Method Article

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

DOI:

10.3791/53582

⸱

January 12th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Human Genetics, University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, mit der die Gefäßarchitektur im Gehirn mittels in vivo und ex vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie quantifiziert werden kann.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) führt häufig zu HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) und ist gekennzeichnet durch einen chronischen neuroinflammatorischen Zustand innerhalb des Zentralnervensystems (ZNS), von dem angenommen wird, dass er hauptsächlich durch die viral vermittelte Aktivierung von Mikroglia und hirnresidenten Makrophagen angetrieben wird. Eine HIV-1-Infektion geht auch mit Veränderungen des zerebrovaskulären Blutflusses (CBF) einher, was die Möglichkeit erhöht, dass eine HIV-assoziierte chronische Neuroinflammation zu Veränderungen der CBF und/oder der zerebralen Gefäßarchitektur führen kann. Um diese Frage zu beantworten, haben wir ein Mausmodell für HIV-induzierte Neuroinflammation verwendet und getestet, ob eine langfristige Exposition gegenüber dieser entzündlichen Umgebung die Gefäße des Gehirns schädigen und zu einer Verdünnung der Kapillarnetzwerke führen kann. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Veränderungen der kortikalen Kapillardichte in einem Mausmodell für neuroinflammatorische Erkrankungen (HIV-1 Tat transgene Mäuse). Dieser verallgemeinerbare Ansatz verwendet sowohl die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Kapillaren durch ein dünnschädeliges kortikales Fenster als auch die ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Kapillaren in Schnitten des Gehirns von Mäusen. Diese Verfahren erzeugen Bilder bzw. Z-Stack-Dateien von Kapillarnetzwerken, die dann einer quantitativen Analyse unterzogen werden können, um Veränderungen in der zerebralen Gefäßarchitektur zu beurteilen.

Introduction

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Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) dringt in das Gehirn während der akuten Phase der Virus-Infektion, und produktiv infiziert sowohl Mikroglia und Gehirn Makrophagen, was zu deren Aktivierung - und die Freisetzung von beiden Host-abgeleitete Entzündungsmediatoren und lösliche HIV-1 virotoxins wie Tat und gp120 (in 1,2 überprüft). Als Folge davon wird ein chronischer Zustand neuroinflammatorischen im ZNS, die vermutlich auf die Pathogenese der HIV-1-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) 3-5 beitragen etabliert.

Chronische Überexpression von HIV-1 Tat oder Interleukin (IL) -17A im ZNS von Mäusen wurde gezeigt, dass in der mikrovaskulären rarefaction 6,7 führen. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass eine chronische Neuroentzündung kann zur Pathogenese von Hand durch Wirkung auf die zerebrale Gefäßsystem beizutragen. Um diese Frage weiter zu prüfen, haben wir Methoden, um zerebrale vaskuläre struc Quantifizierung entwickeltturen.

Dieser Beitrag beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung der Anzahl der Kapillar-Knoten, Kapillar Segmente bedeuten Segmentlänge, Gesamtsegmentlänge, bedeuten Kapillardurchmesser und Gesamt Kapillarvolumen mit In-vivo-Bildgebung von Kapillarnetzwerke durch eine dünne Schädel kortikalen Fenster (von zuvor beschriebenen modifizierten Protokolle) 8,9 sowie ex vivo-Abbildung von Gehirnschnitten unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie. Dieser kombinierte Ansatz sieht eine ganzheitliche Quantifizierung des zerebralen Gefäßparameter, da die in vivo-Dünn Schädel Kortikalisfenster ermöglicht die Erhaltung des zerebralen Umgebung während ex vivo-Abbildung von Kapillarnetzwerken in Hirnschnitten erlaubt die Rekonstruktion der vollständigen, dreidimensionalen Kapillarnetzwerke - die dann unter Verwendung im Handel erhältlicher Software quantifiziert werden kann.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Universität von Rochester Universität Ausschuss für Tier Ressourcen genehmigt alle in diesem Papier durchgeführt Verfahren.

