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Methodenartikel

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

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DOI:

10.3791/53570

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1. Dezember 2017

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1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Zusammenfassung

Geburtsfehler, bei denen der Großhirnrinde – auch bekannt als Fehlbildungen der kortikalen Entwicklung (MCD) – sind wichtige Ursachen für geistige Behinderung und 20-40 % der pharmakoresistente Epilepsie im Kindesalter. Hochauflösenden bildgebenden hat in Vivo Identifizierung einer großen Gruppe von MCD Phänotypen erleichtert. Trotz der Fortschritte in der Bildgebung des Gehirns, genomische Analyse und Generierung von Tiermodellen fehlt ein einfache Workflow, systematisch Kandidatengene priorisieren und funktionelle Auswirkungen der vermeintlichen Mutationen testen. Um dieses Problem zu überwinden, wurde eine experimentelle Strategie ermöglicht die Identifizierung von neuartigen verursachenden Gene für MCD entwickelt und validiert. Diese Strategie basiert auf identifizierende Kandidat genomische Regionen oder Gene über Array-CGH oder ganze Exome Sequenzierung und charakterisieren die Auswirkungen ihrer Inaktivierung oder der Überexpression des spezifischen Mutationen bei der Entwicklung von Nagetier Gehirne über in utero Elektroporation. Dieser Ansatz führte zur Identifikation des C6orf70 -Gens, Codierung für eine vermeintliche vesikuläre Protein zur Pathogenese der periventrikulären noduläre Heterotopie, ein MCD verursacht durch mangelhafte neuronale Migration.

Einleitung

Die Hirnrinde spielt eine Schlüsselrolle in kognitiven und intellektuellen Prozesse und emotionale Kontrolle ebenso wie lernen und Gedächtnis beteiligt ist. Es ist daher nicht verwunderlich, dass viele neurologische und psychiatrische Erkrankungen von Fehlbildungen der kortikalen Entwicklung (MCD) führen. Die Ätiologie der MCD ist komplex, da beide erworben und genetische Faktoren beteiligt sind. Die kumulative Prävalenz der genetisch bedingten Anteil der MCD ist etwa 2 % und sie sind in den meisten Fällen sporadisch. Zum Beispiel die Inzidenz der angeborene Gehirn Dysgenesie höher als 1 % der menschlichen Bevölkerung geschätzt wurde, und einige Formen von MCD eingehalten werden, bei mehr als 14 % aller Patienten mit Epilepsie und in 40 % der schweren oder hartnäckigen Epilepsie1, 2.

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist eines der am häufigsten verwendeten MCDs und wird durch abnorme Migration der Neuronen aus der ventrikulären Zone (VZ) der entwickelnden Hirnrinde verursacht. Das Scheitern der Neuronen, Ergebnisse in Clustern von heterotopisch Neuronen entlang der Wände der seitlichen Ventrikel zu migrieren, die in der Regel mit Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) visualisiert werden können. Die klinischen, anatomischen und bildgebende Merkmale der PNH sind heterogen. Knötchen reichen von kleinen und einseitige bilateralen und symmetrisch. Gemeinsame klinische Folgeerscheinungen enthalten Epilepsie und geistige Behinderung3. Mutationen im gen Filamin A (oder FLNA), die in Xq28 Landkarten, fanden sich in 100 % der Familien mit X-chromosomal bilaterale PNH und in 26 % der sporadischen Patienten3,4. Eine seltene, rezessive Form der PNH verursacht durch Mutationen im ARFGEF2 -gen, die in 20q13 Landkarten, wurde in zwei konsanguinen Familien5berichtet. Vor kurzem wurden biallelische Mutationen in Genen Codierung der Rezeptor-Ligand-Cadherin-paar DCHS1 und FAT4 in eine multisystemische Erkrankung, die PNH6umfasst neun Patienten identifiziert. PNH auch zugeordnete Fragiles-X Syndrom7, Williams-Syndrom8, 22q11 Mikrodeletion Syndrom9, Duplikationen bei 5 p 1510, Streichungen bei 1 p 3611, 5q14.3-F1512, 6 p 2513 und 6q terminal löschen-Syndrom14,15,16,17,18,19, was darauf hindeutet, dass zusätzliche verursachenden Gene verteilt sind während des Genoms. Jedoch bleibt für etwa 74 % der sporadischen PNH Patienten die genetische Grundlagen aufgeklärt17.

Klassische gen Zuordnung Ansätze wie Array Comparative genomische Hybridisierung (Array-CGH) haben sich bewährt, dass eine leistungsfähige Werkzeuge zur Erkennung von submikroskopischer Chromosomenanomalien, jedoch die genomischen Regionen identifiziert, die Verwendung dieses Ansatzes sind oft große und zahlreiche Gene enthalten.

Das Aufkommen der massiven parallelen Sequenzierung Techniken (d.h. ganze Exome Sequenzierung (WES) und gesamte Genom Sequenzierung (WGS)) hat die Kosten und den Zeitaufwand für eine gesamte menschliche Exome oder Genom-Sequenz deutlich reduziert. Interpretation von WES und WGS Daten bleibt jedoch herausfordernd in den meisten Fällen, da für jeden Patienten Dutzende bis Hunderte (oder sogar Tausende, abhängig von der Art der Analyse) Varianten von Filtern von Daten entstehen.

