Methodenartikel

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

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DOI:

10.3791/53555

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7. März 2016

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1U.S. Army Center for Environmental Health Research, 2Nanohmics, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt, wie fluidische Biochips mit Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen für den Einsatz in einem tragbaren elektrischen Zellsubstrat-Impedanzsensor für das Feld vorbereitet werden können. Auch das Protokoll für die Durchführung eines Trinkwasser-Toxizitäts-Schnelltests mit dem Sensor wird beschrieben.

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt, wie fluidische Biochips mit Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen (RTgill-W1) für den Einsatz in einem tragbaren Wassertoxizitätssensor für das Feld hergestellt werden können. Eine Monoschicht aus RTgill-W1-Zellen bildet sich auf den Sensorelektroden, die in den Biochips eingeschlossen sind. Die Biochips werden dann für Tests in einem tragbaren ECIS-Gerät (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) vor Ort verwendet, das für schnelle Toxizitätstests von Trinkwasser entwickelt wurde. Das Manuskript beschreibt weiterhin, wie ein Toxizitätstest mit den vorbereiteten Biochips durchgeführt werden kann. Eine Kontrollwasserprobe und die Testwasserprobe werden mit vorgemessenen pulverförmigen Medien gemischt und in separate Kanäle des Biochips injiziert. Die Impedanzmesswerte der Messelektroden in jedem der Biochipkanäle werden von einer automatisierten statistischen Software gemessen und verglichen. Auf dem Bildschirm des ECIS-Geräts wird innerhalb einer Stunde nach der Probeninjektion entweder "Kontamination erkannt" oder "Keine Kontamination erkannt" angezeigt. Die Vorteile sind die einfache Handhabung und die schnelle Reaktion auf ein breites Spektrum anorganischer und organischer Chemikalien in Konzentrationen, die für die menschliche Gesundheit relevant sind, sowie die Langzeitstabilität der gelagerten Biochips in einem testbereiten Zustand. Einschränkungen sind die Forderung nach Kühllagerung der Biochips und die eingeschränkte Empfindlichkeit gegenüber Cholinesterase-hemmenden Pestiziden. Anwendungen für diesen Toxizitätsdetektor sind die schnelle, vor Ort tragbare Prüfung der Trinkwasserversorgung durch das Personal der Präventivmedizin der Armee oder der Einsatz in kommunalen Wasseraufbereitungsanlagen.

Einleitung

Das Ziel war es, ein Verfahren für die Zellaussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips im ECIS Biosensor zu entwickeln. Das Ziel für die Entwicklung dieses Biosensor war US-Armee Spezifikationen für ein Feld tragbares Gerät zu erfüllen, die eine mögliche Kontamination von Trinkwasserversorgung von Soldaten benutzt wird erkennen konnte. Die Anforderungen an die Toxizität Sensor waren, dass sie sich schnell ein breites Spektrum von toxischen Industrie Verbindungen erkennen konnte (innerhalb einer Stunde) in Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit, dass das Gerät Feld tragbar sein, und die biologischen Komponenten würde eine Haltbarkeit haben, mindestens neun Monate. Kältetechnik, aber nicht das Einfrieren, die von verderblichen Komponenten war akzeptabel.

Historisch gesehen haben, Feld tragbaren Wasser Prüftechnik mit einer biologischen Komponente , um sie (wie Antikörper, Enzyme oder Nucleinsäuren) Analyt-spezifischen 1-3. Der Nachteil dieser Art von Biosensoren ist, dass sie onl wirdy zu einem Zeitpunkt eine Art der chemischen Erkennung. Mehrere Sensoren benötigt werden, wenn vermutet wird, dass mehr als eine Chemikalie vorhanden ist. Wenn ein bestimmter Sensor nicht im Test Repertoire, chemische Verunreinigungen im Wasser ist, könnte leicht unentdeckt bleiben.

Breit abgestütztes Toxizität Sensoren, auf der anderen Seite, haben das Potenzial, diese Technologielücke zu füllen. Diese haben in der Regel eine zelluläre Komponente , um sie 4-8. Die Vorteile der breit abgestützten Toxizität Biosensoren sind , dass sie das Vorhandensein einer Vielzahl von chemischen Verunreinigungen erkennen kann, einschließlich Mischungen und Unbekannten, in einem relativ kurzen Zeitraum 5,9,10.

Das Konzept der Messung der elektrischen Impedanz von Zellmonolayern als mögliche Toxizitätssensor, der auch als elektrische Zell-Substrat - Impedanz - Mess (ECIS), wurde zuerst bekannt ist 11 von Giaever und Keese beschrieben. In den vergangenen zwei Jahrzehnten ein empfindlicher Indikator für Zell VIAB erwiesen wurdeility und Zytotoxizität. Grundsätzlich wird die Zellmonoschicht, die an die Elektroden auf den Biochips anhaftet auf Hochfrequenz ausgesetzt und niedriger Spannung und Stromstärke Wechselstromsignal. Die konfluente Monoschicht von Zellen behindert den Fluss der Elektronen. Wenn die Integrität der Zellmonoschicht beeinträchtigt ist (beispielsweise wenn eine giftige Chemikalie eingebracht wird), zeichnet der ECIS Sensor eine Änderung in der elektrischen Impedanz 11-14. 1 veranschaulicht das Prinzip der ECIS in Bezug auf die Zellmonoschicht auf dem Biochip .

