Dreidimensionale Biomimetic Technologie: Neuartige Biorubber Erzeugt definierte Mikro- und Makro-Skala Architekturen in Collagen Hydrogele

Zusammenfassung

Eine innovative Biofabrikationstechnik wurde entwickelt, um dreidimensionale Konstrukte zu entwickeln, die den architektonischen Merkmalen, Komponenten und mechanischen Eigenschaften von in vivo Gewebe ähneln. Bei dieser Technik wird ein neu entwickeltes Opfermaterial, BSA-Kautschuk, verwendet, das detaillierte räumliche Merkmale überträgt und die In-vivo-Architekturen einer Vielzahl von Geweben reproduziert.

Zusammenfassung

Gewebegerüste spielen eine entscheidende Rolle bei der Geweberegeneration Prozess. Das ideale Gerüst müssen mehrere Anforderungen erfüllen, wie beispielsweise mit richtigen Zusammensetzung, gezielte Modul und gut definierten architektonischen Besonderheiten. Biomaterials, dass die intrinsische Architektur der in vivo Gewebe sind von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung Erkrankungen sowie zur Erleichterung der Regeneration von verloren und fehlerhafte Weichgewebe rekapitulieren. Eine neuartige biofabrication Technik entwickelt, die Stand der Technik Bildgebung kombiniert, dreidimensionale (3D) Drucken und selektive enzymatische Aktivität eine neue Generation von Biomaterialien für die Forschung und klinische Anwendung zu erstellen. Das entwickelte Material, Rinderserumalbumin Gummi, ist die Reaktion in eine Form gespritzt, die bestimmte geometrische Merkmale bestätigt. Das Opfermaterial ermöglicht die ausreichende Übertragung von architektonischen Besonderheiten zu einem natürlichen Gerüstmaterial. Der Prototyp besteht aus einem 3D-Kollagen-Gerüst mit 4 und 3 mm Kanäle, die reprESENT eine verzweigte Architektur. Das Papier betont die Verwendung dieser biofabrication Technik für die Erzeugung von natürlichen Konstrukten. Dieses Protokoll nutzt eine computergestützte Software (CAD) eine feste Form zu fertigen, die Reaktion mit BSA Gummi, gefolgt von der enzymatischen Abbau des Kautschuks, so dass seine architektonischen Besonderheiten innerhalb der Gerüstmaterial eingespritzt wird.

Einleitung

Im Engineering-Bereich Gewebe die Fähigkeit, Gewebegerüste herzustellen ist lebenswichtig. Ein geeignetes Gewebegerüst eine 3D-Struktur aufweist, wird aus biokompatiblen Materialien bestehen, und ahmt in vivo Gewebearchitektur Zell- und Gewebewachstum und Umbau zu erleichtern. Dieses Gerüst muß den Transport von Nährstoffen und die Entfernung von Abfällen ^1-4 ermöglichen. Eines der Haupthindernisse für die Herstellung dieser Gerüste ist die Fähigkeit, bestimmte geometrische Merkmale in einem biokompatiblen Material zu rekapitulieren. Mehrere biofabrication Techniken, um die geometrischen Merkmale dieser Gerüste zur Steuerung gemeldet worden sind, werden Beispiele ^5-8 Elektrospinnen, Lösungsmittelgießen ^9, Stereolithographie ^{10 und} 3D-Print ^11, unter anderem. Diese Techniken fallen kurz in eine relativ einfache Übertragung von steuerbaren internen und externen architektonischen Besonderheiten bietet, sind teuer, zeichnen sich durch ihre Auflösung und Bedruckbarkeit begrenzt ( zB Düsenmesser, Material Einschränkung) oder erfordern post-Herstellungstechniken, die eine lange Zeit lebensfähig Gerüste ¹² zu produzieren erfordert.