Um den Prozess der Identifizierung neuer MCD verursachenden Gene, einer neuartige systematischen Strategie verbindet Array-CGH zu beschleunigen, wurde WES und in Utero Elektroporation (IUE) Screening von Kandidatengenen entwickelt. IUE kann selektiv deaktivieren (oder overexpress) bestimmter Gene oder Mutationen in Nagetier Gehirne, schnelle Auswertung von ihrer Beteiligung an Kortikogenese18,19. RNAi vermittelte-Zuschlag oder Überexpression des einen oder mehrere Kandidaten-Gene wird voraussichtlich dazu führen, dass wenn das Gen Krankheitsentwicklung, lokalisierte Mängel in neuronalen Migration und/oder Reifung zugeordnet ist. Bei der Identifizierung eines Gens, dessen Inaktivierung (oder Überexpression) den Phänotyp bei Patienten in den Nagetieren beobachtet reproduziert, wird eine hervorragende Kandidatin für das Screening bei sporadischen Patienten mit MCD. Mit diesem Ansatz, ergeben wir vor kurzem den entscheidenden Beitrag des C6orf70 -Gens (auch bekannt als ERMARD) in der Pathogenese der PNH bei Patienten mit 6q27 chromosomalen Deletionen16.

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Protokoll

Ethik-Anweisung: Wistar-Ratten wurden gedeckt, gepflegt und in INMED Tierhaltungen, in Übereinstimmung mit der Europäischen Union und französische Gesetzgebung verwendet.

1. DNA-Extraktion und Quantifizierung für Array-CGH und WES

  1. Extrahieren Sie Genomic DNA (gDNA) aus menschlichem Blut Leukozyten von Patienten mit einer automatisierten DNA-Isolierung Roboter oder im Handel erhältlichen manuellen DNA Extraktion Kits nach Protokoll des Herstellers. Alle Proben mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren.

(2) Array-CGH-Protokoll

  1. Beschränkungsverdauung von gDNA
    1. Doppelte Digest 500 ng des gereinigten gDNA von Patienten und einer handelsüblichen menschlicher Kontrolle DNA mit RsaI und AluI für 2 h bei 37 ° C. Verwenden Sie 0,5 μl von 10 U/μl Enzym für jede Reaktion. Inkubieren Sie für 20 min bei 65 ° C, um die Enzyme zu inaktivieren und die Probenröhrchen zu Eis zu bewegen.
  2. Kennzeichnung der Probe
    1. Fügen Sie das entsprechende Volumen der zufälligen Primer für die Microarray-Format im Einsatz, um jedes Reaktionsgefäß (z. B. 5 µl für 1-Pack, 2er-Pack und 4er-Pack Microarrays) benötigt. Mischen Sie gut durch Pipettieren sanft rauf und runter.
    2. Übertragen Sie Probenröhrchen in einem Thermocycler. Bei 95 ° C für 3 min. und dann bei 4 ° C für 5 min inkubieren.
    3. Vorbereiten eines Cyanin 3 und einer Cyanin 5 Kennzeichnung Master Mix auf Eis durch Mischen der folgenden Bände: 10,0 µl 5 X Reaktion Puffer, 5,0 µl 10 X dNTPs, 3,0 µl Cyanin 3-dUTP oder Cyanin 5-dUTP und 1,0 µl Exo (-) Klenow-Enzym, 2.0 µl Nuklease-freies Wasser. Wählen Sie die Lautstärke jedes Reagenz entsprechend dem Microarray-Format im Einsatz.
    4. Jede Reaktionsröhrchen mit der gDNA Kennzeichnung Master Mix hinzufügen. Mischen Sie gut durch sanft auf und ab pipettieren.
    5. Probenröhrchen auf einem Thermocycler übertragen und Inkubation bei 37 ° C für 2 h, 65 ° C für 10 min und dann behaupten die Proben bei 4 ° C.
  3. Reinigung des gekennzeichneten gDNA
    1. Jedes Reaktionsgefäß 430 µl 1 X TE (pH 8,0) hinzufügen.
    2. Legen Sie eine Reinigung-Spalte in 2 mL Röhrchen und bezeichnen Sie die Spalten entsprechend. Laden Sie jede beschriftete gDNA auf eine Reinigung-Spalte.
    3. Zentrifuge für 10 min bei 14.000 x g in einem Microcentrifuge bei Raumtemperatur. Die Flow-through zu verwerfen Sie und setzen Sie die Säule zurück in das 2 ml Sammelröhrchen.
    4. Jede Spalte 480 µL 1 X TE (pH 8,0) hinzufügen. Zentrifuge für 10 min bei 14.000 x g in einem Microcentrifuge bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Durchfluss.
    5. Invertieren Sie die Spalte in einen frischen 2 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 1.000 x g in einem Microcentrifuge bei Raumtemperatur, gereinigten Probe zu sammeln.
    6. Bringen Sie das Probenvolumen, beantragte die Microarray-Format verwendet einen Konzentrator verwenden oder hinzufügen 1 X TE (pH 8,0). Zum Beispiel für 1-Pack Microarray bringen die Lautstärke auf 80,5 µL. brüten die Probe für 5 min auf Eis und dann pipette die Lösung nach oben und unten 10 Mal.