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Abbildung 1:.. Das Prinzip der ECIS Illustration einer Zellschicht auf einem Biochip mit vereinfachten ECIS Leser elektrisches Schema Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zunächst wurden Säugerzelllinien in fluidischer Biochips ausgesät und wurden in der ECIS Sensorik hier 12 beschrieben , verwendet. Diese Zellen waren nicht praktisch für den Feldeinsatz, aber, weil sie häufige Medienwechsel erforderlich ist , hatte eine begrenzte Haltbarkeit und erforderte eine künstliche CO 2 -Umgebung und 37 ° C Inkubationstemperatur. Es wurde entdeckt , daß ein im Handel erhältlicher Zelllinie , abgeleitet von Regenbogenforellen gill Epithelzellen (RTgill W-1 - Zellen) bei Raumtemperatur bei Umgebungs CO 2, getestet werden, um eine konfluente Monoschicht in den Biochips gebildet, könnte bei Kühltemperaturen gelagert werden, und hatte eine schnelle Reaktion (1 h oder weniger) zu einem breiten Spektrum an Chemikalien bei Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit 12. Anwendungen von RTgill-W1 - Zellen in der Toxikologie, sowie in der Grundlagenforschung werden von Lee et al überprüft. 15

Verfahren für die Aussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips enthalten,Monoschichten von RTgill-W1 Zellen auf fluidische Biochips in einem Biosensor ECIS werden hier beschrieben. Die fluidische Biochips können für bis zu 9 Monate in einem gekühlten Zustand gelagert werden und kann zum Testen von Trinkwasser supplies.The begleitenden ECIS Leser, oder Testeinheiten werden separat ausgeliefert in einem kalten Lagerbehälter, versendet werden. Die Biochips haben zwei Komponenten zu ihnen; eine obere Polycarbonatschicht mit zwei getrennten Fluidkanäle, und eine untere Schicht, die elektronische vier Elektroden-Pads pro Kanal für die Impedanzabtastung enthält. Es gibt 10 Arbeitselektroden pro Pad; jede Elektrode 250 & mgr; m im Durchmesser. Die versammelten Biochips haben Goldelektrodenanschlüsse zum Erfassen von Messwerten Impedanz, wenn sie in der ECIS Testgerät eingesetzt. Jede der beiden geschlossenen fluidischen U-förmige Kanäle hält 2 ml der RTgill-W1 Zellsuspension. 2 zeigt eine fluidische Biochip in dem ECIS Leser mit einer Vergrößerung von einer konfluenten Zellen auf einer einzelnen Sensorelektrode.

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Abbildung 2:.. Fluidic Biochip in ECIS Reader gezoomten Bereich zeigt eine konfluente Monoschicht von RTgill-W1 - Zellen auf einer einzigen Sensorelektrode Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protokoll

1. Herstellung von Testmaterialien

HINWEIS: Um die Biochips für die Prüfung, mehrere konfluenten Flasche aus RTgill-W1 Zellen vorbereiten müssen bereit sein. Eine gute Schätzung der Anzahl der Flaschen benötigt wird, ist ein konfluenter T175-Kolben für 16 Biochips ausgesät werden.

  1. Führen Sie die folgenden Schritte in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank (biohood) unter aseptischen Bedingungen. Verwenden Sie 70% Ethanol für die biohood Desinfektion und alle in der Haube platziert Materialien.
    1. Bereiten Fibronektin Substrat für die fluidische Biochips durch eine 1 mg Phiole von Fibronektin Auftau- und in 100 ml sterilem L-15-Medien für eine Konzentration von 10 ug / ml verdünnt. Einfrieren in 40 ml Aliquots in sterilen 50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen bei -20 ° C. Bei Raumtemperatur auftauen mehrere Stunden vor der Biochips Aussaat. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.
    2. Bereiten Zellkulturmedien mit 50 ml fötalem Rinderserum Zugabe von 5 ml 200 mM ein L-alanyl-L-glutamin supergänzen, und 5 ml einer Penicillin / Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten Penicillin / ml und 10.000 & mgr; g Streptomycin / ml) Lager zu 500 ml L-15-Medien. Dies wird 560 ml Zellkulturmedien ergeben, enthaltend 9% Serum. Kalt stellen.
      Hinweis: Dadurch wird die komplette Zellkulturmedien für den Kulturflaschen und die Biochips verwendet werden.
  2. Pulverisierte Medien Vials
    1. Bereiten Sie vor der Zeit 0,1 Dram-Snap-cap Fläschchen mit 60 mg ± 0,5% L-15ex Pulver eine automatisierte Pulverspender verwenden. Beschriften Sie die Fläschchen mit dem Tag wurde das Pulver abgegeben und im Kühlschrank lagern Fläschchen (in Mengen von 50) in wiederverschließbaren metallisierter Poly-Taschen; die jeweils drei 1 g Kieselgel Austrocknungs Packungen.
      Anmerkung: L-15ex pulverisierten Medien Phiolen können hergestellt und für bis zu 9 Monate vor der Prüfung aufbewahrt werden.
  3. Machen Sie eine Lösung von 100 ml 20% Bleiche von Haushaltsbleiche mit entsalztem Wasser (DI) zu verdünnen. Schätzung, dass 5 ml Bleichlösung für jede bi benötigt werdenochip.
  4. Machen Sie Biochip Röhrenanordnungen von 27 mm Abschnitte von autoklavierbaren bioverträglichen Rohrschneiden (2 Abschnitte für jeden Biochip werden ausgesät) und passen die beiden Enden des Rohres mit Polycarbonat-Rutsch Luerverbindungen. Platzieren Röhrenanordnungen in einem autoklavierbaren Beutel und Autoklaven für 8 min bei 134 ° C. Auch Autoklaven Biochip-Stecker (2 pro Biochip) in einem separaten Beutel bei den gleichen Einstellungen.
  5. Autoklav DI-Wasser für 30 min at121 ° C.
    Hinweis: Dieses Wasser wird zum Spülen Biochips nach dem Aussäen verwendet werden. Schätzen, dass 10 ml für jeden Biochip benötigt werden.
    Anmerkung: Der tatsächliche Volumen jeder Biochip Kanal 2 ml, aber 5 ml sterilem Wasser durch jeden Kanal nach Entfernung der Bleichlösung gespült.
  6. Machen Spritzeninjektionsröhrenanordnungen durch Schneiden 27 mm Abschnitte aus biokompatiblem Schläuche und Befestigungs männlichen Luer-Rutscheinrichtungen an beiden Enden des Schlauches. Legen Röhrenanordnungen in einem Papierheißsiegelsterilisationsbeutel und Autoklaven für 8 min bei 134 &# 176; C.