In vielen kommerziellen Herstellungssysteme, die Schaffung von inneren Hohlräumen, Kanälen und Funktionen wird Sand oder anderen geeigneten abnehmbaren oder Opfermaterialien erreicht werden. Das Metall oder Kunststoffteil ist um die Sandform gebildet wird, und sobald es erstarrt ist, wird der Sand entfernt. In der gleichen Art und Weise, die nächste Generation von Biomaterialien braucht die BioSand gleichwertig. Daher wurde die BSA-Kautschuk als Ersatz für BioSand entwickelt. Die BSA-Kautschuk ist ein neu formulierten Material, das mit Glutaraldehyd vernetzt Rinderserumalbumin besteht. Das ultimative Ziel ist spezifisch architektonischen Besonderheiten in einem biologisch abbaubaren Kollagengerüst zu erstellen. Die Eigenschaften des Opfer biorubber, die mit der Form des ursprünglichen Gewebes Dimensionstreue hält beschrieben.

Mehrere Kombinationen von BSA und Glutaraldehyd-Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Vielzahl von Lösungsmitteln getestet. Dieses Material wurde durch die Reaktion zwischen BSA und Glutaraldehyd hergestellt. BSA-Kautschuk kann in die Reaktions komplizierten Geometrien der Formen Gewebe injiziert werden. Vernetzte BSA Trypsin labil und leicht durch das Enzym bei mildem pH und Temperaturbedingungen verdaut. Umgekehrt ich intakte Kollagen Typ ist sehr resistent gegen Trypsin Verdauung. Diese Funktionen werden aktiviert, um wahlweise die BSA Gummi entfernen Sie das Kollagen zu hinterlassen. In der vorliegenden Arbeit bestand darin, die optimalen Parameter zu bestimmen, benötigt eine labile Form zu erhalten, die spezifischen architektonischen Besonderheiten zu einem biokompatiblen Gerüst liefern kann. Die spezifischen Funktionen, die ausgewertet wurden eingeschlossen Mischbarkeit, Enzymverdauung, tragfähig und Fähigkeit Reaktion in eine Negativform eingespritzt werden. Die Kombination von 30% BSA und 3% Glutaraldehyd erfüllt diese Anforderungen. Dieses Protokoll stellt die necessary Richtlinien diese dreidimensionale Gerüste zu schaffen. Der Prototyp besteht aus einem Kollagengerüst, die mit einem Zulauf und zwei Ablaufkanal mit einem Durchmesser von 4- und 3-mm jeweils eine verzweigte Architektur darstellt. Dieses Verfahren hat das Potenzial, Makro- und Mikroumgebungen des Gewebes von Interesse nachahmen. Diese Technologie stellt eine lebensfähige Technik, um eine spezifische geometrische lehrreich zu einem biologisch abbaubaren Material in einer relativ einfach und zeitgerecht mit hoher Wiedergabetreue zu liefern, die abgestimmt werden kann, die in vivo Gewebeelastizität und andere Eigenschaften des Gewebes von Interesse nachahmen.

Protokoll

1. Ermitteln Sie den Prozentsatz an Feststoffen in der Kollagen-Batch

1. Entpacken Sie die Kollagen nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren ^13. Auftauen mindestens 20 ml Kollagen. Bestimmen Sie die anfängliche Anteil von Kollagen Feststoffe in der Partie, um die Kollagenkonzentration in den gebildeten Hydrogele zu manipulieren.
   1. Schneiden drei Stücke von Aluminiumfolie (ca. 6 x 6 cm), und jeder als pan Form durch den Boden eines 25 ml Becherglas werden. Das Gewicht der einzelnen Pfanne.
   2. Fügen Sie eine kleine Menge von Kollagen zu jeder Pfanne und notieren Sie die Gesamtgewicht der Aluminiumschale und Kollagen. In 0,5-0,8 g Collagen auf jedem Aluminiumpfanne.
      Anmerkung: Nach diesem Schritt gibt es drei Aluminiumfolie Pfannen und jeder sollte eine geringe Menge an Kollagen aufweisen. Achten Sie darauf, das Gewicht der einzelnen (insgesamt 3) leere Aluminiumpfanne und das Gewicht der Pfanne nach der Zugabe von Kollagen zu erfassen.
   3. Berechnen des Gewichts des Kollagens in jeder Pfanne mit den fach Formel:
      Collagen Gewicht = Pan und Kollagen Gewicht - Pan Gewicht
   4. Zeigen die drei Aluminiumpfannen, dass das Kollagen in den Ofen bei 100 ° C für 24 Stunden halten.
   5. Nach 24 Stunden und das Gewicht der einzelnen Aluminiumschale und des entwässerten Kollagens.
   6. Berechnen des Gewichts des entwässerten Kollagens unter Verwendung der folgenden Gleichung:
      Dehydrierte Kollagen Gewicht = Pan und dehydrierte Kollagen Gewicht - Pan Gewicht
   7. Der prozentuale Anteil von Fest für die drei Proben die Kollagenfeststoffkonzentration nach folgender Formel zu bestimmen:
      