  4. Vorbereitung der gekennzeichneten gDNA für die Hybridisierung
    1. Prüf- und Proben unter Verwendung der entsprechenden Cyanin 5 beschriftet Probe und Cyanin 3 beschriftet Probe in einem frischen 1,5 mL RNase-freies Rohr zu kombinieren. Zum Beispiel für 1-Pack Microarray sorgen dafür, dass der letzte Band ist 158 µL. Wählen Sie die Lautstärke jeder Probe entsprechend dem Microarray-Format im Einsatz.
    2. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um Ertrag, Etikettierung oder bestimmten Aktivitätsgrad durch Messung der Extinktion bei A260 nm (DNA), A550 nm (Cyanin 3) und A650 nm (Cyanin 5) zu messen.
      1. Ertrag mit Hilfe der Formel zu berechnen: [DNA concentration(ng/µl) x Probenvolumen (µl)] / 1.000 (ng/µg). Spezifische Aktivität mit Hilfe der Formel zu berechnen: Pmol pro µl Farbstoff/µg pro µl gDNA.
        Hinweis: zum Beispiel für 0,5 µg Eingabe DNA, der Ertrag sollte 8 bis 11 µg und die spezifische Aktivität (Pmol/µg) sollte 25 bis 40 für Cyanin-3 Probe und 20 bis 35 für das Cyanin-5 gekennzeichneten Beispiel gekennzeichnet.
    3. Um die Höhe der Hybridisierung Master Mix benötigt für die Microarray-Format im Einsatz vorzubereiten, mischen die folgenden Reagenzien: 50 µL Kinderbett-1 DNA (1,0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH Blocking Agent und 260 µl 2 x HI-u/min Hybridisierung Puffer.
    4. Fügen Sie das entsprechende Volumen der Hybridisierung Master Mix 1,5 ml RNase-freies Rohr, die enthält die gekennzeichneten gDNA um das Gesamtvolumen für die Microarray-Format im Einsatz erforderlich zu erhalten. Zum Beispiel für 1 Packung Microarray, sicherstellen Sie, dass der letzte Band für jede Reaktion 362 µl.
    5. Mischen der Probenmaterials durch Pipettieren rauf und runter, dann schnell bei 14.000 x g Zentrifugieren und 3 min bei 95 ° C und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
  5. Kammern Montage- und Hybridisierung
    1. Laden Sie eine saubere Dichtung Folie in der Kammer-Basis mit der Dichtung Beschriftung nach oben und mit rechteckigem Querschnitt der Kammer Basis ausgerichtet. Stellen Sie sicher, dass die Dichtung Folie bündig mit der Kammer-Basis und nicht nur angelehnt ist.
    2. Verzichten Sie Hybridisierung Probe Mischung auf die Dichtung gut, um sicherzustellen, dass die Probe gleichmäßig verteilt wird.
    3. Legte eine Microarray-Folie auf der Dichtung Folie Bewertung, dass das Sandwich-paar richtig ausgerichtet ist. Dann montieren der Reaktionskammer setzen die Abdeckung auf das Sandwich Folien und Hand-Verschärfung der Klemme.
    4. Folien, die Benetzung durch Drehen der versammelten Kammer vertikal zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Bläschen nicht im Plenarsaal anwesend sind. Tippen Sie gegebenenfalls auf die Baugruppe auf eine harte Oberfläche, um stationäre Luftblasen bewegen.
    5. Setzen Sie die montierte Folie Kammern in einem Rotator Rack so eingerichtet, dass bei 20 u/min drehen. Setzen Sie die Hybridisierung Kammer in einem Ofen und führen Sie die Hybridisierung bei 65 ° C für 24 oder 40 h entsprechend dem Microarray-Format verwendet.
  6. Microarray Wasch- und Scannen
    1. Nehmen Sie Hybridisierung Kammer aus Ofen und Tauchen Sie es in Waschpuffer 1. Fahren Sie mit der Demontage.
    2. Entfernen der Microarray-Folie und schnell in eine Folie Rack in Waschpuffer 1 bei Raumtemperatur.
    3. Waschen Sie die Array-Folie für 5 min. unter Rühren (mit einem Flohmarkt und ein Magnetrührer). Passen Sie die Rührer Geschwindigkeit eine Einstellung von 4 (mittlere Geschwindigkeit), zu gut, aber nicht zu kräftig mischen.
    4. Waschen Sie die Array-Folie in Waschpuffer 2 für 90 s rühren. Vorsichtig die Folie aus dem Puffer (es sollte trocken entstehen) erholen und laden Sie sie in einen Diahalter mit Hilfe der Folie Beschützer.
    5. Laden Sie die Folie in den Array-Scanner und Scannen nach der Auswahl des Herstellers.
    6. Analysieren Sie die Ergebnisse mit Hilfe der Extraktionssoftware mit dem Scanner im Einsatz nach Herstellerangaben (V.9.1.3.1) zur Verfügung gestellt.

