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Methodenartikel

Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung

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DOI:

10.3791/53576

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31. März 2016

 ,  ,  ,  , 
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Verfahren führt langanhaltende in vivo intrazelluläre Aufnahmen von einzelnen Neuronen während physiologisch relevanten Hirnzustände und nach der vollständigen Abschaffung der laufenden elektrischen Aktivitäten, in einem isoelektrischen Zustand des Gehirns führt. Die physiologischen Konstanten des Tieres während des Übergangs zur künstlichen komatösen Zustand sorgfältig überwacht.

Zusammenfassung

Die Art und Weise Neuronen Prozessinformationen hängt sowohl von ihrer intrinsischen Membraneigenschaften und auf die Dynamik des afferenten synaptischen Netzwerkes. Insbesondere endogen erzeugten Netzwerkaktivität, die in Abhängigkeit von dem Zustand der Wachsamkeit stark variiert, moduliert signifikant neuronale Berechnung. Um zu untersuchen , wie verschiedene spontane Hirn Dynamik einzelner Neuronen "integrative Eigenschaften auswirken, entwickelten wir eine neue experimentelle Strategie bei der Ratte die darin besteht, mittels einer systemischen Injektion einer hohen Dosis von Natrium - Pentobarbital in vivo alle Hirnaktivität zu unterdrücken. Cortical Aktivitäten kontinuierlich durch kombinierte Elektrokortikogramm überwacht (ECoG) und intrazelluläre Aufnahmen werden zunehmend verlangsamt, zu einem stetigen isoelektrischen Profil führt. Diese extreme Gehirnzustand, die Ratte in einen tiefen komatösen setzen, wurde durch Messen der physiologischen Konstanten des Tieres während des gesamten Experiments sorgfältig überwacht. intrazellulärer recordings erlaubt es uns, die integrative Eigenschaften des gleichen Neuron in physiologisch relevanten kortikalen Dynamik, wie sie in den Schlaf-Wach-Zyklus, und wenn das Gehirn war völlig still begegnet eingebettet zu charakterisieren und zu vergleichen.

Einleitung

In Abwesenheit von irgendwelchen Umweltreize oder Verhaltens Aufgaben erzeugt der "Ruhe" brain einen kontinuierlichen Strom der elektrischen Aktivität, die von der Kopfhaut aufgenommen werden kann, wie elektroenzephalographischen (EEG) Wellen. Die intrazelluläre Korrelat dieser endogenen Hirnaktivität wird durch Hintergrundmembranspannungsschwankungen (auch bekannt als "synaptischen Rauschen") aus, die aus einer Kombination von erregenden und hemmenden synaptischen Potentiale zusammengesetzt sind, die die laufende Tätigkeit der zuführenden Netzwerke 1,2 reflektieren. Diese spontane Aktivität variiert in Frequenz und Amplitude mit den verschiedenen Staaten der Wachsamkeit. Die Aufklärung , die Auswirkungen der Netzwerkaktivität auf der Erregbarkeit und Ansprechbarkeit einzelner Neuronen ist eine der großen Herausforderungen der Neurowissenschaften 3,4.

Viele experimentelle und theoretische Studien haben die funktionellen Auswirkungen der laufenden synaptische Aktivität auf dem integrativen propertie erforschts von Neuronen. die Rolle der verschiedenen neuronalen Parameter durch das Hintergrundrauschen beeinflusst synaptic bleibt jedoch unklar. Zum Beispiel hat sich die mittlere Ebene der Membrandepolarisierung wurde positiv oder negativ 5,6 7-9 korreliert mit der Fähigkeit der sensorischen Input auslösen Aktionspotentiale gefunden. Außerdem, während einige Untersuchungen legen nahe , dass Schwankungen des Membranpotentials, die sich aus einem kontinuierlich von afferenten synaptischen Eingaben variierenden Strom, stark das Ansprechverhalten der einzelnen Neuronen beeinflussen , indem die Verstärkung ihrer Eingangs-Ausgangs - Beziehung Modulieren 3,10-13, andere zeigen , daß Änderungen in der Leitfähigkeit Membran Eingabe durch Rangier- Hemmung vermittelt sind ausreichend , um die neuronale Verstärkung unabhängig von der Größe der Membranschwankungen 14,15 zu modulieren. Schließlich auf wach Tieren durchgeführt jüngsten Studien betont, wie die Verarbeitung von Sinnesinformationen in einzelnen Neurons, hängt entscheidend von dem Zustand der Wachsamkeit einnd die aktuelle Verhaltens Nachfrage 16,17.

