Method Article

Entwicklung eines Backbone zyklische Peptid-Bibliothek als potentielle Antiparasiten Therapeutics unter Mikrowellenbestrahlung

DOI:

10.3791/53589

⸱

January 26th, 2016

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine einfache und allgemeine Methode zur Synthese von zyklischen Peptiden mittels Mikrowellenbestrahlung wird skizziert. Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese von zyklischen Peptiden des Rückgrats mit einer Sammlung verschiedener Konformationen unter Beibehaltung der Seitenketten und der pharmakophoren Einheiten und ermöglicht daher das Screening auf die bioaktive Konformation.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind in fast allen biologischen Prozessen eng verbunden und werden in vielen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Daher gibt es eine große Anstrengung, um die PPI in Grundlagenforschung und in der pharmazeutischen Industrie zu zielen. Protein-Protein-Schnittstellen sind in der Regel groß, flach und häufig nicht über Taschen, Verkomplizierung der Entdeckung kleiner Moleküle, die solche Stellen zielen. Alternative Targeting Ansätze unter Verwendung von Antikörpern weisen Beschränkungen aufgrund der schlechten oralen Bioverfügbarkeit, niedriger Zelldurchlässigkeit, und die Produktion Ineffizienz.

Verwendung von Peptiden zur PPI-Schnittstellen Ziel hat mehrere Vorteile. Peptide haben eine höhere Konformations Flexibilität, erhöhte Selektivität und sind in der Regel teuer. Allerdings haben Peptide ihre eigenen Grenzen einschließlich schlechte Stabilität und Ineffizienz Kreuzung Zellmembranen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, kann Peptidcyclisierung durchgeführt werden. Zyklisierung wurde gezeigt, dass Peptid-Selektivität zu verbessernMetabolische Stabilität und Bioverfügbarkeit. Die Vorhersage der bioaktiven Konformation eines zyklischen Peptids ist jedoch nicht trivial. Um diese Herausforderung zu meistern, um einen attraktiven Ansatz es Bildschirm eine fokussierte Bibliothek-Bildschirm, in dem alle Backbone zyklischen Peptide haben den gleichen Primärsequenz, unterscheiden sich aber in Parameter, die ihre Konformation beeinflussen, wie zum Beispiel Ring Größe und Position.

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Synthese einer Bibliothek von Backbone zyklischen Peptide auf bestimmte Parasiten EPI. Mit Hilfe eines rationalen Design-Ansatz entwickelten wir Peptide aus dem Gerüstprotein L eishmania Rezeptor für aktivierte C-Kinase (LACK) abgeleitet. Wir vermuten, dass Sequenzen in LACK in Parasiten konserviert sind, aber nicht in den Säugetierwirt homolog kann Interaktionsstellen für Proteine, die kritisch für den Parasiten Lebensfähigkeit darzustellen. Die zyklischen Peptide wurden unter Verwendung von Mikrowellenstrahlung, um die Reaktionszeiten zu reduzieren und die synthetisiertenEffizienz. Die Entwicklung einer Bibliothek von Backbone zyklischer Peptide mit unterschiedlichen Ringgrößen ermöglicht eine systematische Bildschirm für die meisten biologischen aktiven Konformation. Dieses Verfahren stellt eine allgemeine, schnelle und einfache Art und Weise die Synthese cyclischer Peptide.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) spielen eine zentrale Rolle in den meisten biologischen Prozesse, von der intrazellulären Signaltransduktion, Zelltod 1. Daher Targeting PPI ist von grundlegender Bedeutung für die Grundlagenforschung und therapeutische Anwendungen. PPIs durch spezifische und stabile Antikörper reguliert werden, aber Antikörper sind teuer und schwierig herzustellen und haben eine schlechte Bioverfügbarkeit. Alternativ kann PPI durch kleine Moleküle ausgerichtet werden. Kleine Moleküle sind einfacher zu synthetisieren und preiswert im Vergleich zu Antikörpern; jedoch sind sie relativ weniger flexibel und passen besser, kleine Hohlräume als großes Protein-Protein-Grenzflächen 2,3. Diverse Untersuchungen haben gezeigt, dass Peptide, die einfacher und billiger als Antikörper und flexibler als die kleine Moleküle sind, können Protein-Grenzflächen zu binden und zu regulieren PPIs 4,5. Die globale therapeutische Peptidmarkt wurde um 15 Milliarden US-Dollar im Jahr 2013 geschätzt und wächst um 10,5% annually 6. Darüber hinaus gibt es mehr als 50 vertrieben Peptide, etwa 270-Peptide in verschiedenen Phasen der klinischen Prüfung, und etwa 400 Peptide in fortgeschrittenen präklinischen Phasen 7. Obwohl zahlreiche Peptide werden als Arzneimittel verwendet werden, Peptide stellen noch einige Herausforderungen, die ihre weitverbreitete Anwendung, einschließlich schlechte Bioverfügbarkeit und Stabilität, Ineffizienz im Kreuzungs Zellmembranen und Konformationsflexibilität 8,9 zu begrenzen. Eine Alternative, diese Nachteile zu überwinden, ist es, verschiedene Modifikationen wie lokale (D-Aminosäure und N-Alkylierung) oder global (Cyclisierung) 8,10-12 Einschränkungen gelten. Diese Modifikationen auch natürlich vorkommen. Beispielsweise Cyclosporin A, ein Immunsuppressivum cyclischen natürliches Peptid, enthält ein einzelnes D-Aminosäure und erfährt eine N-Alkylierung Modifikationen 13,14.

