 1 & mgr; l und 1 & mgr; l Wasser. Verwenden einer Mehrkanalpipette 2 ul Matrizen-DNA von 8 & mgr; l-Reaktionsmischung in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte, gefolgt hinzuzufügen.
  3. Verschließen Sie die Platte mit Dichtband und Spin bei 600 × g für 2 min den Inhalt zu mischen. Legen Sie die 384-Well-Platte-Array in der Echtzeit-Cycler.
  4. Programm das Echtzeit-Cycler für einen 2-Schritt-PCR durch Schmelzkurvenanalyse mit Detektion gefolgt wie folgt: 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 min, 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 62 ° C für 30 sec mit Plattenlese und 95 ° C für 10 s, 65 ° C bis 95 ° C mit Schritten von 5 ° C für 5 s + Platte lesen.
    Hinweis: Zusätzlich Design zu Primer, der qPCR mix und die Zyklusparameter tragen auch Spezifität zu Primer. Die oben beschriebenen Parameter und in den Materialien mehr aufgeführten Reagenzien häufig Allel-spezifische Amplifikation ergeben.
  5. Analyse qPCR Ergebnisse
    1. Überprüfen Sie jedes Allel für die Amplifikation mit innen Allel-spezifischen Primer. Keine Verstärkung eines Allels oder hohen Ct Wertdifferenzen (> 5 Zyklen) zwischen Allelen legen nahe, diese Klone eine heterozygote Deletion des Allels mit dem hohen / abwesend Ct-Wert tragen. Keine Amplifikation beider Allele legt nahe, dass sie eine homozygote Deletion tragen.
    2. Überprüfen Sie jedes Allel für die Amplifikation mit externen Allel-spezifischen Primer. Wenn die Ziel Deletion größer als 1 kb-Amplifikation mit Primern außen ist nur auftritt, wenn eine Löschung vorliegt. Ein Ct-Wert von 22-28 bestätigt die Löschung. Für Ziel Streichungen kleiner als 1 kb, bestätigen Sie die Amplicongröße durch Elektrophorese.
      Hinweis: Wenn die äußeren Primer zeigen nur eine mäßige Allel-Spezifität (siehe Figure 2), Amplicons , die mit beiden Allel Primer - Sets in monoallelic Klonen erhalten aufgrund Tor Verstärkung der außenliegenden Primer werden kann. In diesem Fall wird eine Differenz Ct-Wert zwischen den beiden Allelen von mindestens fünf Zyklen sollte, ist die korrekte Allel (untere Ct-Wert) gelöscht bestätigen basierend auf den Ergebnissen von den inneren Primern erhalten. Wenn die auf Ziel gegen Differenz aus Ziel Allel Ct weniger als fünf Zyklen Design neue Allel-spezifische Primer außerhalb.
    3. In monoallelic Deletionsklonen überprüfen Sie die Integrität des nicht gelöschten Allel durch die sekundäre Screening unter Verwendung gRNA Primer flankieren.
      Hinweis: Indels von> 25 bp Größe rund um die gRNA Zielstelle kann durch Beobachten einer Veränderung in der Schmelzkurve im qPCR für 400-800 bp-Amplikons identifiziert werden. Alternativ können die Amplicons aus den gRNA flankierenden Primer kleine indels von <25 bp zu erkennen werden sequenziert.
      1. Führen Sie qPCR mit 2 Sätzen von gRNA flankierenden Primer dh 5 'und 3' gRNA verwendet CRISPR Löschung bei der Erzeugung. Keine Amplifikation mit diesen Sätzen von Primern zeigt indels größer als der qPCR Amplikon vorhanden sind an der gRNA Zielstelle auf dem nicht-deletierten Allel monoallelic Deletionsklonen. Discard Klone diese großen indels von der weiteren Analyse, wie die Ergebnisse enthält, kann schwierig sein, ohne zu wissen, um das Ausmaß der Löschung zu interpretieren.
  6. Reinige die Amplicons von außen Primer qPCR Reaktion erhalten eine PCR aufzuräumen Kit folgenden Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
  7. Bestätigung der Sequenz des deletierten Allele durch DNA-Sequenzierung des gereinigten PCR-Produkts aus dem vorhergehenden Schritt. Verwenden Sie die qPCR Amplifikationsprimer für Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierung.
    Hinweis: In diesem Stadium SNPs im Amplikon wirken als sekundäre Bestätigung des Genotyps des gelöschten Allel.

7. Analyzing Expression mit Allel-spezifischen Primer

  1. Auftauen 96-Well-Zelle stock plate bei -80 ° C (Lager-1 aus Schritt 4.9) gespeichert, indem es an einem warmen Perle Bad platzieren. Wenn mehr als die Hälfte der Vertiefungen in der Platte werden aufgetaut, Schleudern bei 300 xg für 5 min.
  2. Vorsichtig das Dichtungsband entfernen und schnell die Zellen aus den Lösch positiven Vertiefungen in gelatinebeschichteten übertragen, Platten mit 12 Vertiefungen mit 1 ml ES - Zellmedium enthält (Tabelle 1) und bei 37 ° C / 5% CO 2 inkubieren.
  3. Wenn die Platte erreicht 70-85% Konfluenz, passage die Zellen und teilen sie in drei Vertiefungen einer gelatinebeschichteten, Platte mit 6 Vertiefungen, die jeweils 2 ml ES - Zellmedium (Tabelle 1). Verwenden Sie zwei Wannen 2 Fläschchen mit gefrorenen Zellbestände in flüssigem Stickstoff Langzeitlagerung vorzubereiten (beschrieben in Schritt 8) und die dritte gut für die RNA-Extraktion.
  4. Extract RNA ein RNA-Extraktions-Kits verwenden.
  5. Umwandeln 100-500 ng von RNA in cDNA durch reverse Transkription (RT) der RNA unter Verwendung des cDNA-Synthese-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers. Fügen Sie eine RT negative Reaktion für jede RNA-Probe, die Menge an kontaminierenden DNA in den RNA-Proben zu überwachen.
  6. Verdünne die cDNA vor qPCR in einem Verhältnis zwischen 1: 2 und 1: 4; in Abhängigkeit von dem Expressionsspiegel des Zielgens in ES-Zellen.
  7. Stellen Sie die qPCR wie oben beschrieben, einschließlich F1 genomische DNA als Standardkurve (5-fach Verdünnungen 250-,08 ng / ul) für die absolute Quantifizierung von Transkriptspiegel beschrieben. Vergleichen der Expression von jedem Allel des Gens von Interesse in jedem bestätigten gelöscht Klons mit einer geeigneten Kontrollgens, beispielsweise GAPDH (Primer aufgelistet in Tabelle 7).
    Anmerkung: Kontrolle Gen-Primer brauchen nicht Allel spezifisch. Allelspezifischen Primer-Design ist das gleiche für RT-qPCR-Primer als Primer für die Genotypisierung mit Ausnahme der Zielregion zur Amplifikation beschrieben. Die Gensequenz verwendet werden sollte; wenn Primer für ein einzelnes Exon oder einer Exon-Intron-Grenze unter Verwendung (zur Überwachung primären Transkripts) F1 genomische DNA kann verwendet werden fürdie Standardkurve. Für weitere Details über RT-qPCR finden Sie in Forlenza et al. 2012 33.

8. Freeze-Stoffaufbereitung für Langzeitlagerung von ES-Zellen

  1. Hinzufügen von 300 & mgr; l Trypsin zu jeder 6 Vertiefungen (aus Schritt 7.3) und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. 2 ml Spin - Medien (Tabelle 2) Trypsin und Pipette nach oben und unten mehrmals zu neutralisieren , in einzelne Zellen zu trennen.
  2. Übertragen Sie die Zellen in einen 15-ml-Tube und Spin bei 300 g für 5 min.
  3. Den Überstand aspirieren und fügen 500 ul ES - Zellmedien (Tabelle 1). Pipette nach oben und unten um die Zellen zu resuspendieren.
  4. Übertragen Sie den Inhalt in ein 1,5 ml Kryoröhrchen Röhrchen und fügen 500 ul 2x ES - Zellen Einfrieren Medien (Tabelle 3). Gut mischen durch das Rohr Umkehren und legen Sie den Schlauch in einer alkoholfreien Zellgefrierbehälter. Dieses Zellgefrier Behälter bei -80 ° C für mindestens 12 Stunden vor der Transferring in einen Flüssigstickstoffspeicherbehälter.