Eine einfache Strategie, um die funktionelle Rolle eines gegebenen Prozesses in einer stark vernetzten System zu erläutern ist, um zu bestimmen, wie seine Abwesenheit spezifisch die Funktion des Systems verändert. Diese Methode wurde in der neurowissenschaftlichen Forschung, zum Beispiel unter Verwendung von experimentellen Läsionen oder Inaktivierung von verschiedenen Hirnarealen 18-21 oder pharmakologische Blockade von bestimmten Ionenkanälen 22,23 ausgiebig genutzt. Bemerkenswert ist , wurde in vivo angewendet zu enthüllen , wie funktionelle Konnektivität und Netzwerk - Dynamik 24-27 einzelne Zelle Berechnung beeinflussen. Allerdings lokale Manipulationen bisher soll die Feuern von Neuronen und / oder stören ihre grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften zu blockieren können relativ kleine Gehirne 28 teilweise wirksam und begrenzt sein.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir einen neuen in vivo experimentellen Ansatz indie Ratte die elektrophysiologischen Eigenschaften von einzelnen Neuronen in einem bestimmten Gehirnzustand, dh eingebettet in einem bestimmten Netzwerk dynamisch, auf diejenigen , die erhalten nach der vollständigen Unterdrückung des gesamten Gehirns synaptische Aktivität 29 aufgezeichnet zu vergleichen. In den Kontrollbedingungen zwei verschiedene könnte kortikalen Dynamik erzeugt werden. Schlaf-like electrocorticographic (ECoG) Muster wurden durch Injektion von moderaten Dosen von Natrium-Pentobarbital induziert. Alternativ schnell ECoG Wellen mit kleiner Amplitude vergleichbar mit der kortikalen Aktivität Wachzustand (Wachartiges Muster) zugrunde liegen könnte durch Injektion von Fentanyl hergestellt werden. Anschließend, während die gleiche ECoG und intrazelluläre Aufnahme aufrechterhalten wird, eine vollständige Silencing des endogenen elektrische Aktivität des Gehirns wurde durch systemische Injektion einer hohen Dosis von Natrium-Pentobarbital erhalten durch isoelektrische ECoG und intrazellulären Aktivitäten gekennzeichnet. Da die Induktion einer solchen extremen komatösen könnte potenziell tödlich FOLGEces auf biologische Funktionen, eine sorgfältige und kontinuierliche Überwachung der physiologischen Variablen war von wesentlicher Bedeutung. Daher folgten wir genau die Herzschlagfrequenz, die endexspiratorische CO 2 -Konzentration (EtCO 2), die O 2 -Sättigung (SpO 2) und die Kerntemperatur der Ratte in den Experimenten.

Wir bewerten einzelne Neuronen Eigenschaften in diesen verschiedenen Zuständen mit scharfen Mikroelektroden, die für lange und stabile Aufnahmen in vivo besonders geeignet sind. Das hier beschriebene Verfahren kann mit anderen elektrophysiologischen und bildgebenden Methoden kombiniert werden und könnte auch auf andere Tiermodelle ausgedehnt werden.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Union (Richtlinie 2010/63 / EU) und genehmigt von der Charles Darwin Ethikkommission für Tierversuche durchgeführt. Wir beschreiben hier das Verfahren, das wir routinemäßig in unserem Labor verwenden, jedoch können die meisten Schritte angepasst werden jeden spezifischen Bedürfnisse angepasst.

1. Chirurgische Vorbereitung

Hinweis: Alle Einschnitt und Druckstellen sollten immer wieder mit einem Lokalanästhetikum (Lidocain oder Bupivacain) infiltriert werden. Das vorliegende Verfahren ist ein Terminal aus, eine aseptische Zubereitung ist, sollten umgesetzt werden, um mehrere Änderungen erforderlich.