   8. Berechnen der durchschnittlichen Kollagenfeststoffgehalt der Charge mit dem Prozentsatz der Kollagenfeststoffe für jede der drei Proben.
      Hinweis: Das Kollagen, das verwendet wird, ist das, was der hydratisierten Kollagen gelassen wird. Keine der entwässerte Collagen verwendet.
   9. Nach den Prozentsatz der Kollagenfeststoff (i Bestimmungnitial Kollagenkonzentration) der Charge, bleiben die übrigen hydratisierten Kollagen verwenden. Verwenden eines kalibrierten pH-Meters der pH-Wert der Kollagen Ansatz auf 3 einzustellen.
      1. Hinzufügen kleiner Mengen (2-5 & mgr; l zu einer Zeit) von 12 N Salzsäure (HCl). Halten auf Eis zu allen Zeiten. direkt an das Kollagen nicht die Salzsäure hinzu - die Säure zu der Seite des Rohrs hinzuzufügen. Nach Hinzufügen der Säure, verwenden Sie den Spachtel um die Säure zu dem Kollagen zu schieben und rühren Sie schnell die Mischung.
   10. Sobald es einen pH-Wert von 3 erreicht, lassen Sie die Kollagen-O / N bei 4 ° C sitzen.

2. Herstellung des BSA Rubber

1. Bereiten Sie die Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung nach dem Verfahren unten.
   1. Bereiten 2x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). In zwei PBS Tabletten zu 100 ml Wasser 0,02 M PBS-Lösung zu machen.
   2. Kombinieren BSA mit 2x PBS mit 30% BSA-Lösung zu schaffen, die Prozedur unten aufgeführt werden.
      1. Um beispielsweise eine 30% BSA mit 30 ml 2x PBS zu machen, nutzen 12,9 g BSA. Hinzufügen 1/3 des 2x PBS (beispielsweise 10 ml) in einen Kolben mit einem Rührstab. In 1/2 der BSA (zB 6,45 g BSA) in den Kolben und mit einem Spatel, befeuchten die trockenen gelösten Stoffes.
      2. Wiederholen dieses Prozesses der Zugabe PBS BSA und dann, bis alle den gelösten Stoff und das Lösungsmittel wird in den Kolben. Verwenden Sie den Spatel all den gelösten Stoff zu benetzen. Es sieht wie eine Mischung aus etwas Flüssigkeit und Klumpen. Lassen Sie es für etwa 30 Minuten sitzen.
      3. Schalten Sie dann den Rührer auf einem niedrigen Zyklus und stellen Sie sicher, dass sich keine Klumpen um den Rührstab. Es sollte 90 Minuten dauern, um alles in Lösung zu erhalten, oder es kann O / N bei 4 ° C stehen gelassen werden gerührt. Nach der gelöste Stoff alles gelöst ist, legen Sie die Lösung in einem 20-ml-Spritze und mit einem 0,20 um Spritzenfilter begrenzt. Drücken Sie den Kolben Flüssigkeit durch den Filter zu vertreiben und die sterilisierte Lösung in ein neues Röhrchen sammeln. Lagerung bei 4 ° C.
   3. Bereiten Sie 3% Glutaraldehyd solutiauf 25% Glutaraldehyd-Lösung mit steril filtriert 2x PBS verdünnen. Beispielsweise ist für 10 ml 3% ige Glutaraldehydlösung Verwenden 2 ml 25% Glutaraldehyd und 8 ml 2x PBS. Lagerung bei 4 ° C.