(3) WES Protokoll

  1. Ziel-Anreicherung
    1. Verwenden Sie DsDNA BR-Test zur Bestimmung der Konzentration der gDNA Probe nach dem Instrument-Protokoll.
    2. Verdünnen Sie 5 µg von qualitativ hochwertigen Doppelstrang DNA mit 1 x Low-TE-Puffer in einem 1,5 mL niedrig Bind Rohr in einem Gesamtvolumen von 50 µL.
    3. Richten Sie eine Sonikator und setzen ein Reaktionscup in der Be- und Entladung Station nach Anweisungen des Herstellers. Die Kappe auf dem Rohr.
    4. Übertragen Sie langsam 50 µl DNA-Probe durch die Pre-split Septen ohne Luftblasen einzuführen.
    5. Scheren Sie die DNA gemäß den Einstellungen aus dem Sonikator Hersteller vorgeschlagen und beurteilen Sie Qualität mit einem Bioanalyzer entsprechend Anleitungen des Herstellers zu. Die Ziel DNA-Fragmentgröße ist 150 bis 200 bp.
  2. Reparatur von DNA endet
    1. Bereiten Sie das Ende Reparatur Reaktion Mischung durch Mischen von 40 µL Ende-Reparatur-Enzym-Mix mit 10 µL Ende Reparatur Oligo-Mix. Mischen Sie gut auf einem Vortex-Mixer.
    2. Die Proben bei 20 ° C für 30 min in einem Thermocycler brüten und dann bei 4 ° c zu halten Verwenden Sie einen beheizte Deckel nicht.
    3. Fügen Sie 50 µL der Ende Reparatur Reaktion Mischung vorbereitet im Schritt 3.2.1 zu jeweils 50 µL DNA-Probe auch geschoren. Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter oder sanft aufschütteln.
    4. Reinigen Sie die Probe mit einem Perlen basierte Reinigung Kit nach Hersteller-Protokoll.
  3. Polyadenylation 3' enden.
    1. Jedes Ende repariert, gereinigte DNA-Probe (ca. 20 µL) 20 µl des dA-Tailing Master Mix hinzufügen.
    2. Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter oder sanft aufschütteln.
    3. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C in einem Thermocycler und halten Sie es bei 4 ° C. Verwenden Sie einen beheizte Deckel nicht.
  4. Unterbindung des Pre-Capture-Indizierung-Adapters.
    1. Jedes A-angebundene DNA-Probe 5 µL Ligation Master Mix hinzufügen.
    2. Jede Probe 5 µL der entsprechenden Pre-Capture-Index-Lösung hinzufügen.
    3. Die Brunnen zu versiegeln und mischen durch Vortexen für 5 kurz Zentrifuge der Proben s..
    4. Inkubieren Sie die Proben bei 20 ° C für 15 min in einem Thermocycler und halten Sie dann bei 4 ° C. Verwenden Sie einen beheizte Deckel nicht.
    5. Reinigen Sie die Proben mit einem Perlen basierte Reinigung Kit nach Hersteller-Protokoll.
  5. Verstärkung der indizierten Bibliothek.
    1. Bereiten Sie das entsprechende Volumen der Pre-Capture PCR Reaktion Mischung durch Mischen von 1 µL Primer-Mix und 25 µL des PCR Master Mix. Mischen Sie gut auf einem Vortex-Mixer.
    2. Kombinieren Sie 26 µL der Verstärkung Mischung in separaten Brunnen einer PCR-Platte und 24 µL jeder indizierte gDNA Bibliothek Probe.
    3. Führen Sie ein PCR-Programm mit den folgenden Schritten: 98 ° C für 2 min, 5 Zyklen bei 98 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 min. halten die Proben bei 4 ° C.
    4. Reinigen Sie die Probe mit einem Perlen basierte Reinigung Kit nach Hersteller-Protokoll.
    5. Qualität mit einem Bioanalyzer nach Hersteller-Protokoll zu bewerten.
  6. Bündelung von indizierten DNA-Proben für die Hybridisierung
    1. Kombinieren Sie für jede Aufnahme Reaktion Pool das entsprechende Volumen jeder indizierte gDNA Bibliothek Probe in einen Brunnen einer PCR-Platte. Kombinieren Sie zum Beispiel für Mensch oder Maus alle Exon erfassen Bibliotheken, 8 Bibliotheken pro Pool mit 187,5 ng jeder indizierten Bibliothek. Sicherstellen, dass jeder endgültigen Aufnahme Reaktion Pool 1.500 enthält ng der indizierten gDNA.
    2. Reduzieren Sie die Lautstärke in jedem gut zu < 7 µL mit einem Vakuum Konzentrator. Vermeiden Sie die Probe vollständig trocknen.
    3. Jeder konzentrierte gDNA Pool gut Endvolumen bringen 7 µL und dann Wirbel die Platte mit gDNA kräftig für 30 S. Zentrifuge in einer Zentrifuge oder Mini-Platte Spinner die Flüssigkeit an der Unterseite der Brunnen sammeln fügen Sie ausreichendes Nuklease-freies Wasser hinzu.
  7. Hybridisierung von gDNA-Bibliothek-Pools in die Bibliothek aufnehmen
    1. Jede 7 µL indiziert gDNA Pool fügen Sie 9 µl Mix zu blockieren hinzu. Pipette rauf und runter um zu mischen.
    2. Kappe die Brunnen, übertragen die versiegelte Platte mit gDNA zu den Thermocycler und bei 95 ° C für 5 min inkubieren, dann halten sie bei 65 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Platte bei 65 ° C für mindestens 5 min gehalten wird.
    3. Bereiten Sie die entsprechende Verdünnung der RNase-Block, aufgrund der Größe der Aufnahme Bibliothek (10 % Verdünnung für Bibliotheken < 3.0 Mb und 25 % Verdünnung für Bibliotheken > 3,0 Mb).
    4. Entsprechend der Größe erfassen Bibliothek kombinieren Sie die korrekte Menge der Bibliothek zu erfassen und verdünnen Sie RNase-Block-Lösung in einer PCR-Platte auf Eis gehalten. Mischen Sie gut durch pipettieren. Für die Erfassung Bibliotheken < 3,0 Mb, verwenden Sie 2 µl der Bibliothek und 5 µL RNase-Block bei 10 % Verdünnung. Für die Erfassung Bibliotheken > 3,0 Mb, Verwendung 5 µl der Bibliothek und 2 µl RNase-Block bei 25 % Verdünnung.
    5. Fügen Sie 37 µL Hybridisierung Puffer in jede Vertiefung mit 7 µL erfassen Bibliothek/RNase Block-Mix. Mischen Sie gut durch pipettieren und kurz Zentrifugieren Sie die Platte mit der Mischung.
    6. Pflegen Sie die gDNA-Pool-Platte bei 65 ° C während der Verwendung einer Multi-Kanal-Pipette übertragen die gesamte 44 µL erfassen Bibliothek Mischung aus Schritt 3.7.5 zu jeder Probe gut der gDNA Pool Platte. Mischen Sie gut durch Pipettieren langsam auf und ab 8 bis 10 Mal.