2. Fluidic Biochip Impfvorgangs

Hinweis: Führen Sie alle Verfahren, bei denen die Biochips oder die Medien in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank unter aseptischen Bedingungen behandelt wird.

  1. Vierundzwanzig Stunden nach geplanten Aussaat vor, entfernen Sie die Biochips Hersteller Verpackung in der biohood und in sterilisierten Kunststoff Instrumentenkoffern.
  2. Sterilisieren der Biochips eine 20% -ige Bleichlösung wie folgt
    Anmerkung: In der Vergangenheit diese Bleichverfahren wurde das Pilzwachstum in der Biochips bei Langzeitlagerung in dem Fall verhindert, dass die Plasmasterilisation der vom Hersteller durchgeführt Biochips nicht wirksam war.
    1. Unter Verwendung einer 20 ml sterile Spritze mit einem Spritzeninjektionsrohranordnung befestigt und in der Arbeits biohood injizieren 2 ml der 20% igen Bleichlösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips für 1 Stunde mit der Bleichlösung zu sitzen.
    2. Nach einer Stunde Unterdruck aspwütend die Bleichlösung aus beiden Kanälen eines sterilen männlichen Luer Slip Montage an dem Vakuum-Saug-Schlauch verwenden. Verwenden Sie eine der Biochip-Röhrenanordnungen als Drain, wenn die Biochips Spülung.
    3. Mit einer sterilen 20-ml-Spritze mit einer sterilen Spritze Einpritzeinheit angebracht, spülen Sie jeden Kanal des Chips mit 5 ml sterilem Wasser, so dass das überschüssige Wasser in einen Behälter zu entleeren im biohood. Dann Vakuum absaugen das Wasser als nur für das Bleichmittel beschrieben und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Instrumentenkoffern und im biohood verlassen, bis und mit Zellen besiedelt am folgenden Tag.
  3. Sechzig Minuten vor der Biochips Animpfen injizieren 2 ml der 10 ug / ml Fibronektin-Lösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips in der biohood für 60 Minuten, und dann absaugen das Fibronektin Vakuum (wie in Schritt 2.2.3 beschrieben), bevor der Biochip mit Zellen Aussaat. Legen Sie zwei Abschnitte der sterilen Biochip Röhrenanordnungen (sieheAbschnitt 1.4) an den Anschlüssen der Biochips.
  4. Trypsinize 16 ein konfluenter RTgill-W1 T175 - Kolben für jeweils 16 Biochips beschriebenen Verfahren in dem Blatt American Type Culture Collection (ATCC) Produktbeschreibung verwendet wird .
    1. Absaugen Medien aus dem konfluenten Kolben (n) von Zellen.
    2. Spülen Sie die Zellschicht mit 15 ml PBS und dann absaugen.
    3. In 6 ml Trypsin / EDTA auf die Zellschicht in jedem T175 Kolben und erlauben Zellen für ~ 5 min zu trypsinize.
    4. 15 ml komplette L-15-Zellkulturmedien zu jedem Kolben Trypsinierung zu stoppen.
    5. Kombinieren die Zellsuspensionen in einem sterilen Einweg-Behälter.
      Hinweis: Gebindegröße von 150 bis 500 ml, abhängig von der Anzahl von Biochips variieren wird ausgesät. Schätzung, die 5 ml Zellsuspension werden pro Biochips benötigt werden.
  5. Entfernen Sie ~ 1 ml der Zellsuspension und in einen Mikrozentrifugenröhrchen für die Zählung. Mit einem Hellfeldmikroskop mit 10-facher objectiVE und einem Hämocytometer, ein 10 ul - Aliquot der Zellen zählen und das Volumen des kompletten L-15 - Zellkulturmedien Berechnung erforderlich , um eine Zellsuspension von 2,5 x 10 5 Zellen / ml zu erreichen.
    Hinweis: Wenn Sie die Zellsuspension unter Verwendung von Kolben zu impfen, die Kultur fortzusetzen, ist dies der Punkt sein würde, dies zu tun. Stellen Sie die Zellsuspension Konzentration mit kompletten L-15-Zellkulturmedien.
  6. Mit einer sterilen 20 ml syringeattached auf eine sterile Spritze Injektionsschlauchleitungsbaugruppe (siehe Abschnitt 1.6), Injizieren von 2,5 ml der Zellsuspension in die Außenöffnung jedes Kanals des Biochips (dh die Anschlüsse, angebracht nicht den Schlauch haben), einige der zusätzlichen Zellsuspension erlaubt in der biohood aus dem Schlauch in einen Abfallbehälter zu fließen.
    Hinweis: Dadurch wird sichergestellt, dass der gesamte Kanal und die angeschlossenen Schläuche der Zellsuspension wird voll sein.
    1. Erstellen Sie eine geschlossene Schleife für jeden Biochip-Kanal durch das freie Ende des Schlauches mit den Luer fitti Einsetzenng in die äußeren Anschlüsse für jeden Kanal.
    2. Wischen Sie überschüssige Medien aus der geschlossenen Schleifen mit einem Papiertuch mit 70% Ethanol befeuchtet und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Box in einem 20 ° C Inkubator. Geben Sie jedem Biochip eine eindeutige Identifikationsnummer.
  7. An den Tagen 4 und 7, die Biochips aus dem 20 ° C Inkubator entfernen und die Medien in allen der Biochips mit temperatur äquilibriert vollständigen L-15 Zellkulturmedium aufzufüllen. Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.6 außer Gebrauch nur L-15-Zellkulturmedien statt (keine Zellsuspension). Legen Sie die Biochips in der 20 ° C-Inkubator zurück nach dem Tag 4 Fütterung.
    1. Nach dem Tag 7 Fütterung, zu entfernen und die Schläuche von den Chips zu verwerfen und die autoklaviert Ablassschrauben in den Biochips einlegen.
    2. Legen Sie die Biochips in einer Kiste in einem 6 ° C Inkubator bis zum Testen verwendet.
      Anmerkung: Die Chips können für bis zu 9 Monate bei Kühltemperaturen gelagert werden und sind immer noch lebensfähig zum Testen in die ECIS Leser.