  1. Anästhesieren eine Ratte mit Natriumpentobarbital (40 mg / kg) und Ketamin (50 mg / kg) in zwei örtlich getrennten intraperitoneale (IP) Injektionen.
  2. Lassen Sie das Tier in Narkose gehen und immer wieder überprüfen, ob eine chirurgische Ebene der Anästhesie (keine Reaktion auf Zehen Kneifen) erreicht wird. Legen Sie die Ratte auf einem feedback Heizdecke und legen Sie eine rektale Sonde Kerntemperatur um 37 ° C zu halten.
  3. Platzieren eines Katheters in die Bauchhöhle zu erleichtern anschließende Injektion von Anästhetika und zu vermeiden Organe durch wiederholte Nadeleinstiche 30 zu perforieren.
    1. Clip das Haar über eine kleine (~ 2 - 3 mm) Bereich oberhalb einer Region innerhalb der Magen des unteren rechten oder linken Quadranten.
      Hinweis: Enthaarungscreme auch verwendet werden können.
    2. Machen Sie eine 2 - 3 mm Schnitt auf der Haut mit einer scharfen Schere oder einem Skalpell. Mit stumpfen Dissektion, entfernen Fett und Muskelschichten, bis die Bauchhöhle beobachtet wird.
    3. Legen Sie ca. 1 - 2 cm die eines kleinen Katheters in den Hohlraum ein und schließen Sie die Wunde mit chirurgischen Klebstoff.
      (. ZB 2 Französisch - das entspricht 0.043 mm Innendurchmesser): Hinweis : Der Durchmesser und die Gesamtlänge des Katheters sollte minimal sein Totvolumen zu reduzieren. Polyurethan-Schläuche sind am besten geeignet.
    4. Machen Sie eine Schleife und Naht ter Katheter an der Haut es an Ort und Stelle zu sichern.
  4. Installieren Sie einen Trachealtubus Belüftung während der künstlichen Beatmung zu steuern.
    1. Wie für den vorherigen Schritt, bereiten den Bereich von Interesse (1 - 2 cm über die Luftröhre direkt über dem Manubrium), entfernen Sie das Haar und die Haut einzuschneiden.
    2. Blunt die ersten Schichten von Fett und Muskeln zu sezieren, dann die Speicheldrüse zur Seite schieben und die Luftröhre aussetzen, indem Sie vorsichtig die letzte Schicht der Muskeln zu sezieren.
    3. Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe über die Trachea und schieben Sie einen Faden darunter kleine Pinzette. Machen Sie einen Knoten des Chirurgen mit dem Faden, aber nicht eng es noch nicht.
    4. Inzision in die Luftröhre quer zwischen zwei knorpeligen Ringen. Swab Blut in die Trachea, falls vorhanden.
    5. Legen Sie eine Trachealtubus mit dem entsprechenden Durchmesser und ziehen Sie die Knoten des Threads das Rohr stetig zu sichern. Für zusätzliche Stabilität kann der Faden weiter an einem höheren Punkt des Endotrachealtubus angebracht werden.
    6. Suture die Wunde zu schließen oder chirurgische Klammern verwenden. Vermeiden chirurgische Kleber hier, wenn der Trachealtubus wiederverwendet werden soll.
  5. Installieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen und sorgfältig die folgenden physiologischen Variablen überwachen: ECoG, SpO 2, EtCO 2, Herzfrequenz (über ein Elektrokardiogramm, EKG) und Innentemperatur. Monitor ein und stellen diese Variablen eine richtige Tiefe der Anästhesie und physiologischen Zustand zu halten. Insbesondere ergänzen Anästhesie mit einer kleinen Dosis (10 mg / kg) Natrium-Pentobarbital, falls erforderlich.
  6. Bewerben Augensalbe auf beiden Augen Austrocknung zu vermeiden. Clip das Haar auf der Kopfhaut, ein Längsschnitt machen (~ 2 cm) und resect das Bindegewebe über dem Schädel mit einem Skalpell oder einem scharfen Löffel verwenden.
  7. Machen Sie eine kleine (~ 1,5 mm Durchmesser) Kraniotomie über die Region von Interesse mit einem Zahnbohrer.
    Anmerkung: Hier wird das Fass Feld des primären somatosensorischen Kortex gezielte (7 - 8 mm ventral der interauralen Linie, 4.5- 5,5 mm lateral zur Mittellinie 31). Spülen wiederholt Wärme abzuführen.
  8. Seien Sie besonders feinen Pinzette vorsichtig ein kleines Loch in der Dura zu machen. Reservieren Sie sich einen ~ 0,5 mm-Bereich innerhalb der Schädel Trepanation die ECoG-Elektrode zu platzieren (siehe nächster Schritt). Dauerhaft halten die Rinde feucht mit 0,9% NaCl-Lösung (oder künstliche Zerebrospinalflüssigkeit).
  9. Legen Sie eine niedrige Impedanz (~ 60 kOhm) Silberelektrode (die ECoG-Elektrode) auf der Dura, die kortikale Region vermieden wird nicht von den Meningen bedeckt, und legen Sie die Referenzelektrode auf einem Kopfhaut Muskel auf der anderen Seite des Kopfes.
  10. In dieser Phase (30 min nach der letzten Injektion Natriumpentobarbital) Aufrechterhaltung der Anästhesie durch wiederholte Injektionen von Natriumpentobarbital (10-15 mg / kg / h) oder Fentanyl (3-6 ug / kg / h) über den Katheter IP. Erstere führt zu einem langsamen Schwingungs, schlafähnlichen, ECoG Muster während letztere in einem desynchronisierenden Wach-like, kortikale Profil führen.
  11. Stellen Sie die künstliche vLüftungstechnisches System , so dass die Atemfrequenz und das Volumen sind ähnlich denen der spontanen Atmung der Ratte (Normalbereich 70-115 Atem / min 32). Verbinden Sie dann die mechanische Belüftung des Trachealtubus und überprüfen Sie die richtige Brustkorb Inflation (auf beiden Seiten). Falls nicht, stellen Sie die Position des Belüftungsschlauch in der trachealen Achse. Falls erforderlich, saugen die Sekretion in die Trachea mit einem Katheter nach oben mit einer Spritze oder einer Vakuumpumpe.
  12. Wenn alle physiologischen Variablen 32-35 und ECoG 29,36 Muster eine stabile chirurgische Ebene der Anästhesie zu reflektieren, in jedem Schenkel eine intramuskuläre Injektion von Gallamin Triethiodid tun , um die Ratte zu paralysieren, 40 mg / kg für die erste Injektion und dann 20 mg / kg , jede 2hr 19,29,36,50.