    7. Verschließen Sie der Brunnen mit gewölbten Streifen Kappen. Stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen vollständig abgedichtet sind. Legen Sie eine Komprimierung-Matte über die PCR-Platte in den Thermocycler.
    8. Inkubieren Sie die Hybridisierung Mischung für 24 h bei 65 ° c Hinweis: Proben können bis zu 72 h hybridisiert werden, sondern müssen sicherstellen, dass die erweiterte Hybridisierung keine umfangreichen Verdunstung in der Probe Brunnen verursacht.
  8. Vorbereitung von Streptavidin beschichteten magnetische beads
    1. Prewarm Waschpuffer 2 bei 65 ° C in einem Wasser-Bad oder Hitze-Block.
    2. Energisch Aufschwemmen der Streptavidin magnetische Beads auf einem Vortex-Mixer. Die magnetische Beads Regeln während der Lagerung.
    3. Fügen Sie für jede Probe Hybridisierung 50 µL der resuspendierte Perlen in Vertiefungen eine PCR-Platte hinzu.
    4. Waschen Sie die Perlen und aufzuwirbeln Sie ihnen in 200 µL Binding Buffer.
  9. Erfassen der hybridisierten DNA mit Streptavidin-Perlen.
    1. Schätzen Sie und notieren Sie das Volumen der Hybridisierung-Lösung, die nach 24 h Inkubation bleibt.
    2. Pflegen Sie die Hybridisierung Platte bei 65 ° C und mit einer Mehrkanal-Pipette das gesamte Volumen (ca. 60 µL) übertragen jedes Hybridisierung-Mischung in die Platte Vertiefungen mit 200 µL der gewaschenen Streptavidin Perlen. Mischen Sie gut durch Pipettieren langsam nach oben und unten 3 bis 5 Mal.
    3. Verschließe die Brunnen und die Capture-Platte auf einem Nutator Mixer oder Äquivalent für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Sicherstellen Sie, dass die Proben richtig in den Vertiefungen mischen.
    4. Zentrifugieren Sie kurz die Capture-Platte in einer Zentrifuge oder Mini-Platte Spinner.
    5. Setzen Sie die Capture-Platte in einem Magnetabscheider, die Perlen aus der Suspension zu sammeln. Entfernen und entsorgen des Überstands.
    6. Die Perlen in 200 µL Waschpuffer 1 aufzuwirbeln. Mischen von Pipettieren rauf und runter, bis die Perlen voll Nukleinsäuretablette sind.
    7. Zentrifugieren Sie kurz in einer Zentrifuge oder Mini-Platte Spinner.
    8. Legen Sie die Platte in den Magnetabscheider.
    9. Warten Sie, bis die Lösung klar, dann entfernen und entsorgen des Überstands.
  10. Post-erfassen Sie Probe Verarbeitung für Multiplex-Sequenzierung
    1. Bereiten Sie das entsprechende Volumen der PCR Reaktionsgemisch durch Mischen Folgendes: 9 µL Nuklease-freies Wasser, 25 µL Master Mix und 1 µL Grundierung mischen nach der Anzahl der Verstärkungen. Mischen Sie gut mit einem Vortex-Mixer und halten Sie auf dem Eis.
    2. Für jede Reaktion Verstärkung Platz 35 µL des PCR Reaktionsgemisches ab Schritt 3.10.1 in den Vertiefungen der eine PCR-Platte.
    3. Jede Pipette der Wulst-gebundenen Gefangenen Bibliothek Pool Proben rauf und runter, um sicherzustellen, dass die Perle Suspension homogen ist.
    4. Das entsprechende PCR Reaktionsgemisch gut 15 µL jeder erfassten Bibliothek Pool Wulst Suspension hinzufügen. Mischen von pipettieren, bis die Wulst Suspension homogen ist.
    5. Die Platte vorbereitet in Ziffer 3.10.2 in einem Thermocycler und führen Sie das folgende PCR Verstärkung Programm: 98 ° C für 2 min, 8 bis 11 Zyklen bei 98 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min, gefolgt von eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 Minuten. Halten Sie die Proben bei 4 ° C.
    6. Reinigen Sie die Probe mit einem Perlen basierte Reinigung nach Hersteller-Protokoll.
    7. Qualität mit einem Bioanalyzer nach Hersteller-Protokoll zu bewerten.
  11. Bereiten Sie Proben für Multiplex-Sequenzierung vor
    Hinweis: Die endgültige angereicherten Proben enthalten entweder 8 oder 16 indizierten Bibliotheken, basierend auf der Größe der Bibliothek zu erfassen und daraus resultierenden Bündelung Strategie Pre-Capture-Pools. Die Gesamtzahl der indizierten Bibliotheken, die in einer einzigen Sequenzierung Gasse gemultiplext werden kann richtet sich nach der Output-Spezifikationen der Plattform zusammen mit der Sequenzierung erforderliche Datenmenge für die Capture-Bibliothek verwendet.
    1. Berechnen Sie die Anzahl der Indizes, die pro Bahn, kombiniert werden können, entsprechend der Kapazität der Plattform. Die Gesamtzahl der indizierten Bibliotheken, die in einer einzigen Sequenzierung Gasse gemultiplext werden kann richtet sich nach der Output-Spezifikationen der Plattform zusammen mit der Sequenzierung erforderliche Datenmenge für die Capture-Bibliothek verwendet. Z. B. für die menschlichen alle Exon-v5-Bibliothek, die empfohlene Sequenzierung Daten pro Bibliothek indiziert ist 4 Gb und die empfohlen Sequenzierung Daten pro Pre-Capture-Pool 32 Gb (8-Index-Pools).
  12. Reihenfolge der Bibliotheken.
    1. Laden der Bibliotheken auf die Plattform der nächsten Generation Sequenzierung der Wahl und führen Sie die Sequenzierung laufen nach den Vorgaben des Instruments.
  13. Exome Sequenzierungsdaten analysieren.
    1. Führen Sie die Pipeline und die Software der Wahl für base telefonieren. Z. B. Stampy Karte liest20, entfernen von Duplikaten mit Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) und Einzel-Nukleotid-Polymorphismen und einfügen oder Löschen von Basen (Indels) mit Platypus21zu identifizieren. Synonym für Varianten und den beobachteten bei einem Allel-Frequenz zu filtern < 5 % und Vergleichsdaten mit denen von elterlichen Exomes, de Novo Varianten zu identifizieren.