3. Formen Behandlung

Hinweis: Der Prototyp in diesem Papier verwendet eine benutzerdefinierte Edelstahl Y Formstück gemacht. Die Form enthält einen Zulauf und zwei Abströmkanäle von 4 und 3 mm. Erstens, saubere Formen, sprühen sie mit ungesättigten Schmalz, und sie sterilisieren. Bereiten Sie die Formen nach der unten beschriebenen Vorgehensweise.

1. Sauberen rostfreien Stahlformen bei einer Frequenz von 35 kHz unter Verwendung von Ultraschallgerät. Legen Sie die Formen in der Ultraschallgerät und tauchen sie mit Wasser und Eis. Halten Sie die Formen Kälte zu jeder Zeit während der Ultraschallgerät läuft. Führen Sie das Ultraschallgerät für zwei Perioden von 90 min.
   1. Nach jeder Zeit, verwenden Sie eine Nadel, um sicherzustellen, dass es in der Luer kein Material Edelstahl sperren ist oder brass Anschluss. Wasser und Seife verwenden, die gesamte Oberfläche der beiden Seiten der Formen zu reinigen. Stellen Sie sicher, dass es keine Hindernisse in den Kanälen ist.
2. Legen Sie die Formen, Schrauben und Luer-Lock-Anschluss in einem Autoklaven Tasche und Autoklaven es.
3. Füllen Sie die Flasche, die mit handelsüblichen Schmalz (gemischte Fettsäure Trennmittel) mit einer Luftspritze auf halbem Weg legt. Setzen Sie die Kappe mit einem regelmäßigen Kappe Flasche. Legen Sie sie in einem Autoklaven Tasche und Autoklaven es.
   Hinweis: Schweinefett verwendet wird, um die Freisetzung des Materials zu erleichtern, die Reaktions später injiziert werden (BSA-Kautschuk). Sie nicht die Sprüherflasche Deckel in der autoclave- legen es die innere Dichtung beschädigt werden kann.
4. Warm up, das Schmalz für 45 Sekunden oder bis zu seiner klar und flüssig in einer Mikrowelle. Schrauben Sie die Luftspritze Deckel mit dem Schmalz Flasche. Schließen Sie den Deckel mit der Spritze. Bringen Sie die Spritze mit der Luftquelle auf dem Labortisch. Öffnen Sie das Luftventil, und öffnen Sie die Düse der Spritze, bis es beginnt die Oberflächenbenetzungsvon einem Papiertuch.
5. Spray Schmalz senkrecht zu der Oberfläche der Form, bis die Oberfläche vollständig abgedeckt wird. Nach jedem Stück gespritzt wurde, legen Sie sie in einer Petrischale und abdichten. Platzieren der Formen bei 4 ° C für 2 Stunden.
6. Gehen die Formen zu sterilisieren, indem die Oberfläche mit UV-Licht für 30 Minuten ausgesetzt. Legen Sie sie bei 4 ° C zurück, bis sie bereit sind, Reaktion eingespritzt werden.

4. Reaction Injection des BSA Rubber

Hinweis: Alle Materialien und Lösung sollte kalt werden halten, bis sie bereit vorzeitige Einstellung des BSA-Kautschuk in den nächsten Schritten zu verwenden, um zu verhindern.