1. Präoperative Vorbereitung (und Mäusen)

  1. Bereiten Sie den OP-Bereich mit allen erforderlichen Geräten haben. Sterilisieren Sie alle während des Verfahrens zuvor mit 70% Ethanol verwendeten Werkzeuge. Optional können Sie eine Glasperlen Sterilisators oder Autoklaven, um die Werkzeuge zu sterilisieren.
  2. Platzieren Sie die Maus in einer Isofluran Induktionskammer zu einer Isofluran Verdampfer verbunden ist. Eingestellt Isofluran Ebenen zu 4% bei einer Rate von 1 L / min.
    Anmerkung: Für die Experimente hier berichteten, Mäuse mit einer Doxycyclin (DOX) induzierbaren HIV-1-Tat-Transgens durch astrozytenspezifischer gliafibrilläres Protein (GFAP) -Promotor (HIV Tat-Tg-Mäusen) angetrieben 10 wurden verwendet, um die Wirkung von HIV zu untersuchen -1 induzierte Neuroentzündung auf die zerebrale Gefäßstruktur, wie zuvor beschrieben, 7,10.
  3. Spitze vorsichtig die Induktionskammer, um die Maus zu beobachten &# 39; s Stellreflexes. Sobald die Stellreflexes unterdrückt worden ist, setzen Sie die Isofluran-Level auf 2% und leiten den Luftstrom aus der Induktionskammer zu dem Nasenkegel an der Operationstisch.
  4. Bewegen sich schnell mit der Maus aus der Induktionskammer zu dem Wasser aufgegossen Heizkissen. Fahren Sie mit Isofluran (1,5-2%) durch die Nase Kegel gelten. Passen Anästhesie nach individuellen Maus Toleranz durch Atemfrequenz (RR) Überwachung bewertet.
    Hinweis: physiologischen Gasparameter verändert Hirndurchblutung und Gefäßdurchmesser Beurteilung kann die Vertiefung der RR zu stören. Versuchen, RR zwischen 55-65 Atemzüge pro Minute zu halten. Herzfrequenz (HR) verwendet Beurteilung der Narkosetiefe ist; Halten HR zwischen 300-450 Schlägen pro Minute auf physiologische Veränderungen Gefäßdurchmesser zu verhindern. Typischerweise wird eine ausreichende Anästhesie zwischen 1,5-2,0% Isofluran werden bei 1 l / min bei einem gegebenen Maus.
  5. Führen Sie eine Zehe Prise weiter prüfen Sie die Tiefe der Anästhesie. Wenn die Maus nicht reagiert, commENCE die chirurgischen Verfahren.

