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Methodenartikel

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

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DOI:

10.3791/53561

⸱

1. Januar 2016

 , 
1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University, School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University, School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode, um die Erwachsenen Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Base) zu isolieren. Wir haben auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachzuweisen. Zusammen ermöglichen diese Verfahren die Untersuchung der Haarzellen, Stützzellen und anderen Zelltypen in der Cochlea vorhanden.

Zusammenfassung

Das Corti-Organ, das in der Cochlea des Innenohrs untergebracht ist, enthält mechanosensorische Haarzellen und umgebende Stützzellen, die spiralförmig organisiert sind und einen tonotopischen Gradienten für die Schallerkennung aufweisen. Die Cochlea der Maus ist etwa 6 mm lang und für die Analyse oft in drei Windungen (Spitze, Mitte und Basis) unterteilt. Um den Zellverlust, die Zellteilung oder die Mosaik-Genexpression zu untersuchen, ist die gesamte Präparation der Cochlea nützlich. Diese Dissektionsmethode ermöglicht die Visualisierung aller Zellen innerhalb des Corti-Organs, wenn sie mit Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie kombiniert wird, um Zellen in verschiedenen Ebenen der z-Achse abzubilden. Aus diesen Z-Stapel-Bildern können auch mehrere optische Querschnitte gewonnen werden. Darüber hinaus kann die Whole-Mount-Dissektionsmethode für die Rasterelektronenmikroskopie verwendet werden, obwohl eine andere Fixierungsmethode erforderlich ist. Hier stellen wir eine Methode vor, um das Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, Mitte und Basis) zu isolieren. Diese Methode kann bei Mäusen im Alter von einer Woche bis zum Erwachsenenalter angewendet werden und unterscheidet sich von der Technik für neonatale Proben, bei denen die Verkalkung der Cochlea unvollständig ist. Eine leicht modifizierte Version kann für die Dissektion der Ratten-Cochlea verwendet werden. Wir demonstrieren auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern.

Einleitung

Die spiralförmige Cochlea des Innenohres, innerhalb des Schläfenbeins enthalten, beherbergt das Corti-Organ, das auditive Sinnes Endorgan bei Säugetieren. Die Cochlea ist tonotopically organisiert und gewöhnlich in apikal, mittig geteilt, und basalen Windungen auf verschiedene Frequenzbereiche mit hochfrequenten Schallerkennung in der Basis und Niederfrequenzerkennung entsprechend der Spitze 1. Haarzellen, die mechanosensorischen Zellen des Corti-Organ, führen Sie die Länge der Cochlea, die etwa 6 mm lang bei Mäusen 2,3 ist. Diese Zellen wandeln die mechanische Energie der Schallwellen, die durch die mit Flüssigkeit gefüllte häutige Labyrinth übertragen werden, in neuronale Signale, die von zentralen auditorischen Strukturen verarbeitet werden. Die hier beschriebene Technik stellt ein Verfahren zur Herstellung von ganzen Bergen von Corti-Organ nach der Verkalkung der Cochlea abgeschlossen ist (für die Proben von einer Woche im Alter bis zum Erwachsenenalter). Wir präsentieren auch ein Verfahren zur immunostaining der ganzen montiert Cochlea-Gewebe. Cochlear Gesamtpräparate sind entscheidend für die Visualisierung der Haarzellen und Stützzellen umgibt in ihrer natürlichen räumlichen Anordnungen und ermöglichen eine Analyse in drei Dimensionen unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie.

Drs. Hans Engström und Harlow Ades beschrieb ursprünglich eine ganze montieren Cochlea-Dissektion Verfahren im Jahr 1966. Sie detailliert eine Technik, um schnell zu fixieren und zu sezieren verkalkten cochleae in Flüssigkeit eingetaucht ist aus einer Vielzahl von Säugetieren, die Erhaltung intakter kurzen Segmenten des Corti-Organ für die mikroskopische Analyse 4. Die Präparation eines nicht fixierten, verkalkten Cochlea der Ratte hat sich auch in einem Lehr-Video 5 dargestellt. Drs. Barbara Bohne und Gary Harding an der Washington University, machte einige wichtige Veränderungen an dieser Methode. In ihrer Version der Cochlea ganze Berg-Methode, war das Schläfenbein entkalkt, in Kunststoff eingebettet und fünf Halbdrehungen oder zehn Viertel-Drehungen waren dissected 6,7. Dr. Charles Liberman und Kollegen an Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiziert diese Technik so, daß Kunststoff-Einbettung nicht erforderlich 8. Weitere Modifikation der Technik traten bei Dr. Jian Zuo Labor in St. Jude-Kinderkrankenhaus 9-12, die die hier präsentierten Dissektion Verfahren informiert. Wir verwenden eine andere Strategie, um Zugriff auf das Corti-Organ als Bohne und Liberman, die Isolierung der kompletten apikalen, mittleren und basalen Umdrehungen ermöglicht zu gewinnen. Damit die sezierten Gewebe grßer und weniger wahrscheinlich, dass während der Dissektion oder Immunprozesse verloren gehen oder beschädigt werden. Darüber hinaus erleichtert die aktuelle Methode Messung des Abstandes von der apikalen Spitze oder basal Haken um einen Frequenzbereich zu ermitteln.