1. Bereiten Sie die Spender zur Abgabe des BSA Gummi an den Formen dieser Schritte.
   1. Sterilisieren Sie alle der Mischungskomponenten (zwei O-Ringe, Spritzenkappe, Doppelspritze, mischen Spitze, und 4: 1 Dispenser), indem Sie sie mit UV-Licht ausgesetzt wird für 30 Minuten in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Kapuze.
      Hinweis: Ein PCR-Haube wurde verwendet, weil tseine Verfahren beinhaltet Fixiermittel. Diese Chemikalien können nicht wegen der Gefahr der Exposition und Toxizität für die Zellen in der Zell- / Gewebekulturhaube verwendet werden. Jede andere Haube, die eine UV-Licht enthält, wird als geeignet.
   2. Setzen Sie die Verschlusskappe auf die Lösung Halter.
   3. Führen Sie die Misch- und Einspritzen bei einem 4: 1-Verhältnis von BSA: Glutaraldehyd. Fügen Sie den 30% BSA dem Doppelspritzenkammer, die die höchste Menge der Lösung liefern wird (Es dauert etwa 4 ml zu füllen). Achten Sie darauf, genügend Platz zu verlassen, den O-Ring zu platzieren, um zum Überlaufen und eine Verunreinigung der benachbarten Kammer zu verhindern.
   4. In 3% Glutaraldehyd-Lösung in die andere Kammer (es dauert ca. 1 ml zu füllen). Achten Sie darauf, genügend Platz zu verlassen, den O-Ring zu platzieren Überlaufen und eine Verunreinigung der benachbarten Kammer zu verhindern.
   5. Der doppelte Spritze auf dem Spender. Kippen Sie die Montage vertikal, so dass die Spritzenkappe an der Spitze ist. Setzen Sie die Kappe mit dem Mischspitze.
   6. Screw die beiden Edelstahl Formstücke zusammen.
   7. Legen Sie die Baugruppe im Inneren eines Autoklaven Tasche.
   8. Um jegliche Luft in den Spender zu entfernen, sie in aufrechter Position zu halten und schnell drücken Sie den Griff einmal eine kleine Menge des BSA mit dem Glutaraldehyd gemischt zu lösen. Bringen Sie dann schnell die Edelstahl Y Form des Luer-Lock-Anschluss an der Spitze der Spritze.
   9. Halten Sie die Edelstahl Y Form mit der linken Hand und der BSA-Glutaraldehyd Mischung Spender auf der rechten Seite. Alternative abdecken jeweils links und rechts der Abgasabflusskanäle durch das Abgas zu den Seiten des Autoklaven Beutel drücken, um sicherzustellen, dass die im Inneren Hohlräume mit der Lösung gefüllt sind. Dann legen die Formen horizontal und wieder injizieren.
   10. Nehmen Sie die Formen von Spender und in eine 25 mm Petrischale.
   11. Platzieren Parafilm um die Petrischale Dehydratisierung des Gummis zu verhindern.
   12. Legen Sie die Form in der 4 ° C Kühlschrank O / N.

Hinweis: Das Kollagen sollte während des Verfahrens zu jeder Zeit auf Eis gehalten werden.

1. Ändern Sie die Kollagen-Konzentration den Prozentsatz der Kollagenfeststoffe verwendet wird.
   1. Machen Sie 10 ml 1,75% Kollagen durch die Anfangskollagenkonzentration mit kaltem Wasser eingestellt wird.
   2. Mit einem kalibrierten pH-Meter, den pH-Wert auf 3 unter Verwendung von 12 N Salzsäure. Setzen Sie die Salzsäure nicht direkt in den das Kollagen um die Säure zu der Seite der Röhre hinzu. Nach Hinzufügen der Säure, verwenden Sie den Spatel die Säure in die Kollagen zu schieben und rühren Sie schnell die Mischung.
   3. Man wiegt 4 g von Kollagen in einem separaten konischen Rohr.
   4. Zentrifugieren Sie die Kollagen-Luft bei 4 ° C und 9343 × g für 20 bis 30 min zu entfernen.
   5. UV-Sterilisation für 30 Minuten der Zellkultur Kapuze, und 14 ul von Laminin auf die 4 ml Kollagen hinzuzufügen. Dies wird in einem letzten Laminin Konzentration von 10 ug / ul führen. Hinweis: Laminin bietet structural Integrität, Haftung und fördert verschiedene zelluläre Antworten.
   6. Schalten Sie die PCR-UV-Licht auf für 20-30 Minuten vor der Verwendung der Haube für die Sterilisation.
   7. Setzen Sie den Luer-Lock-Kappe, mit einem 20-ml-Spritze zu befestigen, in Ethanol für 2 Stunden. Dann lassen Sie es sie im UV-Licht, um zu trocknen und legen.
   8. Gamma bestrahlt das Kollagen für 8,6 min 1.200 cGy zu erreichen.
      Hinweis: Die Zeit auf den Zerfall des Cäsiumquelle abhängt. Stellen Sie die Zeit, um die gleiche Dosierung zu erreichen.

