Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Sakthi D. Moorthy; Jennifer A. Mitchell

doi:10.3791/53552

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Methodenartikel

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

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DOI:

10.3791/53552

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2. April 2016

Sakthi D. Moorthy¹ , Jennifer A. Mitchell¹

¹Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus) enthalten.

Zusammenfassung

Enhancer steuern die Zellidentität, indem sie die gewebespezifische Genexpression positions- und orientierungsunabhängig regulieren. Diese Enhancer befinden sich oft distal vom regulierten Gen in intergenen Regionen oder sogar im Körper eines anderen Gens. Die positionsunabhängige Natur der Enhancer-Aktivität macht es schwierig, Enhancer mit den Genen in Einklang zu bringen, die sie regulieren. Die Deletion einer Enhancer-Region liefert einen direkten Beweis für die Enhancer-Aktivität und ist der Goldstandard, um die Rolle eines Enhancers bei der endogenen Gentranskription aufzudecken. Herkömmliche homologe rekombinationsbasierte Deletionsmethoden wurden durch die jüngsten Fortschritte in der Genome-Editing-Technologie übertroffen, die schnelle und präzise lokalisierte Veränderungen an den Genomen zahlreicher Modellorganismen ermöglichen. Die CRISPR/Cas9-vermittelte Genomeditierung kann verwendet werden, um das Genom in vielen Zelltypen und Organismen schnell und kostengünstig zu manipulieren, da Cas9 durch eine Leit-RNA aus einem maßgeschneiderten Expressionsplasmid leicht auf das Genom ausgerichtet werden kann. Die homozygote Deletion essentieller genregulatorischer Elemente könnte zur Letalität führen oder den zellulären Phänotyp verändern, während die monoallelische Deletion von Transkriptionsverstärkern die Untersuchung der cis-Regulation der Genexpression ohne dieses verwirrende Problem ermöglicht. Hier wird ein Protokoll für die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion in embryonalen Stammzellen (ES) der Maus (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus) vorgestellt. Die monoallelische Deletion, das Screening und die Expressionsanalyse werden durch Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) zwischen den beiden Allelen erleichtert, die in diesen Zellen durchschnittlich alle 125 bp auftreten.

Einleitung

Transkriptions - Regulationselemente sind entscheidend für die räumlich-zeitliche Feinabstimmung der Genexpression während der Entwicklung ¹ und Modifikation dieser Elemente in Krankheits ² aufgrund aberrant Genexpression führen kann. Viele krankheitsassoziierten Regionen durch genomweite Assoziationsstudien identifiziert sind in nicht-kodierenden Regionen und verfügen über Funktionen von Transkriptionsverstärker ^3-4. Identifizieren Enhancer und passender sie mit den Genen regulieren sie ist kompliziert , da sie oft mehrere Kilobasen entfernt von den Genen liegen sie regulieren und kann ^5-6 in einer gewebespezifischen Weise....