3. ECIS Testen mit Biochips

  1. Bereiten Testchemikalien bei der Verwendung. (Siehe Brennan et al., 2012 7 zur Herstellung von Testchemikalien).
  2. Entfernen ECIS Leser und Testlieferungen aus dem Koffer. Entfernen Sie eine vorbereitete Biochips aus dem 6 ° C Inkubator. Setzen Sie den Biochip auf einem Papiertuch. Schalten Sie den ECIS Leser.
  3. Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, verzichtet werden 10 ml Steuer Wasser in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Kontrollglas und 10 ml der Testprobe in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Messbecher.
    Anmerkung: 1) Achten Sie darauf, Blasen für eine genaue Messung zu entfernen. 2) Die Spritzen und Gläser sind farbcodiert; Blau für die Steuerung und rot für den Test.
  4. Entfernen Sie die zwei pulverisierte Medien Fläschchen aus den Folienbeutel. Öffnen Sie eine der pulverförmigen Medien Fläschchen (Verwendung Mehrzweckwerkzeug, wenn nötig) und gesamte Inhalt einer Flasche in das Glas mit Steuer Wasser gießen, das gesamte Fläschchen fallen inLösung auch. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Testglas. Cap und schütteln Sie die Gläser, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst ist.
  5. Füllen Sie jedes der farbigen 10 ml Spritzen mit 9 ml entweder Kontrolle (blau Spritze) oder Test (rot Spritze) Lösungen aus den jeweiligen Fläschchen. Entfernen von Luftblasen aus Spritzen.
  6. Entfernen Sie die Stecker aus den Biochip-Ports und den Abfluss befestigen.
  7. Setzen Sie den Biochip in den abnehmbaren Plastikschale in der ECIS-Leser und den Deckel schließen.
  8. Bringen Sie Spritzen an die äußeren Biochip-Ports und den Spritzenkolben befestigen.
  9. Aus dem Hauptmenü die Option "NEXT" Pre-Test zu initiieren.
    Hinweis: Reader-Software Impedanzen überprüfen. Wenn Impedanzen durch den Benutzer innerhalb des Bereichs festgelegt sind ( in der Regel zwischen 1.000 und 3.000 Ohm) wird der Bildschirm Register "Cartridge Bestanden" , wie in Abbildung 3 angegeben ist , und den Benutzer anweisen, wählen Sie "Weiter" und die Software wird weitergehen 3.10 zu Schritt). Wenn die Impedanzen nicht innerhalbdie eingestellten Bereich wegen eines defekten Biochips oder fehlerhafte Verbindung des Biochips für den Leser (in der Regel aufgrund einer Fehlausrichtung der Elektroden), dann wird der Bildschirm Register "Cartridge Failed" und der Benutzer hat die Möglichkeit, entweder auf "Abbrechen" oder "Überprüfen" den Test.
    1. Wählen Sie "Abbrechen" zurück 3.9 zu Schritt). Wählen Sie "Überprüfen", um fortzufahren 3.10 Schritt A) nach einem Empfang "Cartridge Bestanden" Nachricht und wählen Sie "Weiter".
      Hinweis: Es ist am besten, den Biochip zu nehmen und visuell untersuchen Sie ihn auf Mängel oder undicht, wenn eine "Cartridge fehlgeschlagen" Nachricht, bevor Sie mit einem neuen Biochip empfangen wird.