6.Casting Collagen auf BSA Gummi

1. Um das Kollagen polymerisieren, verwenden Sie einen 8: 1: 1-Verhältnis (Kollagen: HEPES: MEM). Das folgende Verfahren basiert auf einer anfänglichen 4 g Kollagen angesäuert (aus Schritt 5.1.8).
   1. Machen Sie eine 0,2 N HEPES-Lösung in Wasser, und der pH-Wert auf 9 durch Zugabe geringer Mengen (1-5 ul) von 1-5 M Natriumhydroxid (NaOH) -Lösung. Verwendung eines kalibrierten pH-Meters, überwachen den pH der Lösung nach jeder Zugabe. Lagerung bei 4 ° C oder keep auf Eis.
   2. Schalten Sie das UV-Licht der Gewebekulturhaube für 20-30 min die Haube zu sterilisieren.
   3. Autoklav Pinzetten, Spatel und Skalpell für die Sterilisation.
   4. Mischen 1,5 ml 0,2 N HEPES (pH 9) und 1,5 ml 10x MEM Verwendung der Gewebekulturhaube. Achten Sie darauf, es zu halten, auf Eis und Wirbel es für 5 Sekunden vor der Verwendung. Lagerung bei 4 ° C oder auf Eis halten.
   5. Um die PCR-Haube sterilisieren, schalten Sie die UV-Licht für 30 Minuten.
   6. Legen Sie eine 12-Well-Platte und eine 20-ml-Spritze in -20 ° C für 10 Minuten, oder bis sie bereit, um fortzufahren. Hinweis: Bewahren Sie alle Materialien Kälte bis zum Gebrauch. Die Temperaturerhöhung bewirkt eine vorzeitige Kollagen Fibrillogenese.
   7. Spray alle Rohre und Wellplatten, die in der Haube mit 70% Ethanol sein werden und lassen Sie sie zur Sterilisation trocken. Legen Sie eine 20-ml-Spritze auf Eis für eine spätere Verwendung zu kühlen.
   8. In der PCR-Haube, öffnen Sie die Formen aus rostfreiem Stahl, die BSA-Kautschuk zu lösen und mit einem Skalpell, schneiden Sie die Abgaskanäle des BSA rubber Form.
   9. Im Rahmen der PCR-Haube, öffnen Sie die sterile Kollagenröhren und 1 ml des HEPES-MEM-Lösung (darauf achten, dass vor dem HEPES-MEM-Lösung zu extrahieren, dass alles gut vermischt ist und es gibt keine festen Ablagerungen).
   10. Mit dem sterilen Spatel gründlich gemischt, um das Kollagen und Pufferlösung.
   11. Schließen und Wirbel es schnell eine gut gemischte Hydrogel zu gewährleisten.
   12. Transfer zu einem Kalt 20-ml-Spritze.
   13. Mit einer Hand halten Sie die BSA Gummi im Inneren des Brunnens und die andere verwenden, verzichten Hälfte des Kollagen-Hydrogel-Lösung auf den Boden des Bohrlochs.
   14. Mit den sterilen Pinzette, sicherzustellen, dass die Gummi-und Abfluss Enden an den Seiten des Bohrlochs berühren.
   15. Gießen Kollagenlösung auf der Gummi bis vollständig bedeckt.
   16. Sicherzustellen, dass die Gummi BSA im Kollagen suspendiert wird und dass es keine Blasen, insbesondere nahe den Enden des Kautschuks.
   17. Legen Sie die Abdeckung und wickeln Parafilm rund um dasUmfang des Brunnens.
   18. bei 37 ° C für 1 Stunde in den Brutschrank gestellt. Halten Sie die PCR-UV-Licht auf.
2. Nach der Polymerisation des Kollagens, vernetzen UV das Hydrogel über die folgende Prozedur.
   Hinweis: Die Vernetzung des Kollagens wird eine UV-Vernetzer Vorrichtung getan werden, bei dem die Energiemenge gesteuert werden kann.
   1. Schalten Sie die UV-Vernetzer und nutzen die Energie Einstellung der leeren Kammer zur Bestrahlung mit 630.000 & mgr; J / cm ^2.
   2. Entfernen Sie die Gele aus dem Inkubator.
   3. Spray Hände mit Ethanol, und, im Inneren der Kammer, entfernen Sie den Deckel so schnell wie möglich.
   4. Schließen der Kammer und UV Vernetzung der Hydrogele durch die Energieeinstellung auszuwählen und Bestrahlen 630.000 & mgr; J / cm ^2.
   5. Nach der Vernetzung Zyklus, schalten Sie das UV-Licht auf die PCR-Haube aus
   6. Spray Hände mit Ethanol und die Kammer öffnen, den Deckel rasch wieder auf die Well-Platte legen. Bewegen Sie den Well-Plattezu dem PCR-Haube.
   7. Mit dem sterilen Spatel vorsichtig lockern und das Gel aus dem Bohrloch zu entfernen. Drehen Sie die Gele unter der Haube die Unterseite des Hydrogels zu vernetzen. Wiederholen Sie Schritt 6.2.3 und 6.2.4.