(4) Plasmid DNA-Vorbereitung In Utero Elektroporation

  1. Entwerfen Sie mehrere kurze Haarnadel RNAs (ShRNAs) Ausrichtung auf die kodierende Sequenz oder der 3' UTR von Kandidatengenen bereits22beschrieben.
  2. Zur Vermeidung vom Zielwert testen Effekte ShRNAs Spezifität von BLAST-Suche gegen Datenbanken mit Standardmethoden. Schließen Sie Anzeigen von mehr als 50 % der Komplementarität mit anderen Genen Ratte ShRNAs aus.
  3. Zuvor beschriebenen Klon geglüht Oligonukleotide in einen mU6-Pro Vektor als23.
  4. Reinigen Sie Plasmid DNA mit einem Maxi-Prep gemäß Anweisungen des Herstellers zu und machen Sie eine Endkonzentration von 3 µg/µL.
  5. Aliquoten 20 µl DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP entweder alleine oder mit 1,5 mg/ml der ShRNA konstruieren) und fügen Sie 2 µL schnell grüne Farbstoff (2 mg/mL), ermöglichen eine visuelle Überwachung der Injektion.

5. in Utero Elektroporation

  1. Chirurgischer Eingriff
    1. E15.5 schwangere weibliche Ratten (E0 wurde definiert als Tag der Bestätigung der Sperma-positiven vaginalen Stecker), mit einer Kombination mit einer Mischung von Ketamin/Xylazin zu betäuben (0,1 und 0,01 mg pro Körper Gewicht, beziehungsweise), die über eine intraperitoneale gegeben ist Injektion für Betäubungsmittel Induktion.
    2. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem man beobachtet, das Verschwinden der Zehe Prise Reflex.
    3. Rasieren des Tieres Unterbauch mit einer Haarschneidemaschine um das Fell zu entfernen. Desinfizieren Sie die Haut mit Peelings von Povidon-Jod und 70 % Alkohol. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während unter Narkose zu verhindern.
    4. Das Tier auf einer Wärmequelle legen Sie und ein steriles Tuch (bei offenem Fenster von 4-5 cm in der Mitte) über die Schnitt-Website. Gesichtsmasken, Laborkittel, Kappen und sterile OP-Handschuhe zu tragen. Pflegen Sie Sterilität bis zum Ende der Operation.
    5. Mit scharfen Schere zu machen einen vertikalen Schnitt (2-2,5 cm) in der Haut entlang der Mittellinie in den kaudalen Bauch und dann einen Schnitt von der Muskelwand unter der Haut – auch von 2,5 cm – entlang der Mittellinie.
    6. Setzen Sie sorgfältig eine uterine Horn aus der Bauchhöhle. Drop-37 ° C vorgewärmte normale Kochsalzlösung um die Embryonen zu befeuchten. Halten Sie die Gebärmutter feucht aller Zeiten.
  2. Injektion von DNA und Elektroporation
    1. Halten Sie eines uterinen Hörner sanft mit geringelten Zange und drücken Sie vorsichtig ein Embryo in der Gebärmutterwand. Halten den Embryo in der einen Hand und mit der anderen Hand vorsichtig Glaskapillaren 1 mm von der Mittellinie in den linken seitlichen Ventrikel (ca. 2-3 mm tief) und Spritzen ca. 1 µL DNA mit schnell grün zur visuellen Überwachung der Injektion mit einem Microinjector.
    2. Fallen Sie normale Kochsalzlösung auf die 3 x 7 mm2 Elektroden Oberfläche. Legen Sie die sterile positive Elektrode auf der injizierten Seite (linke seitliche Ventrikel) und die negative Elektrode steril auf der rechten Herzkammer. Liefern Sie 5 elektrische Impulse in 950 ms Abständen mit einem Fuß-gesteuerte Pedal (4000 mF Kondensator aufgeladen bis 40 V mit einem Electroporator).
  3. Post-Elektroporation-Verfahren
    1. Setzen Sie wieder in den Bauchraum uterine Hörner, Tropfen von normalen Kochsalzlösung in die Kavität positioniert natürlich mehr Embryonen ermöglichen und intraoperative Flüssigkeitsverlust zu berücksichtigen.
    2. Schließen der Bauchmuskel-Wand mit resorbierbaren chirurgisches Nahtmaterial, dann die Haut mit einem Stich einfach unterbrochen.
    3. Setzen Sie die Ratte zurück in den Käfig und überwachen Sie das Tier zu, bis es aus der Narkose entsteht.
    4. Verwalten Sie für die Schmerztherapie Buprenorphin (0,03 mg/kg), das Tier durch eine subkutane Injektion alle 8-12 h, für bis zu 48 h.

(6) Gehirn Probenvorbereitung

  1. Befestigungsmethode
    1. Die schwangere Ratte 5 Tage nach dem chirurgischen Eingriff Gas Betäubung (Isofluran) gefolgt von einer schnellen zervikale Dislokation zu opfern.
    2. Machen Sie einen vertikalen Schnitt die Bauchhöhle wieder zu öffnen.
    3. Entlarven die uterine Hörner, die Embryonen aus der Gebärmutter zu entfernen und Enthaupten sie mit einer scharfen Schere.
    4. Das Gehirn mit minimaler Beschädigung des Gewebes zu entfernen: mit einer scharfen Schere, machen einen kleinen Schnitt entlang der hinteren (Kleinhirn) / anterior (Geruchs-Glühbirnen) Achse des Kopfes zu durchbohren die Haut und der Schädel, dann mit einer Zange abziehen des Schädels aussetzen der Gehirn Sie und entfernen Sie ihn mit einem kleinen Spatel.
    5. Tauchen Gehirn über Nacht bei 4 ° C in einem 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat Buffered Saline (PBS).
  2. Gehirn-Schnitt
    1. Waschen Sie Gehirn mit 1 X PBS-Puffer für 10 min.
    2. Betten Sie Gehirne in 4 % Agar in Kunststoff Formen einbetten ein.
      1. Bereiten Sie 50 mL 4 % Agar mit 1 X PBS-Puffer für die Einbettung von 5 embryonaler Gehirns vor. Sicherzustellen, dass die gelösten Agarose bei nicht mehr als 50 ° C.
    3. Behalten Sie Gehirn im Agarose für mindestens 1 h bei 4 ° c polymerisieren Entfernen Sie überschüssige Agarose um das Gehirn herum.
    4. Kleben Sie das Gehirn der Vibratome Grundplatte orientiert, so ist die vordere/hintere Achse des Gehirns senkrecht an der Klinge. Warten Sie einige Minuten, bis der Kleber trocknen und legen Sie die Platte mit dem geklebten Gehirn in der Vibratome Kammer.
    5. 1 X PBS der Vibratome einfüllen. Schneiden Sie 100 µm dicke Abschnitte in Scheiben.
    6. Transfer Gehirnscheiben auf Folien, überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, fügen Sie ein paar Tropfen Eindeckmittel und platzieren Sie ein Deckglas auf Gehirne