Obwohl viele Labors durchführen Immunfärbung von Cochlea-Gewebe, ist unklar, wo diese Methode entstand. Als Ergebnis gibt es verschiedene Rezepte zum Blockieren buffeRS und Antikörperinkubation Puffer, die die Leistung der einzelnen primären Antikörper beeinträchtigen kann. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für die am häufigsten verwendeten Antikörper im auditorischen Bereich ist.

Die komplexe Form der Cochlea, zarte Struktur des Corti-Organ, und knöchernen Umhüllung eine Herausforderung für die histologische und biochemische Analyse. Eine Vielzahl von Techniken sind derzeit in der mündlichen Verhandlung Feld verwendet, um diese schwierige Features zu überwinden und die Zellen zu visualisieren im Corti-Organ, jede Technik mit eigenen Vor- und Nachteile. Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt ganze Berg Dissektion der erwachsenen Maus Cochlea und mit leichten Modifikation kann potentiell verwendet werden, um die kritischen Strukturen im cochleae aus einer Vielzahl von anderen auf dem Gebiet verwendet werden Modellorganismen untersuchen.

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Protokoll

Ethics Statement: Verfahren, die Tier Themen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Southern Illinois University School of Medicine genehmigt.

1. Extraktion der Schläfenbeine

  1. Identifizieren Schläfenbeine in der Unterseite der Maus Schädel 13 und abkratzen die Hirnnerven mit Standardmuster Pinzette.
  2. Zeigen Standardmuster einer Pinzette an der Spitze der Ohrkapsel und mit dem Daumen der anderen Hand drücken Sie auf den hinteren Bogengangs, um den gekapselten Cochlea zu entfernen.
  3. Befreien Sie die untere Hälfte des Schläfenbeins aus dem Schädel von Hand mit dem Daumen und Zeigefinger oder mit Hilfe 10.5 cm feinen Schere.

2. Post-fix Schläfenbeine

  1. Platzieren temporale in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die 250 bis 500 & mgr; l 4% Paraformaldehyd (PFA) in 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 und Incubaß bei RT für 2 - 20 h.
    HINWEIS: Keine Öffnung der apikalen Kappe oder Injektion von PFA in die runden oder ovalen Fenster benötigt wird. Empfehlen die Verwendung von Methanol-freien, hochreine, Elektronenmikroskopie (EM) grade PFA, das bei einer 16% igen Konzentration in Glasfläschchen erworben werden kann. Sobald eine Ampulle geöffnet und 1: 4 verdünnt in PBS, so dass eine 4% ige Lösung, kann es bis zu 2 Wochen verwendet werden, wenn bei 4 o C gelagert (Einige Antikörper erfordern kurze Fixierung und andere können tolerieren O / N (O / N) Fixierung).