7. Enzym Verdauung der BSA-Gummi

1. Um einen hohlen Kollagengerüst zu haben, entfernen BSA Gummi in einer Weise, die nicht die Dimensionen im Hydrogel eingebettet auswirkt. Das Verfahren wird nachfolgend beschrieben.
   1. Schalten Sie die UV-Licht für 20-30 Minuten die Gewebekultur Haube zu sterilisieren.
   2. Machen 0,25% Trypsin-Lösung pH 7,8. Beispielsweise ist für 15 ml Wasser, hinzu 0,0376 g Trypsin in einem 50 ml konischen Röhrchen. Den pH-Wert auf 7,8 durch Zugabe geringer Mengen (2-5 & mgr; l) mit 1 M NaCl. Legen Sie die Lösung in einem 20-ml-Spritze und verschlossen mit einem 0,20 um Spritzenfilter. Drücken Sie den Kolben Flüssigkeit durch den Filter zu vertreiben und die sterile Lösung in ein neues Röhrchen sammeln.
   3. Schalten Sie das Wasserbad und die Temperatur auf 30° C.
   4. Nach 30 Minuten, schalten Sie die UV-Licht aus. Spray Ethanol auf alle Rohre und Materialien, die in der Haube verwendet wird.
   5. Übertragen Sie die Kollagen-Hydrogel unter der Haube und in getrennten konischen Röhrchen.
   6. Hinzufügen etwa 3-5 ml (gerade genug, um die Gele zu bedecken) von 0,25% Trypsin-Lösung mit einem pH von 7,8 zu jedem Röhrchen.
   7. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und Wirbel leicht für ca. 1 min.
   8. Platz in der 30 ° C warmen Wasserbad für 15-24 Std. Während im Wasserbad, Strudel leicht die Gele häufig, bis der BSA-Kautschuk aus dem Hydrogel verdaut oder entfernt worden ist.
      Hinweis: Um zu bestimmen, ob die BSA Gummi entfernt wurde, entweder der Kautschuk in der Trypsinlösung schwimmt oder es gibt gebrochenen Stücke. Es darf keine visuellen dunkle Bereiche innerhalb des Hydrogels sein.
2. Um sicherzustellen, dass alle BSA Gummi und Trypsin wurde von den Hydrogelen entfernt worden ist, spülen sie wie unten beschrieben.
   1. Schalten Sie den PCR-hood UV-Licht für 20-30 min.
   2. Bereiten Mosconas Lösung. Kombinieren Kaliumchlorid (KCl, 28,6 mM), (NaHCO _3, 11,9 mM), Glucose (9,4 mM) und (NaH _{2 PO 4, 0,08} mM) in Wasser. PH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH oder 12 M HCl-Lösung. Platzieren der Lösung in einer 20 ml Spritze und mit einem Spritzenfilter von 0,20 & mgr; m, um die Lösung zu sterilisieren.
   3. Spray alles mit Ethanol, bevor sie auf der Motorhaube platziert und lassen Sie das Ethanol zu trocknen.
   4. Öffne die Tube und übertragen 5-10 ml sterilem Mosconas Lösung auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
   5. Übertragen der Kollagen-Hydrogel zu dem konischen Rohr, das die Enzymlösung enthält. Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel vollständig mit der Lösung bedeckt ist. Verlassen das Rohr in dem Schüttler im Kühlschrank bei 4 ° C für 30 min.
   6. Saugen Sie das Mosconas Lösung und wiederholen Sie Schritt zweimal 7.2.5.
   7. Lagerung bei 4 ° C.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, dass diese Technik in biofabrication Erzeugung 3D-Gerüste effizient ist, die die räumliche Anordnung in in vivo Gewebe gesehen nachahmen kann. Die architektonischen Merkmale sind Vitalparameter für das Tissue Engineering Anwendung, eine entscheidende Rolle bei der In-vivo-Zell-Interaktion und Funktionalität des Gewebes zu spielen.