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Abbildung 3:. ECIS Reader Screenshot eines Biochips mit Acceptable Impedanzmessungen Der Screenshot zeigt Anfangsimpedanzmessungen in Ohm jeder der vier Control Elektroden (CE) und 4 Testprobe Elektroden (SE) im fluidischen Biochip. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Wenn der Leser aufgefordert, geben Sie Probeninformationen eine Soft-Tastatur verwenden und wählen Sie dann auf "Akzeptieren", wenn Sie fertig.
    Hinweis: Die ECIS-Reader-Software automatisch bei jedem Datensatz mit dem Datumsstempel wird, Zeit und andere Informationen, die von dem Benutzer eingegeben; wie die Biochip-Nummer und die Art der chemischen und Konzentration. Zwei Minuten von Impedanzdaten werden aus dem eingesetzten Biochips gesammelt werden und ein On-Screen-Timer Countdown-Zeit.
  2. Nach zwei Minuten, wenn sie durch Anweisungen auf dem Bildschirm aufgefordert, die in einem roten Feld blinken, klicken Sie auf "Weiter". Wenn durch Blinken der grünen Box aufgefordert, "Proben injizieren jetzt", injizieren, um die Kontroll- und Testmedien aus den beigefügten Spritzen gleichzeitig in den Biochip channels. Lassen Sie die Spritzen an Ort und Stelle auf den Biochips, wenn Sie fertig.
    Hinweis: Impedanzwerte werden einmal pro Minute für 60 Minuten gesammelt werden. Wenn der Leser Software ECIS bestimmt, dass der Behandlungskanal von dem Steuerkanal an einer beliebigen Stelle zwischen 10 und 60 Minuten nach Testbeginn, dann ist die On-Screen-Display zeigt an, dass die Probe "verseucht" statistisch unterschiedlich ist. Wenn die Behandlung nicht verschieden von dem Steuerkanal ist, dann wird der Bildschirm die Meldung "Keine Kontamination erkannt" am Ende des Testlaufs.
  3. Nehmen Sie die Testergebnisse als kontaminiert oder nicht für jede Probe verunreinigt.
  4. Am Ende des Testlaufs, zu entfernen und den Biochip zu verwerfen. Spülen und der Luft trocknen die Spritzen, Teströhrchen und herausnehmbaren Plastikschale, die den Biochip während der Tests untergebracht.
    Hinweis: Die ECIS Leser verfügt über 4 GB Onboard-Speicher für die Betriebssoftware, Steuerungsmodelle und die Testdateien generiert aus einem Test ausgeführt wird. Dies ermöglicht mehrere thousand Testdateien auf dem Lesegerät gespeichert werden. Die Dateien können mit einem USB-Sprung-Antrieb abgerufen werden und für weitere Analysen zu Forschungszwecken auf einen Computer übertragen, falls gewünscht.

Ergebnisse

Die ECIS Technologie in diesem Papier beschrieben unterzog Prüfung bei der US Environmental Protection Agency (US-EPA) -sponsored Technik Prüf- und Evaluation Program (TTEP). Dreizehn Chemikalien wurden für die Prüfung als Vertreter eines breiten Spektrums von toxischen Industrie Verbindungen ausgewählt, die mögliche Verunreinigungen von Trinkwasser sein könnte. Während des Tests, 9 der 13 durch ECIS innerhalb einer Stunde bei Konzentrationen nachgewiesen wurden , die für die menschliche Gesundheit relevant sind 8. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Verunreinigungsprüfung. 4 Figur ist repräsentativ , was ein "verseucht" Ergebnis wie auf aussehen der ECIS Leser Bildschirm. Zum größten Teil, verminderte zelluläre Impedanzen für kontaminierte Proben im Vergleich zu Kontrollen. Gelegentlich können bestimmte Verbindungen, die eine Erhöhung der Impedanz verursachen.

Auch in Tabelle 1 zusammengefasst ist die saubere Wasserprüfung. Vierzig saubere Wasserproben wurden durchgeführt und keine Verunreinigung wurde in keiner der Proben (siehe Abbildung 5) für einen repräsentativen Screenshot von "No Verunreinigung festgestellt" erkannt.