3. entkalken Schläfenbeine

  1. Nach der Fixierung zu entfernen PFA mit einer Pipette und ersetzen mit 120 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), etwas mehr als 2 ml. Stellen Sie sicher, die gesamte 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu verhindern, dass Luftblasen, wenn das Rohr geschlossen zu füllen.
    1. Wenn sie nicht sofort die Entkalkung, ersetzen PFA mit 10 mM PBS, pH 7,4, und Proben bei 4 o C
      HINWEIS: Nach der Fixierung kann Schläfenbeine für variab gespeichert werdenle beträgt der Zeit, bis der Entkalkung in Abhängigkeit von der Antigene untersucht.
  2. Die Röhrchen auf End-Over-End-Rotator und rotieren mit 4 Umdrehungen pro Minute bei RT. Ändern EDTA-Lösung täglich mit einer Pipette. Länge der Entkalkung ist abhängig vom Alter der Probe und der Präferenz des Wissenschaftlers dabei die Dissektion.
    1. Inkubieren Schläfenbeine in EDTA mit den folgenden Leitlinien für die Inkubationszeiten:
      Für Proben postnatalen Tag (P) von 8 bis P15: 2-4 h; Für Proben, P15 bis P21: O / N; Für Proben, P21 bis P30: 2 O / N; Für Proben, die älter als P30: 3 oder mehr O / N.
      HINWEIS: Entkalkung Zeiten können sich Nutzer Vorlieben und erweitert, wie gebraucht werden. Entkalkungszeit kann durch zweimaliges Ändern der EDTA-Lösung am Tag, etwa 8 Stunden auseinander reduziert werden. Einige Labors hinzufügen 1% PFA in die EDTA-Lösung, wenn die Entkalkung länger als 3 Tage, um eine Kontamination zu verhindern.
  3. Um festzustellen, ob die Probe ausreichend entkalkt, legen Schläfenbeine ona Silikonelastomer-beschichtet Dissektion Schüssel und drücken Sie vorsichtig Pinzette auf die schneckenförmige Cochlea. Wenn das Gewebe spongey ist, dann ist die Entkalkung komplett.
  4. Sobald Entkalkung beendet ist, entfernen EDTA mit einer Pipette und fügen 500 -1000 ul 10 mM PBS pH-Wert 7,4. Proben bei 4 ° C bis bereit zu sezieren.

4. Erstellen Sie Silikon-Kautschuk beschichtet Dissection Dish

  1. Kombinieren Sie die Basis und Härter aus einem Silikonelastomer Einkapselungsmaterial Kit nach den Anweisungen des Herstellers und gründlich mischen.
  2. In ca. 2 - 3 Esslöffel Pulver-Aktivkohle, bis die Lösung schwarz und gut mischen.
    HINWEIS: Flüssigtinte oder Flüssigkohle wird nicht mit der Lösung zu mischen, und kann nicht verwendet werden. Siliconelastomer-Einkapselung Kits können in Schwarz erworben werden, so dass Schritt 4.2 entfallen.
  3. Füllen Sie die Lösung in 60 mm Glas oder Kunststoff-Petrischalen, Füllung reicht zur Beschichtung der Unterseite. Wenn bubbles vorhanden sind, Blätterteig mit Luft auf der Oberfläche. Lassen Sie stehen mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur eingestellt.
    HINWEIS: Silikon-Elastomer-beschichteten Schalen kann immer wieder für Jahre verwendet werden. Aber nicht mit Ethanol zur Reinigung, da sonst das Siliconelastomer zu knacken.