Modifikation der natürlichen Aminosäuren lokalen Beschränkungen, wie zum Beispiel D- und N-Alkylierung zu induzieren, oft auf die Peptid9; s biologische Aktivität. Jedoch Cyclisierung, bei der die Sequenz von Interesse gleich bleiben kann, wird eher die biologische Aktivität zu bewahren. Cyclisierung ist eine sehr attraktive Möglichkeit, Peptid Konformationsraum durch Verringerung das Gleichgewicht zwischen verschiedenen Konformationen zu beschränken. Sie erhöhen in der Regel der biologischen Aktivität und Selektivität durch die Beschränkung des Peptids an der aktiven Konformation, die nur eine Funktion vermittelt. Cyclisierung verbessert auch die Stabilität der Peptide, indem das Peptid in einer Konformation, die weniger durch abbauende Enzyme erkannt wird. Tatsächlich wurden zyklische Peptide gezeigt, metabolische Stabilität, Bioverfügbarkeit und die Selektivität verbessert werden im Vergleich zu ihren linearen Gegen 15-17 haben.

Jedoch kann die Cyclisierung ein zweischneidiges Schwert, da in einigen Fällen die Einschränkung können die Peptide von der Erreichung eines bioaktiven Konformation verhindern. Um diese Hürde zu überwinden, eine fokussierte Bibliothek, in der alle Peptide haben die gleiche Grund SequencE und demzufolge konstant Pharmakophore synthetisiert werden. Peptide in der Bibliothek unterschiedlich Parameter, deren Struktur zu beeinflussen, wie Ringgröße und der Position, um in der Folge Bildschirm für die meisten bioaktiven Konformation 9,18.