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Abbildung 4: ECIS Reader Screenshot einer "verseucht" Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: ECIS Reader Screenshot einer "No Verunreinigung festgestellt" Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die nicht verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Kategorie Contaminant Getestete Konzentration (mg / L) 1 Erkannt ≤1 Stunde
n = 4/4 Chips
Pestizide Aldicarb 0,17 Nein
Arsen ic (Natriumarsenit) 4.5 ja
Azid (Natriumazid) 46.7 ja
Fenamiphos 0,56 Nein
Methamidophos 1.4 Nein
methyl Parathion 33.6 ja
Paraquat (dichlorid) 4.6 Nein
Pentachlorophenate (Natrium) 71,9 ja
Industriechemikalien Ammoniak 924 ja
Kupfer (Kupfer-II-Sulfat) 103 ja
Cyanid (Natrium) ja
Mercury (Chlorid) 24.7 ja
Toluol 444 ja
Clean Water 2 keiner N / A Nein
1 getesteten Konzentrationen sind die gleichen wie in dem Manuskript von Widder, et al. (2014).
2 40 saubere Wasserproben wurden ohne Kontamination führen.
3 "> 14

Tabelle 1: Schadstoffe in Wasserproben durch ECIS erkannt.

Diskussion

Die ECIS Technologie eine gute Leistung in einer Laborumgebung und war in der Lage mögliche Wasser Verunreinigungen in Konzentrationen zu ermitteln, die für die menschliche Gesundheit relevant sind. Die Portabilität und Verpackung der Technologie macht es auf den Feldeinsatz förderlich.

Kritische Schritte in dem Protokoll für den Erfolg der Technik sind wie folgt: 1) Halten Sie aseptischen Bedingungen während der Kultur, Säen und Fütterung der Biochips, 2) Halten Sie die ausgesäten Biochips in gekühlten Bedingungen bis zum Testen bereit, da die RTgill-W1-Zellen wird nicht sehr lange überleben, wenn sie auf Temperaturen über 25 ° C ausgesetzt sind, 3) wird genau das L-15ex in den pulverförmigen Phiolen Medien und genau die Wasserproben Fehlalarme zu vermeiden messen Herstellung, die durch eine Verschiebung der verursacht werden kann Osmolalität von Medien eher als Probe Toxizität, 4) zum Ausführen der Tests Gebrauchsanweisungen auf der ECIS Bildschirm. Die Software in dem Lesegerät alarmiert den Benutzer, wenn eine biochip ist nicht akzeptabel für die Prüfung (bezogen auf den anfänglichen Impedanzmessungen), wenn der Biochip zuerst in das Lesegerät eingeführt wird. Wenn die Impedanzniveaus nicht akzeptabel für die Prüfung sind, wird die Software nicht zulassen, dass der Benutzer mit der Prüfung fortfahren, bis ein neuer Biochip verwendet wird. Gründe für nicht akzeptabel Impedanzmessungen sind in der Regel aufgrund einer leichten Versatz der Biochip-Elektroden mit den ECIS Leser Stifte oder Flüssigkeitsleckage an einer der Verklebung Kanten des Biochips.

Es gibt einige Grenzen dieser Technologie, da der ECIS Sensor nur mit Trinkwasser und nicht mit Oberflächenwasser getestet. Die RTgill-W1-Zellen, die auf dem Biochip sind, können nicht das Einfrieren oder die Temperaturen weit über 25 ° C für längere Zeit (Zeitrahmen abhängig von Stunden bis Tagen sein kann, von der Temperatur tolerieren. Die Biochips am besten funktionieren in einem Temperaturbereich von gekühlt Raumtemperatur 7. Sie sind sofort einsatzbereit, jedoch direkt nach r zu seinemoved von kalten Lagerung. Tragbare Kühlraumbehälter werden derzeit von Armeepersonal im Bereich für temperaturempfindliche Versorgungen verwendet. Diese gleichen Behälter können für geimpfte Biochip Transport verwendet werden.

Eine weitere Beschränkung dieser Technik besteht darin, dass, obwohl es ein Breitbandsensor Toxizität ist, ist es nicht gut reagiert, wenn überhaupt, auf die Cholinesterase-hemmenden Verbindungen, wie einige Pestizide. Um diese Fähigkeit Lücke zu füllen, wird der ECIS-Sensor entwickelt, um mit einem im Handel erhältlichen schnellen Pestizid-Test-Test in Verbindung verwendet werden, wenn Wasserproben, um die Prüfung der Benutzer mit einem breiteren Spektrum von Toxizitätstests zur Verfügung zu stellen. Das Kit ist eine schnelle enzymatische Assays entwickelt, um Organophosphat und Carbamatpestiziden innerhalb von 30 Minuten zu erkennen.

Die ECIS Sensor ergänzt das WQAS-PM (Water Quality Analysis System - Präventive Medizin) Bereich Wasser-Testsystem, das derzeit von militärischen Präventivmedizin Personal zur Erkennung, arsenic, Blei oder Zyanid in einer Trinkwasserprobe. Obwohl der ECIS Sensor nicht erkennen, was die Verunreinigung ist, zeigt es, wenn bestimmte Metalle oder organische Verbindungen vorhanden sind, was darauf hinweist, dass das Wasser nicht für den menschlichen Verzehr geeignet sind. Die ECIS Testergebnisse sind innerhalb einer Stunde zur Verfügung. Die Wasserproben können dann zur Identifizierung der kontaminierenden gesendet für eine weitere Analyse, wenn es ein positives Testergebnis.