2. intrazellulärer Recordings

  1. Ziehen Sie ein Glas-Mikropipette (scharfe Mikroelektrode) mit einem ~ 0,2 & mgr; m Spitze, wie seine Widerstandsbereiche between 50 und 80 MOhm einmal mit 2 M Kaliumacetat (KAc) gefüllt ist.
  2. Platzieren Sie die Pipette in einem bestimmten Halter mit einer Silber / Silberchlorid (Ag / AgCl) Draht, der die Pipettenlösung zu einem intrazellulären Verstärker anschließen (über einen Kopfstufe). Der Halter sollte an einem Mikromanipulator angebracht werden. Legen Sie eine Ag / AgCl-Referenzelektrode auf der Nackenmuskulatur der Ratte.
  3. einfügen langsam die Pipette in das Gehirn bis in die Region von Interesse und überprüfen ihren Widerstand durch Überwachen der Spannung fällt in Reaktion auf Stromstufen. Verwenden Sie die Summen (oder zappen) Taste des Verstärkers mit der Pipette zu löschen, wenn nötig.
  4. Verwenden Sie Wattestäbchen oder synthetischen Absorptionsdreiecke die Kraniotomie trocknen (darauf achten, nicht die ECoG oder intrazelluläre Elektroden zu berühren), bevor sie mit Silikon-Elastomer oder 4% igen Abdeckung Gehirn Bewegungen zu reduzieren.
  5. Senken Sie die Pipette in 1 bis 2 & mgr; m Schritte, bis sein Widerstand zunimmt, wenn eine Zelle nähert. Dann nutzen Sie die Summenfunktion des Verstärkers penetrate in das Neuron.