Peptide können in Lösung und durch eine Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) Ansatz, der jetzt die häufiger Peptidsyntheseansatz und wird weiter diskutiert werden, synthetisiert werden. SPPS ist ein Prozess, durch den chemischen Umwandlungen sind auf einem festen Träger über einen Linker durchgeführt, um eine breite Palette von synthetischen Verbindungen 19 vorzubereiten. SPPS ermöglicht Zusammenbauen Peptiden durch aufeinanderfolgende Kopplung der Aminosäuren in einer stufenweise vom C-Terminus, die an einen festen Träger gebunden ist, an den N-Terminus. Die N-α-Aminosäure-Seitenketten sind mit Schutzgruppen, die in den während Peptidelongation verwendeten Reaktionsbedingungen stabil sind, die Zugabe einer Aminosäure pro st sicherzustellen maskierendenep. Im letzten Schritt wird das Peptid vom Harz gelöst und die Seitenketten-Schutzgruppen werden gleichzeitig entfernt. Während das Peptid, das synthetisiert wird, können alle löslichen Reagenzien aus dem Peptid-feste Trägermatrix durch Filtration entfernt und weg am Ende jedes Kopplungsschritt gewaschen werden. Mit einem solchen System kann ein großer Überschuß an Reagenzien in hoher Konzentration Kupplungsreaktionen zum Abschluss zu bringen und alle Syntheseschritte können in demselben Behälter ohne Übertragung von Material 20 durchgeführt werden.

Obwohl SPPS hat einige Einschränkungen, wie beispielsweise der Herstellung von unvollständigen Reaktionen, Nebenreaktionen, unreinen Reagenzien, sowie Schwierigkeiten Überwachung der Reaktion 21, haben die Vorteile der SPPS es der "Goldstandard" für die Peptidsynthese hergestellt. Zu diesen Vorteilen gehören die Möglichkeit, nicht-natürliche Aminosäuren, Automatisierung, einfache Reinigung zu integrieren, minimiert physikalische Verluste und die Verwendung von überschüssigen Reagenzien, was zuhohe Erträge. SPPS ist gezeigt worden, sehr nützlich bei der Synthese von schwierigen Sequenzen 21,22 fluoreszierenden Modifikationen 23 und Peptidbibliotheken 24,25 sein. SPPS ist auch sehr nützlich für andere poly-Kettenanordnungen wie Oligonukleotide 26,27, 28,29 Oligosaccharide und Peptidnucleinsäuren 30,31. Interessanterweise ist in einigen Fällen gezeigt wurde SPPS zur Synthese kleiner Moleküle, die traditionell in der Lösung 32,33 bestehen vorteilhaft. SPPS wird sowohl im kleinen Maßstab für Forschung und Lehre 34,35 als auch im großen Maßstab in der Industrie 36-38 verwendet.

Zwei Synthesestrategien, die hauptsächlich in SPPS Methodik für die Synthese von Peptiden verwendet werden, sind Butyloxycarbonyl (Boc) und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). Die für SPPS eingeführt ursprüngliche Strategie war Boc, die stark sauren Bedingungen erfordert, um Seitenketten aus dem R-Schutzgruppen zu entfernen und spalten das PeptidEsin. Fmoc-basierte Peptidsynthese verwendet jedoch mäßige Basiszustand und ist eine mildere Alternative zu dem säurelabilen Boc-Protokoll 39. Die Fmoc-Strategie nutzt orthogonalen t-Butyl (tBu) Seitenkettenschutz, der in der letzten Stufe der Synthese entfernt wird, während Abspaltung des Peptids vom Harz unter sauren Bedingungen.

Das allgemeine Prinzip für die Peptidsynthese am festen Träger ist in Figur 1 dargestellt. Die anfängliche Aminosäure, durch eine temporäre Schutzgruppe an dem N-α-Terminus maskiert wird an das Harz von dem C-Terminus geladen. Eine semi-permanente Schutzgruppe, um die Seitenkette zu maskieren ist auch, falls erforderlich (Figur 1, Schritt 1) verwendet wird. Die Synthese des Zielpeptides aus dem C-Terminus mit dem N-Terminus durch wiederholte Zyklen von Entschützen der N-α-temporären Schutzgruppe (1, Schritt 2) und Kopplung der nächsten geschützten Aminosäure (1 gebaut ong>, Schritt 3). Nach der letzten Aminosäure wird geladen (1, Schritt 4), wird das Peptid vom Harzträger abgespalten und die semi-permanente Schutzgruppen entfernt (Abbildung 1, Schritt 5).