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Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll verwendet Zellen F1 ES cis -Regelung der Genexpression in monoallelic Enhancer deletiert Zellen zu untersuchen CRISPR / Cas9 Genom Bearbeitung (Figur 1) erzeugt. Die gRNA und Allel-spezifische Primer-Design für die Genotypisierung und der Genexpression sind die Schlüsselfaktoren in diesem Ansatz. Jedes Allel-spezifische Primer-Set muss von qPCR validiert werden Allel-Spezifität zu bestätigen. Allelspezifischen Primer , die nur ihr...

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Diskussion

CRISPR / Cas9 vermittelte Genome Editing-Technologie bietet eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode für die Genommodifikation. Die Methode, die hier detailliert zu erzeugen und monoallelic Enhancer Deletion für die funktionelle Charakterisierung Enhancer nimmt in F1 Mauszellen Vorteil von SNPs analysieren. Die Vorteile dieser Art von Ansatz sind: 1) monoallelic Enhancer Deletionen produzieren keine Verwechselung Wirkungen , die auftreten , wenn ein kritischer Enhancer aus beiden Allelen deletiert ist, dh<...

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Offenlegungen

Die Autoren haben JoVE Politik über Interessenkonflikte und haben keine Konflikte lesen offen zu legen.

Danksagungen

Wir möchten uns bei allen Mitgliedern des Mitchell-Labors für hilfreiche Diskussionen bedanken. Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation und dem Ministerium für Forschung und Innovation von Ontario unterstützt (Betriebs- und Infrastrukturzuschüsse im Besitz von JAM).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Phusion High-Fidelity DNA-PolymeraseNEBM0530SHigh-Fidelity-DNA-Polymerase für die gRNA-Assemblierung
Gibson Assembly Master MixNEBE2611L
gRNA_Cloning VectorAddgene41824In diesen Vektor wird eine Zielsequenz kloniert, um das gRNA-Plasmid
pCas9_GFPAddgene44719Codon-optimiertes SpCas9 und EGFP zu erzeugen Co-Expressions-Plasmid
AflIINEBR0520S
EcoRINEBR3101S
Neon-Transfektionssystem 100 & micro; L KitLife TechnologiesMPK10096Microporator Transfektionstechnologie
prepGEMZyGEMPT10500Reagenz zur genomischen DNA-Extraktion
Nucleo Spin Gel & PCR-AufreinigungMacherey-Nagel740609.5
Hochgeschwindigkeits-Plasmid-Mini-KitGeneaidPD300
Maxi-Plasmid-Kit Endotoxin-frei GeneaidPME25
SYBR Select Mix für CFXLife Technologies4472942qPCR-Reagenz
iScript cDNA-SynthesekitBio-rad170-8891Reverse Transkriptionsreagenz
0,25% Trypsin mit EDTALife Technologies25200072
PBS ohne Ca/Mg2+SigmaD8537
0,5 M EDTABioshopEDT111.500
HBSSLife Technologies14175095
1 M HEPESLife Technologies13630080 BSA-Fraktion
V (7,5%)Life Technologies15260037
Max Efficiency DH5α kompetente ZellenInvitrogen18258012
FBSES-Zellen qualifiziertFBS wird zuvor in ES-Zellen der Maus auf Pluripotenz getestet
DMSOSigmaD2650
GlutamaxInvitrogen35050
DMEMLife Technologies11960069
Pencillin/StreptomycinInvitrogen15140
NatriumpyruvatInvitrogen11360
Nicht essentiell aminosäureInvitrogen11140
β-mercaptoethanolSigmaM7522
96-Well-PlatteSarstedt83.3924
DichtbandSarstedt95.1994
CoolCell LXBiocisionBCS-405alkoholfreier Zellgefrierbehälter
CHIR99021Biovision1748-5Inhibitor für F1 ES-Zellkultur
PD0325901Invivogeninh-pd32Inhibitor für F1 ES-Zellkultur
LIFChemiconInhibitor für F1 ES-Zellkultur
: , , , , , , , , ESG1107

Referenzen

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CRISPR Cas9 vermittelte Deletionmonoallele Deletionallelspezifische PrimerEinzelnukleotid PolymorphismenGuide RNA DesignElektroporationstransfektionDurchflusszytometrie SortierungExtraktion genomischer DNAqPCR Deletion Screening

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