5. Ganze Berge Dissektion der Cochlea (für P7 und Ältere Proben)

  1. Trennen Sie die Basalwindung von Mitte / apikalen Windungen
    1. Legen Sie eine entkalkt Schläfenbein in einem Silikonelastomer-beschichtet Dissektion Teller füllte zwei Drittel mit 10 mM PBS, pH 7,4, und verwenden Sie ein Stereo-Dissektionsmikroskop für die folgenden Schritte.
    2. Halten Sie das Schläfenbein im vestibulären Bereich mit # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier- und mit 5 mm Vannas-Tübingen Frühjahr Schere, schneiden Sie überschüssiges Ohrkapsel Gewebe an den Seiten und über der Spitze.
    3. Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, legen Sie ein Blatt in das ovale Fenster und stellen Sie mehrere kleine Schnitte entlang der Spiralligament / SeitenWand der basalen Windung.
    4. Unter Verwendung von 5 mm Vannas-Tübingen-Federschere, legen Sie ein Blatt in die Region nur schneiden und legen Sie die andere Klinge auf der Außenseite des Schläfenbeins, medial der ovalen Fenster. Dieser Schnitt trennt den Basalwindung von mittleren und apikalen Windungen.
  2. Komplette Dissektion der basalen Windung.
    1. Verwendung von 2,5 mm Vannas Frühjahr Schere, schnitt die Spiralgangliennervenfasern, die zu der Modiolus zu verbinden, um die Spannung in der basalen Windung freigeben und unter dem Basalwindung geschnitten, um vom Gleichgewichtsorgan zu trennen.
    2. Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, stellen eine Reihe von kleinen Schnitten, um das Ligamentum spirale / Seitenwand von oben und unten Corti-Organ zu entfernen. Verwenden Sie # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, um das Gewebe zu führen. Pin die Spiralgangliennervenfasern zu dem Silikonelastomer beschichtet Dissektion Gericht, aber nicht auf diesen Bereich zu halten, wenn das Gewebe zu zerreißen.
    3. Während der vorhergehenden Schritte, einige der Reissner membrane werden oft entfernt werden. Wenn einer nach wie vor, fassen Sie die Reissner-Membran mit einer Pinzette # 4 oder # 5 gerade Juwelier- und ziehen weg von Corti-Organ.
      HINWEIS: Die Deckmembran ist selten sichtbar und in der Regel schwimmt weg, ohne einen bestimmten Schritt zur Entfernung erfordern.
    4. Schließlich machen mehrere Schnitte, um die Dicke der Spiralganglien Axone zu reduzieren, um die wiederum so flach wie möglich herzustellen und zu verwenden # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, um die seziert Basalwindung zu übertragen, durch Ergreifen Sie die verbleibenden Axone des Spiralganglions, um eine 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger), die ~ 500 ul 10 mM PBS pH-Wert 7,4.
  3. Separate mittleren und apikalen Windungen
    1. Die restlichen zwei Drittel der Cochlea, apikalen Seite nach unten.
    2. Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, legen Sie ein Blatt in die Scala media, wo die Mitte wiederum verwendet, um die basalen Windung verbunden werden, und stellen Sie mehrere kleine Schnitte entlang der Spiralligament / Seitenwand the mittleren Reihe.
    3. Unter Verwendung von 5 mm Vannas-Tübingen-Federschere, legen Sie ein Blatt in der Region nur mit der Mitte wiederum auf der Oberseite des Blattes platziert geschnitten, und legen Sie die andere Klinge auf die außerhalb des knöchernen Labyrinth, in einem 90 o Winkel von der apikalen Spitze. Dies trennt den mittleren wiederum von der apikalen Umdrehung.
  4. Vollständige Präparation der Mitte wiederum in einer ähnlichen Weise zu der basalen Windung (siehe Schritte 5.2.2 bis 5.2.4).
  5. Komplette Dissektion der apikalen Umdrehung.
    1. Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, öffnen Sie die Kappe, die den Scheitel wiederum deckt. Komplette Zerlegung in einer ähnlichen Weise zu der basalen Windung (siehe Schritte 5.2.2 bis 5.2.4).
      HINWEIS: Dissected cochleären Windungen in 10 mM PBS, pH 7,4, in einer 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger) bei 4 ° C über mehrere Wochen vor der Immunfärbung gelagert werden. Jedoch PBS verdampft und muss periodisch aufgefüllt werden und die Lagerung von mehr als 2 - 3 Wochen in bakteriellen oder pilzlichen Wachstums auf dem ErgebnisGewebe, das die Qualität des Bildes zu verringern kann. Wir empfehlen, die Langzeitlagerung von Proben als unzerSchläfenBeine.

6. Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörper

  1. Nach der Dissektion, speichern jede Cochlea wiederum in einer separaten Vertiefung in einer 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger), in ~ 500 ul 10 mM PBS, pH 7,4, eingetaucht. Für jeden der folgenden Schritte sollten die Windung der Cochlea in Flüssigkeit eingetaucht werden und nicht auf der Oberseite schwebend oder auf der Seite des Gut geklebt.
    HINWEIS: Beim Entfernen von Flüssigkeit aus jeder Vertiefung, ist es leicht, die Cochlea-Windungen verlieren oder saugen sie auf in der Pipettenspitze. Ändern Lösungen mit 200 ul Pipettenspitze mit einer Dissektion Umfang wird dazu beitragen, dies zu verhindern.
  2. Mit einer Pipette entfernen PBS aus jeder Vertiefung und ersetzen mit ~ 200 bis 300 & mgr; l pro Vertiefung blockiert / Permeabilisierung Lösung (1% Triton X-100, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% normalem Ziegenserum (NGS) in 10 mM PBS verdünnt pH 7,4). Inkubieren Sie 1 Stunde bei RT auf einem 3D-Rotator.
    HINWEIS: Wenn ein primärer Antikörper verwendet wurde, bei einer Ziege Wirt gemacht, dann eine sekundäre anti-Ziegen-Antikörper benötigt werden und NGS sollten nicht für jeden der Schritte verwendet werden. Pferdenormalserum kann als Ersatz für NGS verwendet werden.
  3. Entfernen Sie blockiert / Permeabilisierung Lösung mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 ul pro Vertiefung von primären Antikörperlösung (0,1% Triton X-100, 1% BSA und 5% NGS in 10 mM PBS, pH 7,4, verdünnt). Der Verdünnungsfaktor für jeden primären Antikörper variiert. Inkubieren Sie O / N (mindestens 14 h) bei 4 ° C auf einem 3D-Rotator.
    HINWEIS: Wenn mehr als eine primäre Antikörper verwendet wird, können alle in der gleichen Lösung für die Inkubation kombiniert werden, so stellen Sie sicher, dass jeder primären Antikörper hat einen anderen Host.
  4. Entfernen primären Antikörperlösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Jeder Wasch brütet mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator.
  5. Entfernen letzten PBS Wäsche mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 ul pro Vertiefung von sekundären Antikörper-Lösung (0,1% Triton X-100, 1% BSA und 5% NGS in 10 mM PBS, pH 7,4, verdünnt). Der Verdünnungsfaktor für jedes fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers ist in der Regel 1: 500 oder 1: 1000. Platzieren Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um fluoreszenz schützen getaggt Sekundärantikörper von Licht. Inkubieren Sie 2 - 3 h bei RT auf einem 3D-Rotator.
    HINWEIS: Wenn mehr als ein sekundärer Antikörper ist erforderlich, können sie in die gleiche Lösung für die Inkubation kombiniert werden. Stellen Sie sicher, es gibt keine Möglichkeit der grenzüber Kennzeichnung (z. B. unter Verwendung von Ziege-Anti-Kaninchen und Huhn anti-Ziege Sekundärantikörper)
  6. Entfernen sekundären Antikörper-Lösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Inkubieren jeder Wäsche für mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen.
  7. Entfernen letzten PBS waschen mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 & mgr; l pro Vertiefung Hoechst 33342 (verdünnt 1: 2000 in 10 mM PBS pH-Wert 7,4), um Kerne zu beschriften. Inkubieren 15-20 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie nicht länger als 20 min.
  8. Entfernen Hoechst-Lösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Inkubieren jeder Wäsche für mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen.
  9. Alle Schritte können bei Bedarf erweitert werden, mit der Ausnahme, Hoechst Inkubation von mehreren Stunden. Um die Reaktion zu jedem Zeitpunkt unterbrechen, nur tauchen Proben in ~ 500 ul 10 mM PBS, pH 7,4, und speichern Sie die 48 -well Platte (oder Kammerobjektträger) bei 4 ° C bis bereit, um die Protokoll-Stunden oder 1 wieder aufzunehmen - 2 Tage später .

7. Montieren Cochlear Schaltet Slides

  1. Etikettenträger mit einschlägigen Informationen über die Probe und Antikörper verwendet.
  2. Pipette ~ 50 ul Eindeckmittel auf jeder Folie und darauf achten,um Blasen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Befestigungsmittel, um alle Luftblasen zu entfernen.
  3. Mit # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, fassen die Axone des Spiralganglions, um sanft zu übertragen ein Cochlea wiederum von der 48-Well-Platte mit dem Schlitten und in die Montage Medien. Hängen Sie eine Cochlea wiederum pro Folie, um Belichtung und Photobleichen während des Abbildungsprozesses zu verhindern.
  4. Verwenden Sie ein Stereo Dissektionsmikroskop um sicherzustellen, dass Cochlea wiederum nicht gefaltet, verdreht, oder in der Nähe einer Luftblase. Wenn eine dieser Bedingungen auftreten, Pinzetten Verwendung # 4 oder # 5 gerade Juwelier, um die Cochlea wiederum neu zu positionieren.
  5. Platzieren Sie ein Ende eines Deckglas auf den Objektträger und sanft loslassen, um das Deckglas fallen lassen.
  6. Verwenden Sie ein Stereo Dissektionsmikroskop, um sicherzustellen, dass die Cochlea wiederum nicht gefaltet, verdreht, oder in der Nähe einer Luftblase. Wenn eine dieser Bedingungen zutrifft, sanft bewegen das Deckglas hin und her, um die Cochlea wiederum neu zu positionieren.
  7. Objektträgerin einer Dia-Ordner, so dass sie flach. Lassen Sie die Montage Medien Heilung O / N bei RT (halten in der Dunkelheit)
  8. Seal Deckgläser mit klarem Nagellack und lagern bei RT oder -20 ° C bis abgebildet. Dias können in einer Diashow Ordners oder Dias Box gespeichert werden.
    HINWEIS: Die Objektträger können langfristig bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert werden und die Fluoreszenz wird für mehrere Monate aufrechterhalten werden.
  9. Bildobjektträger unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit der entsprechenden Wellenlänge auf der Basis der Sekundärantikörper in der Immunfärbung verwendet. Helligkeit und Kontrast können unter Verwendung der Imaging-Software durch die konfokale Anbieter bereitgestellt werden.

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Ergebnisse

Wir präsentieren eine Methode, um das Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Basis) von Cochlea-Gewebe, das verkalkt ist, mit den wichtigsten Dissektion Schritte in Abbildung 1 dargestellt zu isolieren. Während der ersten postnatalen Woche der Entwicklung, Verkalkung der Maus Cochlea ist unvollständig und eine einfachere Dissektion Methode kann verwendet 13 werden. Verwenden des Neugeborenen ganze Berg Dissektion Methode mit Cochl...

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Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche ganze Berg Präparation und Immunfärbung. Jedoch, bevor Sie eine dieser Methoden durchgeführt werden, ist die richtige Fixierung der Cochlea Gewebe benötigt. Wir empfehlen die Verwendung von Methanol-freien, hochreine, EM Grade PFA. PFA von Pulver kann Spuren von Methanol und einem instabilen pH-Wert, die Qualität der Immunfluoreszenz abnimmt. Andere Gruppen haben gezeigt, dass ähnliche Sektionen sind mit Hilfe Fixiermittel die Formaldehyd 14-16 ent...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss des Office of Naval Research (N000141310569) unterstützt. Die Ausrüstung der Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility wurde vom National Center for Research Resources-Health (S10RR027716) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Standard-Zange für das MusterFine Science Tools11000-12kann bei anderen Anbietern erworben werden
10,5 cm feine SchereFine Science Tools14060-11kann bei anderen Anbietern erworben werden
2 ml MikrozentrifugenröhrchenMidSciAVSS2000können bei anderen Anbietern erworben werden
16 % Formaldehyd, methanolfrei, ultrarein, EM-QualitätPolysciences18814GIFTIG -- Handschuhe tragen und darf nicht in der Spüle entsorgt werden. Kann bei anderen Anbietern erworben werden.
PBS pH 7,4 SigmaP3813-10PAKkann bei anderen Anbietern gekauft
werden EDTA FisherBP118-500kann bei anderen Anbietern gekauft
End-over-End-RohrrotatorFisher05-450-127kann bei anderen Anbietern gekauft werden 60
mm PetrischaleFisher50-202-037kann bei anderen Anbietern gekauft werden
Dow Corning Sylgard 184 SilikonverkapselungskitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KG
AktivkohleFisherAC134372500kann bei anderen Anbietern gekauft
werden Stereo-DissektionsmikroskopZeissStemi 2000kann bei anderen Anbietern gekauft werden
Dumont #4 JuwelierzangeFine Science Tools11241-30
Dumont #5 JuwelierzangeFine Science Tools11251-20
2,5 mm Federschere VannasFine Science Tools15001-08gebogen 
5 mm Federschere Vannas-TübingenFine Science Tools15003-08gerade
48-Well-PlattenFisher08-772-52kann bei anderen Anbietern erworben werden
8-Well-Kammer-ObjektträgerFisher1256518kann bei anderen Anbietern erworben werden
Triton X-100SigmaX100-500kann bei anderen Anbietern erworben
werden BSA, Fraktion VFisherBP1605kann von anderen Anbietern erworben werden
NGSVector labsS-1000kann von anderen Anbietern erworben werden
NHSVector labsS-2000kann von anderen Anbietern erworben werden
3D-RotatorMidsciR3D-710kann von anderen Anbietern erworben werden
Western Blot Inkubationsbox XLLicor929-97401
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570kann bei anderen Anbietern erworben werden
Prolong Gold Antifade-MontagemedienLife TechnologiesP36930können bei anderen Anbietern erworben werden, aber Montagemedien variieren in ihrer Fähigkeit, vor Photobleiche zu schützen
Superfrost Plus ObjektträgerFisher12-550-15können von anderen Anbietern gekauft werden
Deckgläser 22 x 22 x 1Fisher12-548-Bkann bei anderen Anbietern gekauft werden klarer
NagellackÖrtliche Drogeriekann bei anderen Anbietern gekauft werden
Diamappe aus PappeFisher12-587-10kann bei anderen Anbietern gekauft werden
Kunststoff-DiaboxFisher03-448-10kann bei anderen Anbietern gekauft werden
werden

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Corti OrganImmunfluoreszenzf rbungKonfokalmikroskopieSchneckenwindungenEntfernung des Spiralbandesfluoreszierende Antik rperZ Achsen BildgebungCochlea Pr paration
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