Wie oben beschrieben, wird der ECIS Leser ausgelegt ist Teil eines Systems sein, die eine separate enzymatische ACE-Kit, um ein breites Spektrum an Fremdkörperdetektion zur Deckung umfasst. Beide Leser werden in einem robusten Gehäuse verpackt für Feldtransport für den Feldeinsatz von Soldaten.

Offenlegungen

Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt von der US-Armee unterstützt. Die Zitate kommerzieller Organisationen oder Handelsnamen in diesem Bericht stellen keine offizielle Billigung oder Genehmigung der Produkte oder Dienstleistungen dieser Organisationen durch das Department of the Army dar. Die Autoren Linda M. Brennan und Mark W. Widder, beide vom US Army Center for Environmental Health Research, erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Michael Mayo, Michael McAleer und Alex Greis sind Mitarbeiter von Nanohmics, die die in diesem Artikel verwendeten Einweg-Biochips und -Instrumente herstellen.10251980

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom US Army Medical Research and Materiel Command und vom Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer Program unterstützt; Vertrag Nr. W81XWH-13-C-0093. Wir danken Dr. Lucy Lee von der University of Fraser dafür, dass sie unsere Mentorin für RTgill-W1-Zellkulturen ist, und danken Dr. Niels Bols von der Waterloo University für die Entwicklung der RTgill-W1-Zelllinie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fötales RinderserumLife Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com16000-085@ -20 °C lagern. Vor Gebrauch @ Raumtemperatur auftauen. Zutat für vollständige L-15-Zellkulturmedien (10%).
Fibronektin, RinderplasmaEMD Millipore Corp.    www.emdmillipore.com           341631-1 mg@ -20 °C lagern. Vor Gebrauch @ Raumtemperatur auftauen. Mit L-15-Medien mischen, um eine Konzentration von 10 μ zu erreichen; g/ml und Freeze @ -20 ° C in Aliquoten. Verwendung als Substrat für Biochips.
L-15 Medien ohne L-GlutaminLonza  www.lonzabioscience.com12-700FBasalmedien für Zellkulturen und die Fütterung von Biochips. Bei 6 °C lagern.
L-15ex pulverförmiges Medium mit PhenolrotUS Biological              www.usbio.netL1501Medium wird in 60 mg Aliquoten in 0,1-Dram-Fläschchen abgewogen und bei 6 μg gelagert; C in Folienbeuteln mit Trockenmittelpackungen. Neun Monate Haltbarkeit. Gemischt mit 10 ml Wasserprobe zum Testen in Biochips.
PBS, ohne Ca2+ oder Mg2+Lonza  www.lonzabioscience.com17-516FBei Raumtemperatur lagern. Wird zum Spülen von Medien bei der Trypsinisierung von Zellkulturflaschen verwendet.  
Trypsin, EDTALonza  www.lonzabioscience.comCC-5012@ -20 °C. Bei Raumtemperatur auftauen und zur Trypsinisierung von Zellkulturflaschen verwenden.
T175 KulturflaschenFisher Scientific
www.fishersci.com		12-565-30Wird zur Kultivierung von RTgill-W1-Zellen verwendet.
BleichmittelChlorox                                                                Auf 20 % mit Millique oder destilliertem Wasser verdünnt zur Reinigung von ECIS-Chips. Jedes Haushaltsbleichmittel ist akzeptabel.
70% EthylalkoholZur Desinfektion von Biohaubenoberflächen und Materialien, die in Biohauben platziert werden.
Kiemenzellen der Regenbogenforelle (RTgill-W1) Sammlung von Gewebekulturen des amerikanischen Typs                     www.atcc.orgCRL-2523Zellen, die kultiviert und für Biosensoren verwendet werden (Seeding-Biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mMLonza  www.lonzabioscience.com35050-061Bei Raumtemperatur lagern. Zutat für vollständige L-15-Zellkulturmedien (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10KLonza  www.lonzabioscience.com17-602ELagern @ -20 °C. Vor Gebrauch @ Raumtemperatur auftauen. Zutat für vollständige L-15-Zellkulturmedien (1%).
Pharmed BPTSchläuche U.S. Plastic Corp.          www.usplastic.com57317In 27 mm Schliff geschnitten und autoklaviert. Wird für die Aussaat von Biochips mit Zellen und als geschlossener Kreislauf zwischen Medienwechseln verwendet.
Polycarbonat-Luer-Verschraubungen für Pharmed SchlauchleitungenValue Plastics             MTLS210-9Befestigt an jedem Ende des geschnittenen Pharmed-Schlauchs zum Einführen in Bichips.
20 ml Spritzen mit AufsteckspitzeVWR Scientific         us.vwr.comBD302831Wird zur Injektion von Zellsuspension für die Aussaat von ECIS-Chips sowie zur Fütterung von Chips verwendet.
0,1 Dram Mikrofläschchen aus Polypropylen mit SchnappverschlussFlaschen, Gläser und Tuben, Inc.    www.bottlesjarsandtubes.com30600Zur Aufbewahrung von 60 mg Aliquoten von L-15ex pulverförmigen Medien.
60 mil Lexan fluidische ECIS-BiochipsNanohmics, Inc.      Maßgeschneidert von Nanohmics, Inc. RTgill-W1-Zellen werden in die Biochips injiziert und die geseedeten Chips werden zum Testen in den ECIS-Reader gelegt.