2. Herstellung der Thin-Schädelhirn Fenster

  1. Künstliche Tränen Gel für die Augen der Maus. Vollständig zu entfernen die Haare aus der Kopfhaut der Maus mit einer Schere oder einem elektrischen Rasierer.
  2. Sterilisieren der Kopfhaut durch Anlegen Povidonjodlösung; Trocknen lassen. Dann, unter einem Lichtmikroskop, entfernen Sie die Haut von der Kopfhaut der Maus, komplett Aussetzen der Scheitelbeine, Schwanzstirnknochen und Bregma Kennzeichnung.
  3. Sie eine kleine Menge einer 10% Eisenchloridlösung auf den Schädel, um die Membranen zum leichten Entfernen zu trocknen. Entfernen Sie die getrockneten Membranen mit den # 5/45 Pinzette vorsichtig Abkratzen der Schädel.
  4. Tragen Sie eine dünne Schicht Kleber auf der Kopfplatte Fenster. Drücken Sie den Kopfplatte gegen den Schädel der Maus, halten Sie den Bereich von Interesse in der Mitte des Fensters. Einen Tropfen Zahnzement auf der Kopfplatte, um den Kleber zu polymerisieren.
  5. Eine dünne SchichtKlebstoff entlang der Kante der Kopfplatte Fenster, ein Reservoir, in welchem ​​zu Kochsalz Halt. Nachdem der Leim getrocknet ist, schrauben Sie die Kopfplatte in die Maus Kopfplatte Baum.
    Hinweis: die Maus Kopfplatte Baum in diesem Verfahren verwendet wird, ist eine Struktur mit einer Metallbase und zwei Metallsäulen. In jeder Spalte gibt es einer Feder und einer Flügelmutter. Die Kopfplatte ist auf der Oberseite der Feder angeordnet, und die Flügelmutter angezogen, bis der Kopf waagerecht steht und sich nicht bewegt.
  6. Entfernen Sie alle Kleber von der Kopfplatte Fenster mit einem Bohrer auf eine Microtorque Bohrer bei 6.000 Umdrehungen pro Minute eingestellt angebracht. Stoppen Sie alle 10-15 sec, um eine Überhitzung der Maus Schädel, die in strukturelle Schäden an Schiffen zur Folge haben können, zu verhindern.
    1. Mit einem neuen Bohrer, platzieren Sie den Microtorque Bohrer 1,5 mm seitlich von der Mittellinie (ein Drittel des Durchmessers der Kopfplatte Fenster). Fangen Sie an, dünnen den Schädel in der Umgebung dieser Stelle bei 4.000 Umdrehungen pro Minute. Bewegen Sie den Bohrer sanft über den Schädel, die keinen direkten Druck nach unten.
    2. Cease drilling alle 10-15 sec Überhitzung der Maus Schädels zu verhindern. Während dieser Zeit, entfernen Sie den angesammelten Staub mit einem Totenkopf Druckluftbehälter.
    3. Verwenden Tropfen Kochsalzlösung auf RT Schädels für 5-10 sec abkühlen. Alle Flüssigkeit entfernen Sie vorsichtig mit einem weichen Tuch, um Schädel Ausdünnung fortsetzen.
  7. Für die endgültige Verdünnung des Schädels, stellen ein geringes Volumen von Kochsalzlösung in der Kopfplatte und Behälter leicht fegen eine Dentalmikroklinge über den Bereich von Interesse, bis kleine Gefäße sind deutlich sichtbar.