(7) confocal Imaging und Quantitative Analyse

  1. Lassen Sie den Einbau mittlere trocknen über Nacht zuvor imaging. Bildausschnitte bei 10 X am konfokale Laserscanning-Mikroskop.
  2. Mit Software für quantitative Bildanalyse, konvertieren Sie das Bild in 8-Bit, wählen Sie eine repräsentative GFP positive Fluoreszenz Zelle und definieren Sie seine Form manuell zu. Dazu klicken Sie auf "Schätzung" und zeichnen Sie den Rand der Zelle mit der Freihand-Auswahl-Werkzeug. Dabei werden Art und Weise der Durchmesser und Intensität Schwelle der Zelle automatisch von der Software beibehalten.
  3. Klicken Sie auf "Find Zellen" damit die Software transfizierte Zellen während der Hirnrinde zu lokalisieren. Dann bei Bedarf manuell entfernen Sie Fehlalarme.
  4. Teilen Sie die ganze Dicke der Rinde in 8 Bereiche von Interesse normalisiert in einzelne Abschnitte auf. Um dies zu erreichen, klicken Sie auf "Werkzeug", wählen Sie 8 "Region Streifen" wo der erste (1) und die letzte (8) Streifen entsprechen der VZ und an die Spitze der CP bzw.. Klicken Sie auf "Übernehmen", damit die Software, die relative Position der GFP transfizierten Zellen in der gesamten Hirnrinde zu zählen. Klicken Sie auf "Speichern Quantifizierung" Exportieren von Daten in eine Excel-Datei für die Analyse.

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Ergebnisse

Die experimentelle Strategie entwickelt, um neuartige MCD verursachenden Gene zu identifizieren ist in Abbildung 1zusammengefasst.

Durch Ausführen der Array-CGH in einer Kohorte von 155 Patienten mit Entwicklungsstörungen Gehirn Anomalien variabel kombinieren PNH (Abbildung 2A), Dysgenesie des Corpus Callosum, Colpocephaly, zerebelläre Hypoplasie und Polymicrogyria Zusammenhang mit Epilepsie, At...