Die Konsistenz und Mischbarkeit des BSA-Kautschuk war ei...

Diskussion

Biofabrication ist ein sehr interdisziplinäres Feld, in dem Biologie und Konstruktionsprinzipien komplexen Materialien zu erzeugen, zusammenführen, die nativem Gewebe nachahmen. Um dies zu erreichen, besteht ein Bedarf, Techniken zu entwickeln, die die Information verwenden, um von in vivo Gewebe gesammelt und übersetzt es in ein in vitro-Gerüst. Auf diese Weise kann eine Plattform entwickelt werden, dass ähnelt die architektonischen, funktionalen und mechanischen Eigenschaften des in-vivo-Gewebe.<...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagen Typ I			Kollagen aus Kalbsleder gewonnen
Hydrocloric Acid (HCl)	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets)	MP Biomedical	U5378	1 Tablette pro 100 ml ergibt 1x
PBS Albumium aus Rinderserum (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Glutaraldehyd	Sigma-Aldrich	G5882	Toxic
Lard Fields		3090
Edelstahlformen gefräst			mit Microlution Maschine
Air Brush Kit	Central Pneumatic	47791
Mischkanüle für Doppelspritze	Medmix	ML2.5-16-LLM	Mischer, DN2,5X16, 4:1 braun, med
Kleiner O-Ring für Doppelspritze	Medmix	PPB-X05-04-02SM	Kolben B, 5 ml, 4:1, PE natur
Doppelspritzenkappe	Medmix	VLX002-SM	Kappe, 4:1/10:1, PE braun, med
Großer O-Ring für Doppelspritze	Medmix	PPA-X05-04-02SM	Kolben A, 5 ml, 4:1
Doppelspritze	Medmix SDL	X05-04-50M	Doppelspritze, 5 ml, 4:1
Doppelspritzenspender	Medmix	DL05-0400M	Dispenser, 5 ml, 4:1, med, plain
Laminim			3,6 mg/ml - extrahiert USC Labor
20 ml Spritze Luer Lock Tip	BD	302830
Luer Lock Caps	Fisher	JGTCBLLX
HEPES	Sigma -Aldrich	H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM)	Life Technologies	1143-030
Trypsin	Life Technologies	27250-018
UV Vernetzer	Spectroline UV	XLE1000
Sodium Clorid (NaCl)	Fisher	S271-10	Zur Herstellung von Mosconas
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma -Aldrich	P5405-250	Zur Herstellung von Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher	BP328-500	Zur Herstellung von Mosconas
Glucose	Sigma -Aldrich	G-8270	Zur Zubereitung Mosconas
Natriumphosphat didasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S-7907	Zur Herstellung von Mosconas
Sterilfilter für	Spritzen Corning	431224