Autoklavierbare Instrumentenbox aus Kunststoff
17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"		Medi-Dose EPS        medidose.comIB701Wird zur Aufbewahrung von folgenden Komponenten verwendet: autoklavierte Stecker, gereinigte Biochips, ausgesäte Biochips.
Heißsiegel-Sterilisationsbeutel aus Papier, 7 & frac12; ” x 13"KardinalGesundheit              www.cardinalhealth.com90713Wird zum Autoklavieren von Rohren, Verschraubungen und Stopfen verwendet.
Quantos automatisierter PulverdosiererMettler Toledo            www.mt.comQB5Automatisierte Abgabe von 60 mg Aliquots von pulverförmigem L-15ex in 0,1-Dram-Fläschchen.
ECIS-LesegerätNanohmics, Inc.      Maßgeschneidert von Nanohmics, Inc. Ein gesäter Biochip wird in das Lesegerät eingesetzt, um Wassertoxizitätstests durchzuführen.
3 x 5 metallisierte 2,5 mil wiederverschließbare Beutel aus PolypropylenUline                                www.uline.comS-16893Verpackung und Lagerung von Biochips mit Saatgut und pulverförmigen L-15ex-Medienfläschchen.
Leatherman squirt ps4Amazon                  Wird zum Öffnen von Fläschchen mit Pulvermedien verwendet.
1 g Kieselgel-Trockenmittel-Päckchen Uline                                www.uline.comS-3902In Polypropylenbeutel mit L-15ex Durchstechflaschen für Pulvermedien geben, um zu verhindern, dass das Pulver Feuchtigkeit aufnimmt.
Sterile 250- oder 500-ml-Nalgene-FlaschenFisher Scientific
www.fishersci.com		09-740-25C oder EHold-Zellsuspensionen für die Aussaat von ECIS-Chips in der Biohaube.
Stecker für BiochipsNanohmics, Inc.      Maßgeschneidert von Nanohmics, Inc. Wird verwendet, um Ports auf Biochips vor der Lagerung bei 6 °C abzudichten.
Abflüsse für ECIS-BiochipsNanohmics, Inc.      Sonderanfertigung von Nanohmics, Inc. Vor dem Einsetzen in den ECIS-Leser an 2 inneren Anschlüssen an Biochips. Ermöglicht das Abfließen von überschüssigem Medium aus den Kanälen während der Testinjektionen. 
HämozytometerFisher Scientific
www.fishersci.com		S17040Wird zum Zählen von Zellen vor dem Einstellen der Zellsuspension für die Injektion in Biochips benötigt.
Hellfeldmikroskop mit 10X ObjektivLeitz LabovertJedes Hellfeldmikroskop ist akzeptabel.
Biologische Sicherheitswerkbankbiologische Sicherheitswerkbank der Klasse II, in der die Zellkultur unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden kann, ist akzeptabel.
Mikrozentrifugenröhrchen, 0,6 mlFisher Scientific
www.fishersci.com		02-681-311Fasst 1 ml Zellsuspension vor dem Zählen der Zellen.
Slip 10 cc rote SpritzenProcedure Products, Inc.            www.procedureproducts.comS/49S 30-REntnahme von 9 ml Testwasserprobe und Verwendung zur Injektion der Probe in den Biochip.
Slip 10 cc blaue SpritzenProcedure Products, Inc.            www.procedureproducts.comS/49S 30-BEntnahme von 9 ml Kontrollwasserprobe und Verwendung zur Injektion der Probe in den Biochip.
½ oz. durchsichtiges PET-Plastikglas mit weißen, gerippten, gefütterten KappenSKS-Flasche & Packaging, Inc.              www.sks-bottle.com0605-30Probenfläschchen zum Mischen von L-15ex-Pulver und 10 ml Wasserprobe zu Testzwecken.
50 ml sterile konische Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenFisher Scientific        www.fishersci.com12-565-269Zur Aufnahme von 40 ml Aliquoten von 10 μ g/ml Fibronektin bei -20 °C.
NIDS ACE Acetylcholinesterase-Hemmer-NachweistestANP Technologies, Inc.
www.anptinc.com		ACE-400Sensor für den schnellen Nachweis von Pestiziden im Trinkwasser
www.chlorox.com www.nanohmics.com www.nanohmics.com www.Amazon.com www.nanohmics.com www.nanohmics.com der Klasse II Jede

Referenzen

  1. Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
  2. States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
  3. Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
  4. van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
  5. Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
  6. Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
  7. Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
  8. Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
  9. O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
  10. Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
  11. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
  12. Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
  13. Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
  14. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
  15. Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
  16. RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).

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