3. Überwachung von physiologischen Parametern

  1. Sobald der Schädel vollständig ausgedünnt, trennen Sie die Maus aus der Halterung und legen Sie sie auf dem Rücken. Gently kleben Sie beide Hinterbeine, um die mediale Oberschenkel deutlich aus.
  2. Entfernen Sie das Haar über beiden medialen Oberschenkel mit einer Schere oder einem elektrischen Rasierer. Desinfizieren Sie die Operationsstelle durch das Abdecken der Oberschenkel mit PVP-Jod.
  3. Sie die Haut an der medialen rechten Schenkel über die Oberschenkelveneund Arterie mit Hilfe der # 5 Pinzette. Ziehen Sie die Haut nach oben und mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie die Haut.
    Anmerkung: die linken Oberschenkel im Falle von chirurgischen Komplikationen (Gefäßanomalien aufgebrochenen Zellen) vorbehalten.
  4. Gelten etwa 3-5 Tropfen 0,9% -iger Salzlösung zur Operationsstelle. Dies ermöglicht eine größere Vergrößerung der Schiffe, sowie das Einhalten der Website mit Feuchtigkeit versorgt und verhindert das Trocknen der Gefäße. Trennen Sie die Oberschenkelvene von Arterie durch stumpf sezieren in die Oberschenkelgefäßnervenbündel mit zwei # 5/45 Pinzette.
  5. Stellen zwei 3 cm Stücke von chirurgischem Nahtmaterial unterhalb der Femoralarterie ungefähr 1 cm auseinander. Drehen Sie den oberen Faden im Uhrzeigersinn, um eine vaskuläre Blutsperre, die helfen, übermäßigen Blutverlust während der Katheterisierung zu verhindern erstellen.
  6. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie mit Hilfe der Feder Schere. Platzieren des Katheters in der Arterie durch den Einschnitt und vorzuschieben, bis der Katheter sicher innerhalb der Arterie.
  7. Aufdrehen des oberen Fadens (Tourniquet) auf Lecks und korrekten Katheterplatzierung zu bewerten. Sicherung des Katheters in der Oberschenkelarterie durch die Kopplung zwei Knoten um den Katheter innerhalb des Behälters mit Hilfe der Nähte.
  8. Injizieren 10 ul Heparin (100 IU / ml) durch den Katheter, um die Blutgerinnung zu verhindern. Dann schließen Sie die chirurgisch rechten Oberschenkel durch Zusammennähen der Haut zusammen mit einem 4-0 Naht in einer einfachen unterbrochenen Muster.
  9. Injizieren Sie 50 ul Urethan (1,2 mg / g) intraperitoneal in der rechten unteren Quadranten. Fünf Minuten später wurden weitere 50 ul Einspritzung in den linken unteren Quadranten für eine Gesamtmenge von 100 ul intraperitoneale Urethan wiederholen. Isofluran Niveaus langsam zurück auf etwa 0,25%, während gleichzeitig rechecking Maus für die Tiefe der Anästhesie.
    Anm: Nadel oberflächlichen innerhalb der Bauchhöhle entlang der hinteren Bauchwand, so dass sie nicht den Darm zu perforieren. Dies kann durch Kneifen der Bauch rectus mu erreicht werdenscles weg von den Eingeweiden und dann Injizieren.
  10. Verwendung einer Kapillare, sammeln eine 40 ul-Probe von arteriellem Blut aus dem Katheter. Befestigen des Katheters an die Blutdruckwandler mit einer Kochsalzlösung gefüllten Vierwegehahn und Heparin Spritze angebracht.
  11. Band der Blutdruckwandler der chirurgischen Vorrichtung, um das unbeabsichtigte Entfernen des Katheters zu verhindern. Beginnt die Überwachung des mittleren arteriellen Drucks.
  12. Legen Sie die Blut gefüllte Kapillare in ein Blutgasanalysegerät Eintrittsöffnung. Sobald alles Blut extrahiert worden ist, entfernen Sie die Kapillare aus der Eintrittsöffnung. Die O 2 und CO 2 Blutgaswerte werden auf einem Papier aus dem Blutgasanalysegerät gedruckt erscheinen.

4. Injektion des fluoreszierenden Farbstoffs

  1. Klemmen Sie die Haut an der medialen linken Oberschenkel mit Hilfe der # 5 Pinzette. Ziehen Sie die Haut nach oben und mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie die Haut. Bereiten Dextran konjugierten rot emittierenden Rhodaminfarbstoff(70 kDa) (10 mg / kg in Salzlösung).
  2. Finde die Oberschenkel vein.Using eine 1-ml-Spritze mit einer 30-G-Nadel befestigt ist, ziehen Sie eine vorher hergestellte Lösung aus einem Fluoreszenzfarbstoff zur Bildgebung an die 130 & mgr; l Linie der Spritze geeignet. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem der Farbstoff vollständig in die Spritze und die Spritze fest flicking Wand.
    1. Biegen Sie die 30 G-Nadel auf einer ca. 30-Grad-Winkel, indem Sie sie gegen eine harte Oberfläche Kegel Seite nach oben. Füllen Sie die Nadel mit dem Farbstoff und entsorgen Sie überschüssige Flüssigkeit, eine 100 ul-Probe verlassen.
  3. Spritzen Sie die 100 ul-Probe von Farbstoff langsam in die Oberschenkelvene. Nach dem Entfernen der Nadel, gelten ruhig, und Druck auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu stoppen. Ermöglichen, dass der Farbstoff für 5 min zirkuliert.
    Hinweis: Alternativ kann die rechte Femoralvene stattdessen für die Fluoreszenzfarbstoffinjektion zur weiteren Blutverlust durch die Schaffung eines weiteren Operationsstelle zu verhindern. Darüber hinaus, wenn dasTier unkontrollierbar Blutungen von der Operationsstelle, kann dies ein Hinweis darauf, dass zu viel Heparin gegeben wurde, um den Katheter zu spülen. Wenn es keine Gerinnung innerhalb von 10-15 min und die Maus immer noch Blutungen, sollten Sie einen Neustart des Experiments mit einer neuen Maus.
  4. Schließen Sie den linken Oberschenkel durch Zusammennähen der Haut zusammen mit einem 4-0 Naht, dann vorsichtig drehen Sie die Maus auf dem Bauch, und legen Sie sie in die Maus Kopfplatte Baum.

5. In Vivo Zwei-Photon Imaging

  1. Bewegen Sie die chirurgische Vorrichtung zu der Zwei-Photonen-Mikroskop, um sicherzustellen, um eine kontinuierliche Anästhesie Niveau zu halten. Eine kleine Menge an 0,9% iger Kochsalzlösung in der Kopfplatte Reservoir und Absenken des Mikroskopobjektivs, so daß er in Kontakt mit der Salzlösung kommt. Suchen Sie den Bereich von Interesse unter Verwendung der Hellfeld-Betrachtung Ziel
  2. Stellen Sie die Zwei-Photonen-Laser-Anregung zu einer Wellenlänge für das Fluoreszenz-Farbstoff geeignet. Beginnen Zwei-Photonen-Imaging mit der 25x oIEL.
    Man beachte, dass in diesen Experimenten verwendeten wir eine Dextran zu einem rot emittierenden Leucht Rhodamin-Farbstoff, der bei einer Wellenlänge von 780 nm angeregt wurde, konjugiert. A 607/36 Emissions Filterdurchlaßbereich, um die Fluoreszenz von dem Farbstoff zu erfassen, und eine Bandpassemissionsfilter 480/20 wurde verwendet, um den arteriellen Autofluoreszenz nachzuweisen
  3. Suchen Sie eine Kapillare auf dem Sichtschirm Bett, und vergrößern diesen Bereich mit dem optischen Zoom 2. Acquire Bilder der Kapillaren mit Hilfe der Zwei-Photonen-Imaging-Software.
  4. Nach der vollständigen Bildgebung ist, zu opfern, die Maus durch Genickbruch folgte durch Enthauptung.

6. Ex Vivo Zwei-Photonen-Imaging

  1. Mit den extra feine Schere, einen Einschnitt in die Kopfhaut vor den interparietal Knochen zu den Stirnknochen der Maus. Sichern Sie die Haut an den Seiten des Schädels mit dem Zeigefinger und Daumen.
  2. Legen Sie die zusätzlichen feinen Schere unter dem medialen Inkabein und schnitt den Schädel entlang der Pfeilnaht. Stoppen Schneiden des Schädels ca. 3 mm nach dem Bregma Kennzeichnung.
    Anmerkung: Bewerben Aufwärtsdruck beim Schneiden des Schädels Schneiden des Gehirns zu verhindern.
  3. Mit Hilfe der # 5 Zangen, trennen den Schädel aus dem Gehirn und entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhäute von der Oberfläche des Gehirns. Verbleibende Hirnhäute kann versehentlich zerfleischen das Gehirn; extreme Vorsicht ist geboten, um dies zu vermeiden. Schieben Sie die # 5 Zange unter dem Gehirn fort langsam nach vorne, bis Gehirn frei von Schädel.
    Hinweis: dass Abwärtsdruck sollten, um verwendet werden, um zu vermeiden Punktion des Gehirns.
  4. Legen Sie das Gehirn in einer Hirnschnittwerkzeug speziell für Mäuse. Durch Tüpfeln künstliche Zerebrospinalflüssigkeit über das Gehirn waschen das Gehirn.
  5. Entfernen Sie einen 2 mm koronalen Abschnitt des Gehirns von Bregma 0 bis Bregma -2. Setzen Sie den Frontalschnitt auf einen konkaven Glasobjektträger, die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit mit dem 0 Bregma (die meisten Hirn Teil des Abschnitts) nach oben zeigt. Abdeckung vorsichtig das Gehirn slEis mit einem Deckglas.
    Hinweis: Vermeiden Sie Druck auf die Glas einmal auf das Gehirn Abschnitt gelegt, da dies die Gefäßarchitektur verformen.
  6. Die Objektträger in dem Mikroskoptisch und legen Sie eine kleine Menge von 0,9% Salzlösung auf das Deckglas. Senken das Mikroskopobjektiv, bis es in Kontakt mit der Salzlösung kommt. Suchen Sie die Mittellinie des Gehirns mit Hilfe der Hellfeld Ziel.
  7. Beginnen Zwei-Photonen-Imaging und suchen Sie die Mittellinie wieder mit dem 25x Ziel. Erreichen dies durch die Suche nach der Längsfissur an der kortikalen Oberfläche des Frontalschnitt. Setzen Sie den rechten Rand des Abbildungsschirm auf der Mittellinie und bewegen Sie den Viewer-Bildschirm über seitlich drei komplette Frames (etwa 1,5 mm von der Mittellinie).
    Man beachte, dass in diesen Experimenten identisch mit denen in der Anmerkung zu Schritt 5.2 wurden die Bildaufnahmeparameter.
  8. Suchen Sie die Tiefe, in der Kapillaren auf dem Sichtschirm kaum sichtbar. Senken Sie die Fokusebene eine zusätzliche 20& mgr; m, um die Spitze der z-Stapel zu bestimmen.
  9. Stellen Sie die Bilddicke bis 1 um. Senken Sie den Blick auf Bildschirm 100 um und passen Laserleistung im ganzen, so dass weniger als 1% der Pixel übersättigt sind.
    Hinweis: Die Z-Stapel-Bilder werden aus einer Reihe von 100 aufeinanderfolgenden 500x500x1 um Bilder zusammengestellt. Je größer der Z-Stapel desto genauer die Nachbearbeitung Berechnungen wird. Im Allgemeinen versuchen, einen z-Stapel 100 um oder mehr zu sammeln.
  10. Drücken Sie auf das Symbol XY Wiederholen gefolgt von der benachbarten XY-Symbol. Sobald die Z-Stapel abgeschlossen ist, drücken Sie die Serie Fertig Symbol und speichern Sie die Datei.

7. Datenverarbeitung

  1. Öffnen Sie ein in-vivo-Bild Kapillare im ImageJ Software. Die Pixel zu Abstandsverhältnis auf Basis der Zwei-Photonen-Software erhaltenen Werte manuell einstellen.
    1. Wählen Sie die * gerade * Symbol aus dem Menü Werkzeuge. Zeichnen Sie eine Linie, die sich von einer Kapillarwand auf die oppoWebsite Kapillarwand, und notieren Sie die Länge von ImageJ vorgesehen.
      Man beachte, daß es notwendig sein kann, um in dem Bild, um die Kanten der Kapillarwände anschaulich machen zoomen.
    2. Wiederholen Sie Schritt 7.1.1 an verschiedenen Stellen entlang der Kapillare sowie für mehrere Kapillaren in dem Bild.
  2. Öffnen Sie die Datei z-Stapel in die Analysesoftware wie Amira. Wählen Sie das Filament Editor-Symbol aus der Unterdrucktastenleiste
    1. Gesetzt den Betrachter Dicke auf etwa 20 zu bewegen, um den Betrachter entweder oben oder unten in der z-Stack.
    2. Wählen Sie das Trace-Symbol und bewegen Sie den Cursor über das geladene Bild. Platz Knoten auf den Kapillaren an den in 2C beschriebenen Standorten; Segmente werden automatisch zwischen benachbarten Knoten angezeigt. Spuren Kapillaren während des gesamten Z-Stapel.
      Hinweis: es wird notwendig sein, um Knoten zwischen Endpunkten und Verzweigungspunkten, um die Kapillaren thr Spuren platzierenoughout der Z-Stapel.
    3. Um diese Knoten zu entfernen, klicken Sie auf Entfernen Zwischensymbol.
      Hinweis: Dies kann eine fehlerhafte geschleift Segmente, die manuell durch Auswahl der Schleife mit dem Buchen Einzelsymbol, und wählen Sie den Remove Selected Symbol entfernt werden müssen, zu erstellen. Wenn Schleifen weiterhin während der Ablaufverfolgung in der Umgebung angezeigt werden, ist es wahrscheinlich, dass die Knoten wurden auf verschiedenen Kapillaren platziert.
    4. Sobald die Rückverfolgung abgeschlossen ist, wählen Sie das Symbol Graph Info, eine Tabellenkalkulation, die automatisch extrahierten Gefäßparameter enthält, zu öffnen. Die Anzahl der Knoten und Segmente sind auf der Hauptansicht Bildschirm zur Verfügung.

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Results

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Die Dünn Schädel kortikalen Fenster können für die in vivo Zwei-Photonen-Imaging von kortikalen Kapillaren (Abbildung 1). Ein geeigneter Bereich für Bild zeigt zahlreiche, unterschiedliche Kapillaren (Abbildung 1A). Im gleichen Blickfeld gibt es keine arteriellen Zellwand Autofluoreszenz, und es kann weitere Fluoreszenzsignale, wie Kollagen Fluoreszenz, durch Erzeugung der zweiten Harmonischen 11 (1B) induziert werden...

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Discussion

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Das hier beschriebene Verfahren kann angewendet werden, um Gehirn mikrovaskulären Strukturen in einer breiten Palette von experimentellen Modellen / Einstellungen zu analysieren. Für den Erfolg dieser Methode müssen drei wichtige Schritte gemeistert werden. Erstens muss die dünne Schädelfenster den Schädel oder die zugrunde liegenden Hirn nicht beschädigen. Es ist leicht, den Schädel während der Ausdünnung zu durchstechen oder zu einem Hitze induzierte Gefäßdurchlässigkeit. Dies kann mit einer Abbildungs ​​stört, wenn d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan und Dr. Linda Callahan von der University of Rochester Multiphoton Core für ihre technische Beratung während der Fertigstellung dieses Protokolls. Wir danken auch Dr. Changyong Feng für die fachkundige statistische Beratung und Dr. Maiken Nedergaard vom University of Rochester Medical Center für das in dieser Arbeit verwendete Kopfplattendesign. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse T32GM007356 und R01DA026325 der National Institutes of Health (NIH) unterstützt; und durch das University of Rochester Center for AIDS Research Grant P30AI078498 (NIH).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Leica MikroskopLeica Inc.MZ8
High Intensity IlluminatorDolan-Jenner180
HeizkissenStryker  TP3E
T/PUMPEGaymar Industries, Inc.TP-500
TEC-4 Isofluran-VerdampferDatex Ohmeda447
Künstliches TränengelButler AHS7312
Povidon-Jod-LösungAplicare52380-1855-9
Extra feine Bonner SchereFine Science Tools14084-08
Dumot #5 PinzetteFine Science Tools11295-10
Dumont #5/45 PinzetteFine Science Tools11251-35
EisenchloridlösungRicca Chemical Company3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive GelHenkel45404
Dental CementStoelting51459
Microtoruqe II Handstück KitPearson DentalR14-0002
005 Fräser für Micro DrillFine Science Tools19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)Salvin Dental6900
UrethanSigma-AldrichU2500Karzinogen der Gruppe 2B
Geflochtenes NahtmaterialEthicon735G
Vannas FederschereFine Science Tools15000-03
  ArterienkatheterSAI Infusion TechnologiesMAC-01Das Ende des Katheters wurde manuell gedehnt, um seinen Durchmesser zu verringern.
BlutdruckmessgerätWorld PräzisionsinstrumenteSYS-BP1
Blutdruckmesskopf und KabelWorld PräzisionsinstrumenteBLPR2
RAPIDLab Blutgasanalysator Siemens 248
40 μ l KapillarrohrVWR15401-413
Texas Red-Dextran (70.000 MW, 10 mg/kg in Kochsalzlösung gelöst)InvitrogenD-1830
Adult Mouse Brain Slicer MatrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM MultiphotonenmikroskopOlypmusFV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa LaserSpectra-Physics
ImageJ SoftwareNational Institutes of Health (NIH)Verfügbar bei http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira SoftwareVisage Imaging 

References

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