3. Induce den isoelektrischen Zustand

  1. Führen Sie die entsprechende experimentelle Protokoll (zB Antworten Brennen intrazellulär injizierten Ströme, Strom-Spannungs - Beziehungen, Sinnesreize Antworten) in diesem Stadium , während gleichzeitig das Membranpotential des Neurons Überwachung, die ECoG und die physiologischen Variablen.
  2. Stellen Sie sicher, dass die intrazelluläre Elektrode in der Zelle stabil ist durch die Stetigkeit der Analyse sowohl das Membranpotential und das Aktionspotential Eigenschaften während der Aufnahme-Session. Wenn nicht, gehen Sie nicht auf den nächsten Schritt, und warten Sie, bis die Aufzeichnung wieder stabil wird oder nach einem anderen Neuron suchen.
  3. Spritzen Sie einen hohen, aber infra letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (~ 90 mg / kg, kann so niedrig wie 35 mg / kg von der Pentobarbital ursprünglichen Zustand sein und bis zu 155 mg / kg von der Fentanyl Anfangsbedingung) über die IP-Leitung.
    Hinweis: Innerhalb von 15 bis 20 min die intrazelluläre und ECoG waveforms sollte mit intermittierender elektrischer Schweigen verlangsamen übergangsweise die so genannte "Burst-Unterdrückung" Profil 37,38 zu erreichen, die schrittweise zu einem vollständigen isoelektrischen Zustand zusammenbricht. Es wird erwartet , dass die Herzfrequenz verlangsamt sich deutlich (von ~ 10 - 20%) , aber die SpO 2 und EtCO 2 sollte relativ stabil bleiben.
  4. Wenn der isoelektrischen Zustand nicht erreicht ist, zu injizieren, eine kleine Menge von Natrium-Pentobarbital (~ 10% der Schritt 3.1 Dosis). Warten Sie 15 Minuten vor mehr Betäubung, wenn der isoelektrischen Zustand Zugabe wird noch nicht erreicht.
  5. Wiederholen Sie das Versuchsprotokoll die Auswirkungen der Netzwerk-Dynamik auf dem aufgezeichneten Neurons integrativen Eigenschaften zu vergleichen.
    Hinweis: Nach Beendigung der Narkose Injektionen sollte die elektrische Gehirnaktivität vollständig innerhalb von 3 bis 4 Stunden erholen.
  6. Am Ende des Experiments, injizieren einer letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (200 mg / kg, IP), um die Ratte euthanize.

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Ergebnisse

Induzierende und einen isoelektrischen Zustand des Gehirns die Aufrechterhaltung ist eine heikle in vivo experimentelle Verfahren. Es ist erwiesen , ein mächtiges Werkzeug , um direkt die Auswirkungen der kortikalen Netzwerk - Aktivität auf die neuronale Erregbarkeit und Übertragungsfunktion zu untersuchen 29. Abbildung 1 zeigt die Multiparameter - Überwachung, einschließlich ECoG und vital Konstanten, der den physiologischen Zustand des Tieres vor

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Diskussion

Wir beschreiben hier eine neue Methode in vivo spontanen zerebralen elektrischen Aktivität zu unterdrücken sowohl auf Netzwerk und zellulärer Ebene. Dieses Verfahren führt zu einem extremen Zustand des Gehirns, bekannt als isoelektrischen komatösen 41. Aus klinischer Sicht ein solches electrocerebral Inaktivität ist die schwerste Abnormalität, die auf dem EEG zu sehen ist. Es ist vor allem mit einem irreversiblen Koma, bei allen Patienten in Zusammenhang gebracht , entweder zu sterben oder in einem W...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Fondation de France unterstützt, das Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, der Pierre & Marie Curie Universität und das Programm "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Natrium-Pentobarbital-CentravetPentobarbital-Ketamin
500MerialImalgè ne 500
Fentanyl Janssen-CilagFentanyl
XylocainCentravetXylovet
Gallamine TriethiodidSigmaG8134
ECoG-VerstärkerA-M Systems AC-Verstärker, Modell 1700
Intrazellulärer VerstärkerMolecular DevicesAxoclamp 900A
DatenerfassungsschnittstelleCambridge Electronic DesignCED-Leistung 1401-3 
Datenanalyse-SoftwareCambridge Electronic DesignSpike2 Version 7
MikromanipulatorScientificaIVM-3000
KapillarabzieherNarishigePE-2
Kapillaren aus BorosilikatglasHarvard ApparaturGC150F-10
Silberdraht 0,125 mm (intrazelluläre Aufzeichnung)WPIAGT0525
Ag-AgCl-ReferenzPhymepE242
Silberdraht 0,25 mm (ECoG-Aufzeichnung)WPIAGT1025
BeatmungssystemMinerveAlpha Lab
Überwachung physiologischer ParameterDigicareLifeWindow Lite
HeizdeckeHarvard Apparatus507215
StereomikroskopLeicaM80
SchereFST15005-08
Pinzette Dumont #5FST11295-10
Pinzette Dumont #5SFFST11252-00
IP Polyurethan-Katheter - 0,43x0,69 mm   InstechBTPU-027
Silikon-ElastomerWPIKWIK-CAST
DentalbohrerNSKY1001151 und P496
Chirurgischer Kleber3Mvetbond

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