Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, mit der die Gefäßarchitektur im Gehirn mittels in vivo und ex vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie quantifiziert werden kann.

Abstract

Eine Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) führt häufig zu HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) und ist gekennzeichnet durch einen chronischen neuroinflammatorischen Zustand innerhalb des Zentralnervensystems (ZNS), von dem angenommen wird, dass er hauptsächlich durch die viral vermittelte Aktivierung von Mikroglia und hirnresidenten Makrophagen angetrieben wird. Eine HIV-1-Infektion geht auch mit Veränderungen des zerebrovaskulären Blutflusses (CBF) einher, was die Möglichkeit erhöht, dass eine HIV-assoziierte chronische Neuroinflammation zu Veränderungen der CBF und/oder der zerebralen Gefäßarchitektur führen kann. Um diese Frage zu beantworten, haben wir ein Mausmodell für HIV-induzierte Neuroinflammation verwendet und getestet, ob eine langfristige Exposition gegenüber dieser entzündlichen Umgebung die Gefäße des Gehirns schädigen und zu einer Verdünnung der Kapillarnetzwerke führen kann. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Veränderungen der kortikalen Kapillardichte in einem Mausmodell für neuroinflammatorische Erkrankungen (HIV-1 Tat transgene Mäuse). Dieser verallgemeinerbare Ansatz verwendet sowohl die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Kapillaren durch ein dünnschädeliges kortikales Fenster als auch die ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Kapillaren in Schnitten des Gehirns von Mäusen. Diese Verfahren erzeugen Bilder bzw. Z-Stack-Dateien von Kapillarnetzwerken, die dann einer quantitativen Analyse unterzogen werden können, um Veränderungen in der zerebralen Gefäßarchitektur zu beurteilen.

Introduction

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) dringt in das Gehirn während der akuten Phase der Virus-Infektion, und produktiv infiziert sowohl Mikroglia und Gehirn Makrophagen, was zu deren Aktivierung - und die Freisetzung von beiden Host-abgeleitete Entzündungsmediatoren und lösliche HIV-1 virotoxins wie Tat und gp120 ⁽ⁱⁿ 1,2 überprüft). Als Folge davon wird ein chronischer Zustand neuroinflammatorischen im ZNS, die vermutlich auf die Pathogenese der HIV-1-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) ^3-5 beitragen etabliert.

Chronische Überexpression von HIV-1 Tat oder Interleukin (IL) -17A im ZNS von Mäusen wurde gezeigt....

Protocol

Die Universität von Rochester Universität Ausschuss für Tier Ressourcen genehmigt alle in diesem Papier durchgeführt Verfahren.

1. Präoperative Vorbereitung (und Mäusen)

1. Bereiten Sie den OP-Bereich mit allen erforderlichen Geräten haben. Sterilisieren Sie alle während des Verfahrens zuvor mit 70% Ethanol verwendeten Werkzeuge. Optional können Sie eine Glasperlen Sterilisators oder Autoklaven, um die Werkzeuge zu sterilisieren.
2. Platzieren Sie die Maus in einer Isofluran Induktionskammer zu einer Isofluran Verdampfer verbunden ist. Eingestellt Isofluran Ebenen zu 4% bei einer Rate von 1 L / min.
   Anmerkung: Für di....

Results

Die Dünn Schädel kortikalen Fenster können für die in vivo Zwei-Photonen-Imaging von kortikalen Kapillaren (Abbildung 1). Ein geeigneter Bereich für Bild zeigt zahlreiche, unterschiedliche Kapillaren (Abbildung 1A). Im gleichen Blickfeld gibt es keine arteriellen Zellwand Autofluoreszenz, und es kann weitere Fluoreszenzsignale, wie Kollagen Fluoreszenz, durch Erzeugung der zweiten Harmonischen ¹¹ (1B) induziert werden.......

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren kann angewendet werden, um Gehirn mikrovaskulären Strukturen in einer breiten Palette von experimentellen Modellen / Einstellungen zu analysieren. Für den Erfolg dieser Methode müssen drei wichtige Schritte gemeistert werden. Erstens muss die dünne Schädelfenster den Schädel oder die zugrunde liegenden Hirn nicht beschädigen. Es ist leicht, den Schädel während der Ausdünnung zu durchstechen oder zu einem Hitze induzierte Gefäßdurchlässigkeit. Dies kann mit einer Abbildungs ​​stört, wenn d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Mikroskop	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heizkissen	Stryker	TP3E
T/PUMPE	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isofluran-Verdampfer	Datex Ohmeda	447
Künstliches Tränengel	Butler AHS	7312
Povidon-Jod-Lösung	Aplicare	52380-1855-9
Extra feine Bonner Schere	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Pinzette	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Pinzette	Fine Science Tools	11251-35
Eisenchloridlösung	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handstück Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Fräser für Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethan	Sigma-Aldrich	U2500	Karzinogen der Gruppe 2B
Geflochtenes Nahtmaterial	Ethicon	735G
Vannas Federschere	Fine Science Tools	15000-03
Arterienkatheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	Das Ende des Katheters wurde manuell gedehnt, um seinen Durchmesser zu verringern.
Blutdruckmessgerät	World Präzisionsinstrumente	SYS-BP1
Blutdruckmesskopf und Kabel	World Präzisionsinstrumente	BLPR2
RAPIDLab Blutgasanalysator	Siemens	248
40 μ l Kapillarrohr	VWR	15401-413
Texas Red-Dextran (70.000 MW, 10 mg/kg in Kochsalzlösung gelöst)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphotonenmikroskop	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa Laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Verfügbar bei http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging