Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.
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Methodenartikel
Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fehler bei der Chromosomentrennung während der meiotischen Teilung in Gameten können zu Aneuploidie führen, die anschließend bei der Befruchtung auf den Embryo übertragen wird. Die daraus resultierende Aneuploidie bei sich entwickelnden Embryonen gilt als eine der Hauptursachen für Schwangerschaftsverluste und angeborene Geburtsfehler wie das Down-Syndrom. Die genaue Chromosomensegregation hängt entscheidend von der Bildung des Mikrotubuli-Spindelapparates ab, doch ist dieser Prozess in Säugetier-Eizellen noch wenig verstanden. Interessanterweise unterscheidet sich die meiotische Spindelanordnung von der Mitose und wird zumindest teilweise durch einzigartige Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) reguliert. Die Bewertung von MTOC-assoziierten Proteinen kann wertvolle Einblicke in die Regulationsmechanismen liefern, die die Bildung und Organisation der meiotischen Spindel steuern. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung von Maus-Eizellen und zur Depletion von MTOC-assoziierten Proteinen unter Verwendung eines siRNA-vermittelten Ansatzes, um die Funktion zu testen. Darüber hinaus beschreiben wir die Bedingungen für die Eizellfixierung und Immunfluoreszenzanalyse, um die Bildung und Organisation der meiotischen Spindel zu bewerten.
Einleitung
Die Meiose ist eine einzigartige Teilungsprozess, die in Keimzellen (Eizellen und Spermien) tritt auf, und umfasst zwei aufeinanderfolgende Divisionen ohne dazwischen DNA-Synthese auf homologen Chromosomen und Schwesterchromatiden während der Meiose-I und Meiose-II, die jeweils 1 zu trennen. Fehler in der Chromosomensegregation während der Meiose in Oocyten können in Aneuploidie, die durch den Embryo während der Befruchtung vererbt wird zur Folge haben. Bemerkenswert ist, das Auftreten von Aneuploidie in sich entwickelnden Embryonen erhöht mit zunehmendem Alter der Mutter und ist eine Hauptursache von angeborenen Missbildungen sowie Verlust der Schwangerschaft bei Frauen 1,2, so unterstreicht eine wichtige Notwendigkeit, die molekularen Grundlagen der Aneuploidie im Reifeteilung zu verstehen, .
Während der Zellteilung ist Chromosomensegregation entscheidend von der Montage des Mikrotubuli-Spindelapparat und Etablierung von stabilen Chromosomen-Mikrotubuli-Interaktionen auf korrekte Befestigung zu GegenspindelPole. Wichtiger ist, meiotischen Spindelbildung in Säuger Oozyten unterscheidet sich von Mitose in somatischen Zellen und durch einzigartige Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) die centrioles 3,4 fehlt geregelt. Essentiellen Proteine für Mikrotubulusbildung und Organisation notwendig zu lokalisieren, um Eizelle MTOCs, einschließlich γ-Tubulin, die Mikrotubuli Montage katalysiert. Zusätzlich Pericentrin Funktionen als wesentlichen Gerüstprotein, das bindet und Dübel γ-Tubulin, sowie andere Faktoren MTOCs 5. Insbesondere zeigen unsere Studien, daß Abreicherung Schlüssel MTOC-assoziierten Proteine stört meiotischen Spindel Organisation und führt zu Fehlern in der Chromosomensegregation Oozyten, die nicht vollständig durch die Spindelanordnung checkpoint (SAC) 6,7 gelöst sind. Daher Fehlern Spindel Stabilität, die Meiosehemmung nicht auslösen, ein erhebliches Risiko als Beitrag zu Aneuploidie. Trotz ihrer wesentliche Rolle bei der Spindelanordnung und Organisation, Eizelle MTOC protEin Zusammensetzung und Funktion bleibt kaum verstanden.
Testen der Funktion spezifischer Zielproteine in Säugetier Oozyten ist eine Herausforderung, da die Zellen transkriptionell Ruhe kurz vor der Wiederaufnahme der Meiose 8,9. Daher verlassen sich präovulatorischen Oozyten auf mütterliche mRNA speichert, um die Meiose wieder aufzunehmen und zu unterstützen Reifeteilung sowie die ersten Furchungsteilungen nach der Befruchtung 10,11. Die Wirksamkeit der RNA-Interferenz (RNAi) vermittelten Abbau der mRNA-Transkripte in Säuger Oozyten ist gut etabliert und Mütter RNAs für die Übersetzung während der meiotischen Reifung rekrutiert werden, um siRNA Targeting 12-14 besonders zugänglich. Daher stellt die Mikroinjektion von short interfering RNAs (siRNAs) in Oozyten einen wertvollen Ansatz für die Ziel-mRNAs für die Funktionsprüfung führen.
Hier werden Verfahren zur Isolierung von Maus-Oozyten und siRNA-vermittelte Abreicherung von spezifischen transcri beschreiben wirPunkte, die Funktion eines wesentlichen MTOC-assoziiertes Protein zu testen, Pericentrin. Darüber hinaus beschreiben wir Immunofluoreszenzanalyse Bedingungen meiotischen Spindelbildung in Oozyten zu bewerten.
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Protokoll
Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Universität von Georgia genehmigt.
1. Vorbereitungen
- Für Eizelle Kultur, Kauf oder frisch vorbereiten Minimal Essential Medium (MEM) und ergänzt mit 3 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA), wie in Tabelle 1 dargestellt. Legen Sie eine Polystyrol-Flasche auf einer Ladebilanz (Tara auf Null). Fügen Sie alle Reagenzien außer BSA, um und rufen Sie das Endvolumen mit MQ-Wasser-Gewichts auf insgesamt 250 g. Dann fügen Sie die BSA, zu ermöglichen, sich aufzulösen und Filter zu sterilisieren.
Anmerkung: Die beschriebene MEM Medium verlangt Äquilibrierung und Zell Inkubation mit einem medizinischen Gasgemisch aus 5% CO 2, 5% O 2 und 90% N 2. Jedoch können auch andere Medien (zB CZB) verwendet werden, die für die Zell Inkubation in 5% CO 2 unter Atmosphärenbedingungen zu ermöglichen. - Für Eizelle Mikroinjektion, Kauf oder zur Vorbereitung M2 Medium.
- Bereiten pregnant Stutenserum-Gonadotropin (PMSG) auf eine Konzentration von 5 IU / 100 ul.
- Kauf und wiederherzustellen siRNA Aktien auf eine Arbeitskonzentration von 1 uM.
2. Maus Eizellenentnahme
- TAG 1: Zur Stimulierung Ovarialfollikel Entwicklung und Erhöhung der Zahl der präovulatorischen Follikel, verwalten 5 IU PMSG intraperitoneal weiblichen Mäusen 48 Stunden vor der Eizellenentnahme.
- TAG 3: Für die Eizellenentnahme und Kultur, bis 35 mm Kulturschalen Set mit 3 ml MEM / BSA mit 1 ug / ml Milrinon ergänzt. Diese Phosphodiesterase-Hemmer unterhält die Eizellen in der Prophase-I festzunehmen und verhindert Keimbläschen Aufteilung (GVBD). Gleichgewicht kommen die Kulturschalen in einem medizinischen Gasgemisch für mindestens 15 min.
Hinweis: in ganz Eizellenentnahme sowie Eizelle Mikroinjektion und der 24-Stunden-Kultur Halteperiode Beitrag siRNA wird Milrinone ergänzt Medien erforderlich. - Abrufen Eierstöcke von den weiblichen Mäusen mit etablierten Laborpraxis 15 und Transfer zu einem neuen Kulturschale mit vorgewärmtem und ins Gleichgewicht gebracht MEM / BSA / Milrinon.
- Legen Sie die Kulturschale auf der Bühne eines Stereomikroskops für die Eizellenentnahme. Release Kumulus-Eizell-Komplexe (COCs) durch manuelles Punktieren der Antralfollikeln mit 27 G Nadeln. Befestigen einem Eierstock, um den Boden der Kulturschale mit einer 27 G-Nadel in eine 1 ml-Spritze angebracht ist, und mit einem zweiten Nadel um alle großen Follikeln stechen. Wiederholen Sie für jede Eierstock.
- Unter Verwendung von Standardverfahren Pipettieren mit dem Mund oder andere Mittel der Oozytenaspiration, sammeln Sie alle Eizellen, die von 2 oder mehr Schichten von kompakten Cumuluszellen umgeben sind. Übertragen Sie die COC auf ein neues Gericht und bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Die umgebenden Cumuluszellen durch wiederholte vorsichtiges Pipettieren Entfernen Sie vorsichtig mit einer 1 ml Pipette auf eine Aspiration Volumen von 750 & mgr; l eingestellt. Wiederholen Sie den Pipettierschritt etwa 12-malund ermöglichen die Oocyten für 5 min wiederherzustellen. Fahren Sie auf diese Weise fort, bis alle oder die meisten der Cumuluszellen entfernt wurden. Übertragen Sie die entblößt Eizellen zu einem anderen Kulturschale und lassen Sie sie bei 37 ° C für 15 Minuten ins Gleichgewicht kommen.
- (I) Mikroinjektion von spezifischen siRNAs gegen das Ziel von Interesse, (ii) Mikroinjektion von unspezifischen (Kontrolle) siRNAs und (iii) ein nicht-injizierten Kontrollgruppe zur Rechenschaft: Zuweisung der denudierten Oozyten in drei experimentellen Gruppen zu verwenden für Kulturbedingungen.
3. Oocyte Mikroinjektion
- Up-Kulturschalen mit 3 ml M2-Medium mit Milrinon (1 ug / ml) ergänzt zur Eizelle Mikroinjektion gesetzt. Bereiten Kulturschalen mit MEM / BSA / Milrinon zum Waschen und nachfolgende Kultur der injizierten Oozyten.
Anmerkung: M2 Medium HEPES-Puffer und erfordert Vorwärmen auf 37 ° C für 15 Minuten unter atmosphärischen Bedingungen. MEM erfordert Vorwärmen und Gleichgewichtseinstellung mit medizinischen Gasen, wie beschreiben,d oben. - Bereiten Sie die Mikroinjektionssystem. Laden die Injektionsnadel mit 5 ul von 1 uM spezifische siRNA Lösung. Sichern Sie die Haltepipette und Injektionsnadel, um Mikromanipulatoren der Mikroinjektionssystem und die Einspritzeinheit mit kalibrierten Volumen und Druck gesetzt.
- Legen Sie eine 200 & mgr; Mikro-Tropfen M2 Medien auf der Innenseite des Deckels einer 3 cm Kulturschale und füge eine Eizelle für die Einrichtung und die Ausrichtung der Mikroinjektionssystem.
- Unter Verwendung der Eizelle als Leitfaden, passen Sie die Positionen der Halte- und Injektionsnadeln. Übernehmen Unterdruck auf den Haltepipette vorsichtig sichern die Eizelle und die Position der Injektionsnadel mit dem breitesten Durchmesser der Zelle. Passen Sie die Einstellungen, um die Mikroinjektion von ca. 10 pl der siRNA-Lösung überall in die Eizelle Zytoplasma ermöglichen.
Abbildung 1. Oocyte Mikroinjektion einzurichten. ( A) repräsentative Bild eines 200 ul Mikrotropfen M2-Medium auf dem Deckel aus einer 3 cm Kulturschale angeordnet, wobei die Haltepipette und Injektionsnadel auf der linken bzw. rechten Seite angeordnet ist. (B) Prophase Gruppe-I festgenommen Oozyten (GV-Stufe) vor der Mikroinjektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. - Bringen Sie den Deckel mit dem Stereomikroskop Bühne und fügen Sie eine 200 & mgr; Mikro-Tropfen Frisch M2 Medien. Hinzufügen einer Gruppe von Oozyten (~ 10), um die Mikro-Tropfen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Verfahren, dann den Deckel mit Mikro-Tropfen in die Mikroinjektion der Bühne.
- Gehen Sie die einzelnen Eizellen microinject. Sichern einer Eizelle mit der Haltepipette langsam führen Sie die Spitze der Injektionsnadel in das Zytoplasma und vertreiben das Injektionsvolumen von siRNA-Lösung. Der Injektionsnadel und mo sorgfältig zurückzuziehenve des injizierten Oozyten zu einer Position am Boden des Mikrotropfen. Bewegen erfolglos injizierten Oozyten zu einer Position an der Spitze der Mikrotropfen.
- Wiederholen Sie den Mikroinjektionsverfahren mit jeder Eizelle. Um optimale Oozyte Lebensfähigkeit microinject nur eine kleine Anzahl von Oozyten zu einem Zeitpunkt zu erhalten. Dafür sorgen, dass dieser Vorgang nicht länger als ein paar Minuten auf die Temperatur und den pH-Wert in der Mikrotropfen zu verhindern.
- Saugen Sie Oozyten erfolgreich injiziert oder vorsichtig bewegen Sie den Deckel mit der Mikro-Tropfen injizierten Oozyten mit dem Stereomikroskop. Übertragen Sie die injiziert lebensfähigen Eizellen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Methoden, um / BSA / Milrinon Medium zu waschen und ins Gleichgewicht bei 37 ° C MEM.
- Mit einem weiteren Gruppe von Oozyten, wiederholen Sie den Mikroinjektionsverfahren mit einer neuen Injektionsnadel mit unspezifischen siRNAs für die Kontrollgruppe geladen. In eine separate Kulturschale Waschen Sie die Oozyten in MEM / BSA / Milrinon und Transfer.
- Kultur Alle GruppenOocyten für 24 h in MEM / BSA / Milrinon bei 37 ° C unter einer Atmosphäre eines medizinischen Gases.
Hinweis: Die 'Milrinon Block' Kulturzeit wird zur effizienten Ziel mRNA / Protein-Abbau benötigt wird.
4. Oocyte Kultur für Meiotische Reifung
- TAG 4: Für jede Versuchsgruppe von Eizellen Aufbau 4 Kulturschalen (35 mm) mit 3 ml MEM / BSA. Ergänzen Medien Teller pro Gruppe mit 10% (hochwertigen) fötalem Rinderserum (FBS), die für die Eizellreifung zu verwenden. Lassen Sie alle Kulturschalen bei 37 ° C mit medizinischen Gasgemisch ins Gleichgewicht.
- Eizellen von 'Milrinon Block' freigeben, der Reihe nach zu waschen die Oozyten dreimal in Schalen mit MEM / BSA und übertragen dann die Eizellen in die Reifungsschale, die Medien mit 10% FBS. Kultur Alle Oocyten Gruppen für 17 h bei 37 ° C, um die Wiederaufnahme der Meiose und der Progression zu ermöglichen.
- TAG 5: Bereiten Sie Lösungen für Eizelle fixation, einschließlich: (i) 4% Paraformaldehyd (PFA) in PEM-Puffer (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA) mit 0,5% Triton-X-100 und (ii) PBS, supplementiert mit 5 % FBS, die verwendet werden, um zu waschen und blockieren die Oozyten werden.
Anmerkung: Diese Lösungen erfordern Vorwärmen auf 37 ° C vor der Oozyte Fixierung. - Für Eizelle Fixierung (nach dem 17 Stunden-Kultur), zügig jeder Versuchsgruppe von Eizellen übertragen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Methoden in einzelnen Wells (eines 4-Well-Platte), die 750 ul vorgewärmtes 4% PFA-Lösung und bei 37 ° C für 1 Stunde. Anschließend jede Gruppe von Oozyten in 750 ul vorgewärmtes PBS, das 5% FBS 3x waschen (jeweils 15 min).
- Block Oocyten in 200 ul PBS / 5% FBS O / N bei 4 ° C unspezifische Antikörper zu minimieren bindend.
5. Immunfluoreszenzanalyse
- TAG 6:
Anmerkung: Die Immunfärbung in einer Multi-Well-Platte und dem OOC getanytes seriell sequenzielle Vertiefungen übertragen, die entsprechende Antikörper und Waschlösungen. Entweder 48 oder 96-Well-Platten verwendet werden kann, passen Sie einfach das Lösungsvolumen auf der Grundlage gut Größe. Für 96-well Platten verwenden 200 ul pro Vertiefung. - 3 Waschbrunnen - sekundäre Antikörperlösung - 3 Waschbrunnen primären Antikörperlösung: Die Eizellen werden auf die verschiedenen Lösungen in der folgenden Reihenfolge verteilt. Zur Belichtung kann die Platte mit Folie abgedeckt werden, zu begrenzen.
Bereiten Sie frische PBS / 5% FBS und die Nutzung dieser Lösung für Antikörperverdünnungen vorbereiten (zB Kaninchen-Anti-Pericentrin (1 / 1.000), Maus-Anti-Tubulin (1 / 1.000)). - Transfer der festen Oozyten jeder Versuchsgruppe in einzelne Vertiefungen, die 200 & mgr; l (oder 100 & mgr; l, wenn weniger Volumen gewünscht wird) der primären Antikörperlösung und der Abdeckung der Vertiefung mit Parafilm. Inkubieren nach optimalen antikörperspezifische Bedingungen (zB 37 ° C für 1 h, oder bei 4 ° CO / N).
Hinweis: Primärer Antikörper dilution sowie spezifische Inkubationszeit und -temperatur erfordern Tests, um die optimalen Bedingungen für verschiedene Antikörper verwendet, zu bestimmen. - Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper, wasche die Oocyten dreimal in PBS / 5% FBS (jeweils 10-15 Minuten).
- Übertragung der Oozyten in der Lösung, die fluoreszierend konjugierten Sekundärantikörper (zum Beispiel 1 / 1.000-Verdünnung von Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper mit Fluorochromen unterschiedlicher Wellenlänge konjugiert). Inkubation für 1 h bei 37 ° C.
- (- 15 Minuten je 10) dreimal in PBS / 5% FBS Waschen der Oozyten.
- Nach dem letzten Waschschritt, übertragen Sie die Oozyten auf einen sauberen Glasobjektträger und sanft saugen überschüssige Waschlösung. Dadurch werden die Oozyten auf der Glasoberfläche zu immobilisieren. In 8 ul Eindeckmittel (mit DAPI) und sorgfältig überlagern die Montage Medien mit einem 22 mm x 22 mm Deckglas. Senken Sie die Deck langsam zu vermeiden, Luftblasen und / oder Beschädigung der Oozyten.
Hinweis: Alternativ zu den 3-dimensionalen Eigenschaften von der Eizelle für die konfokale Mikroskopie-Analyse zu erhalten, fügen ein kleines Volumen von 100 & mgr; m Glasperlen (gemischt mit Vaseline) zu den Ecken des Deckglases vor der Befestigung auf der Folie. - Objektträger bei 4 ° C oder für die Beurteilung der meiotischen Progression sowie die Analyse der Expressionsspiegel und subzelluläre Lokalisierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den notwendigen Filtern ausgerüstet, um die sekundären Antikörper verwendet übereinstimmen fortzufahren.
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Ergebnisse
Mikroinjektion von siRNAs bietet einen effektiven Ansatz für die mRNA-Abbau und die anschließende Proteinabbau in Oozyten, die effiziente und hochspezifische Funktionsprüfung von unterschiedlichen Zielfaktoren in vitro ermöglicht. Anschließend wird Immunofluoreszenz für spezifische Phänotyp-Analyse verwendet sowie zur Proteinabbau in siRNA-injizierten Oozyten validieren. In dem aktuellen Beispiel Fluoreszenzmarkierung von einzelnen Oozyten, die mit DAPI zusammen mit Anti-Tubulin und Anti Pericentrin Antikörpern...
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Diskussion
Zwar gibt es verschiedene Methoden zur exogene Nukleinsäure-Transfer in somatischen Zellen, wie Elektroporation und Transfektion die Mikroinjektion ist die beste Methode für die Lieferung von RNA-Molekülen in transkriptionell ruhenden Maus-Oozyten. Das aktuelle Protokoll stellt einen effektiven Ansatz für in vitro-Abreicherung von spezifischen mRNAs, die die Funktionstests der verschiedenen Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oozyten zu aktivieren. Dieser Ansatz führt zu einer effizienten Transkrip...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen
Danksagungen
Diese Forschung wurde teilweise von der University of Georgia und einem Zuschuss (HD071330) der National Institutes of Health an MMV unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| Schwangere Stutenserum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Rezeptur in Tabelle 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Natrium Bicarbonat | Sigma | S-5761 | |
| Brenztraubensäure, Natriumsalz | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, Kaliumsalz | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycinsulfat | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamin | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, Dinatriumsalz-Dihydrat | Sigma | E-4884 | |
| Essentielle Aminosäuren (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM-Vitaminmischung (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenolrot-Lösung | Sigma | P-0290 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinon | Sigma | M4659 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Hyklon | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Medien mit Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs, die auf Pericentrin | Qiagen | abzielen GS18541 | |
| siRNAs mit negativer Kontrolle | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyd (16%ige Lösung) | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (Kaninchen) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetyliertes a-Tubulin (Maus) | Sigma | T-6793 | |
| Ziege Anti-Rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomikroskop (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluoreszierend Mikroskop | Leica Microsystems | ||
| Inverses Mikroskop | Nikon | ||
| Femtojet Mikroinjektionen System | Eppenforf | ||
| Mikromanipulatoren | Eppendorf | ||
| Mikroinjektionsnadeln (Femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Haltepipetten (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm Kulturschalen | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-Well-Platten | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96-Well-Platten | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0,45 mm CA Filtersystem | Corning Life Sciences | 430768 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