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Diskussion

MCDs sind wichtige Ursachen für geistige Behinderung und für 20-40 % von Medikamenten-resistenten Kindheit Epilepsie1,2. Interesse an MCDs hat im letzten Jahrzehnt durch zwei wesentliche Faktoren drastisch zugenommen. Die erste ist die Verbesserung der bildgebenden (besonders MRI), wodurch Sie Ärzte und Wissenschaftler viele Hirnfehlbildungen zu visualisieren, die zuvor nicht erkannt wurden. Die andere ist die Entwicklung der genetischen Werkzeuge, die die Identi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei Dr. G. McGillivray, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, PR. d. h. Scheffer, Pr. S.P. Roberston, Pr. J. Clayton-Smith und PR s.f. Berkovic für die Bereitstellung von MCD-Patienten. Wir danken Dr. F. Michel und D. Mei für technische Beratung und Hilfe. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel aus dem sieben Rahmenprogramm der EU, Wunsch-Projekt, Vertragsnummer: Gesundheit-F2-602531-2013 (zu V.C, r.g., A.R, A.F. und c.c.), INSERM (zum A.R und c.c.), Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA, A.F, E.P.P und C.C) und Région Provence-Alpes-Côte d ' Azur (APO2014 - DEMOTISCHE, c.c. und A.A.D). D.A.K ist ein EMBO Young Investigator und wird unterstützt vom FWF gewährt (I914 und P24367).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Picospritzer IIIParker Hannifin CorpP/N 051-0500-900Intrazelluläre Mikroinjektions-Dosiersysteme
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252Fast Green ermöglichen die visuelle Überwachung der Injektion
BTX ECM 830 ElektroporatorBTX Harvard Apparatus45-0002Der ECM 830 ist ein Rechteck-Impulsgenerator, der für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen
entwickelt wurdeMikrotom HM 650 VMicrom10076838Mikrotom HM 650 V Vibratom 240V 50/60Hz mit vibrierender Klinge
FluoView 300OlympusDas Olympus FluoViewTM 300 ist ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit Punktabtastung, das für Anwendungen in der biologischen Forschung entwickelt wurde
eCELLence SoftwareGlance Vision TechnologieseCELLence ist eine Software für die quantitative Analyse der Zellmigration
Agilent Microarray Scanner BundleArray-Objektträger
für 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K oder 8 x 15KAgilentAgilent p/n G4900DA, G2565CA oder G2565BA
für 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K oder 8 x 60KAgilentAgilent p/n G4900DA oder G2565CA
Hybridisierungskammer, rostfreiAgilentAgilent p/n G2534AKammer für Array-CGH-Hybridisierung
Hybridisierung Kammerdichtungsschieber, 5er-PackDichtung für Array CGH-Hybridisierung
für 1K-Microarrays oderAgilentAgilent p/n G2534-60003
für 2er-Pack Microarrays oderAgilentAgilent p/n G2534-60002
für 4er-Pack Microarrays oderAgilentAgilent p/n G2534-60011
für 8erPack MicroarraysAgilentAgilent p/n G2534-60014
Hybridisierungs-OfenAgilentAgilent p/n G2545A
Hybridisierungs-Ofenrotator für Agilent Microarray HybridisierungskammernAgilentAgilent p/n G2530-60029
Thermocycler mit beheiztem DeckelAgilentAgilent p/n G8800A oder gleichwertigTermal-Cycler für Inkubationen
1,5 mL RNase-freies Mikrofuge-RöhrchenAmbionp/n AM12400 oder gleichwertigMikrozentrifuge
Magnetischer RührstabCorningp/n 401435 oder gleichwertigGerät zum Rühren
Qubit FluorometerLife Technologiesp/n Q32857Instrument zur DNA-Quantifizierung
Qubit dsDNA BR Assay Kit, zur Verwendung mit dem Qubit FluorometerInvitrogenp/n Q32850Kit für Qubit Fluorometer
UV-VIS SpektralphotometerThermo ScientificNanoDrop 8000 oder 2000 oder gleichwertigInstrument für die DNA-Quantifizierung
P10, P20, P200 und P1000 PipettenPipetman oder gleichwertigDNA-Dispensation
VakuumkonzentratorThermo Scientificp/n DNA120-115 oder
gleichwertig		Gerät zur Konzentration
von DNA SureTag Complete DNA Labeling KitAgilentp/n 5190-4240DNA-Markierungskit (für menschliche Proben)
Aufreinigungssäulen (50 Einheiten)Agilentp/n 5190-3391 DNA-Markierungskit(für menschliche Proben)
AutoScreen A, 96-Well-PlattenGE Healthcarep/n 25-9005-98DNA-Markierungskit (für menschliche Proben)
GenElute PCR Clean-Up KitSigma-Aldrichp/n NA1020DNA-Markierungskit (für menschliche Proben)
Humangenom DNAp/n G1521DNA-Markierungskit (für menschliche Proben)
Für CGH-Microarrays:Promega(weiblich) oder p/n G1471 (männlich)Array CGH-Kontroll-DNA
Für CGH+SNP-Microarrays:Coriellp/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 oder NA18579Array CGH-Kontroll-DNA-Oligo
aCGH/ChIP-on-Chip-Waschpuffer-Kit oderAgilentp/n 5188-5226Array CGH-Hybridisierung und -Waschung
Oligo aCGH/ChIP-on-Chip-Waschpuffer 1 undAgilentp/n 5188-5221Array CGH-Hybridisierung und -Waschung
Oligo aCGH/ChIP-on-Chip-Waschpuffer 2Agilentp/n 5188-5222Array CGH-Hybridisierung und Waschen
Stabilisierungs- und TrocknungslösungAgilentp/n 5185-5979Array CGH-Hybridisierung und Waschen
Oligo aCGH/ChIP-on-Chip-HybridisierungskitAgilentArt.-Nr. 5188-5220 (25) oder Art.-Nr. 5188-5380 (100)Array CGH-Hybridisierung und -Waschung
Human Cot-1 DNAAgilent Art.-Nr. 5190-3393 Array-CGH-Hybridisierungund -Waschung
Agilent C-ScannerAgilentScanner für Array-CGH-Objektträger
SureSelect XT2 Reagenzien-KitKit für die Zielanreicherung
HiSeq-Plattform (HSQ), 16 ProbenAgilentArt.-Nr. G9621A
HiSeq-Plattform (HSQ), 96 ProbenAgilentp/n G9621B
HiSeq-Plattform (HSQ), 480 ProbenAgilentp/n G9621C
MiSeq-Plattform (MSQ), 16 ProbenAgilentp/n G9622A
MiSeq-Plattform (MSQ), 96 ProbenAgilentp/n G9622B
MiSeq-Plattform (MSQ), 480 ProbenAgilentp/n G9622C
DNA 1000 KitAgilentp/n 5067-1504Kit für die Trennung, Größenbestimmung und Quantifizierung von dsDNA-Fragmenten von 25 bis 1000 bp.
Hochempfindliches DNA-KitAgilentp/n 5067-4626Kit für die Analyse von fragmentierter DNA oder DNA-Bibliotheken.
AMPure XP KitKit für die automatisierte PCR-Aufreinigung.
5 mLAgencourtp/n A63880
60 mLAgencourtp/n A63881
450 mLAgencourtp/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Isolierung und Handhabung von biotinylierten Nukleinsäuren
2 mLLife TechnologiesCat #65601
10 mLLife TechnologiesCat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, für das Qubit FluorometerDNA-Quantifizierung
100 Assays, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32850
500 Assays, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32853
Qubit Assay-RöhrchenLife Technologiesp/n Q32856DNA-Quantifizierung
SureSelec tXT2 Capture LibrariesAgilentje nach ExperimentKit für die Erfassung von Bibliotheken
SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8800ADNA-Amplifikation
96-Well-Plattenmodul für SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8810ADNA-Amplifikation
SureCycler 8800-kompatible 96-Well-PlattenAgilentp/n 410088 DNA-Amplifikation
Optischer Streifen VerschlüsseAgilentp/n 401425 DNA-Amplifikation
Röhrchen-Kappenstreifen, gewölbtAgilentp/n 410096 DNA-Amplifikation
KompressionsmattenAgilentp/n 410187 DNA-Amplifikation
2100 Bioanalyzer Laptop BundleAgilentp/n G2943CA DNA-Amplifikation
2100 Bioanalysator Elektrophorese-SetAgilentp/n G2947CADNA-Amplifikation
Covaris Probenvorbereitungssystem, E-Serie oder S-SerieCovarisDNA-Scherung
Covaris Probenhalterp/n 520078DNA-Scherung
Nutator PlattenmischerBD Diagnosticsp/n 421105 oder gleichwertigPlattenmischer
GaIIxIlluminaSequenziermaschine der nächsten Generation

Referenzen

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Kortikale Entwicklungneuronale Migrationperiventrikuläre noduläre HeterotopieC6orf70-GenKonfokalmikroskopiequantitative PCR
Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren
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