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Figur 1. Allgemeines Schema der Festphasenpeptidsynthese. Die N-α-geschützten Aminosäure unter Verwendung der Carboxylgruppe über einen Linker an dem Harz (Schritt 1) verankert ist. Das gewünschte Peptid in einer linearen Weise vom C-Terminus zum N-Terminus durch wiederholte Zyklen von Entschützen der temporären Schutzgruppe (TPG) von dem N-α (Schritt 2) und Aminosäurekupplung (Schritt 3) zusammengesetzt. Nach der Durchführung der Synthese (Schritt 4) werden die semi-permanenten Schutzgruppen (SPG) während der Peptidspaltung (Schritt 5) entschützt.bekommen = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Nach Montage der kompletten Peptidkette kann Cyclisierung durch mehrere Alternativen erreicht werden: (A) Kopf-Schwanz-Cyclisierung - dies ist ein bequemer Weg, aber begrenzt, da es nur eine Option für die Cyclisierung (2A), (B) Cyclisierung bietet Verwendung der Aminosäuren aus der Sequenz von Interesse, die biologisch aktive funktionelle Gruppen enthalten - jedoch die Verwendung dieser Aminosäuren können die biologische Aktivität (2B) und (C) die Cyclisierung durch Zusatz von Aminosäuren (oder anderen Bausteinen) ohne störenden Einfluss das bioaktive Sequenz. Einführung dieser Moleküle ist weit verbreitet, da es ermöglicht die Herstellung von konzentrierten Bibliotheken ohne Änderung der Sequenz von Interesse (2C).

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FBBILDUNG 2. Alternative Peptidcyclisierung Strategien (A) Kopf-Schwanz-Cyclisierung, durch eine Peptidbindung zwischen dem C-Terminus und N-Terminus. (B) Cyclisierung zwischen funktionellen Gruppen, wie eine Disulfidbindung zwischen Cysteinresten (1) oder einer Amidbindung zwischen den Seitenketten von Lysin Asparaginsäure / Glutaminsäure (2) oder der Seitenkette in N- oder C-Terminus (3 -4); (C) Cyclisierung durch das Hinzufügen zusätzlicher Aminosäuren oder Aminosäurederivate oder kleine Moleküle, beispielsweise vor (R0) und nach (R7) die bioaktive Sequenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Mikrowellen-unterstützte Synthese nutzt Mikrowellenbestrahlung, um Reaktionen zu erwärmen, und beschleunigt so organische chemische Umwandlungen 40,41. Mikrowellenchemie basiert auf der Fähigkeit des Reagens / Lösemittel zum absorbieren basierendMikrowellenenergie und wandeln sie in Wärme um 42. Bevor die Technologie verbreitet wurde, hatte gravierende Nachteile zu überwinden, einschließlich der Steuerbarkeit und Reproduzierbarkeit der Syntheseprotokolle und der Mangel an geeigneter Systeme zur Temperatur- und Drucksteuerungen 43,44. Der erste Bericht über die mikrowellenunterstützte Peptidsynthese wurde unter Verwendung eines Küchenmikrowellen mehrere kurze Peptide zu synthetisieren (7-10 Aminosäuren) mit signifikanten Verbesserung der Kopplungseffizienz und die Reinheit 45 getan. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Mikrowellenenergie Kettenaggregation zu verringern, reduzieren Nebenreaktionen, Racemisierung zu beschränken, und zur Verbesserung der Kopplungsraten, die alle entscheidend für die schwierige und lange Sequenzen von 46 bis 53 sind.

Gegenwärtig ist die Verwendung von Mikrowellenstrahlung für die Synthese von Peptiden oder verwandten Verbindungen auf einem festen Träger ist umfangreich, einschließlich (A) Synthese in Wasser anstelle des organischen Lösungsmittels 54; (B) Synthese von Peptiden mitgemeinsame posttranslationale Modifikationen wie Glycopeptide 55-58 oder 59-61 Phosphopeptide, dessen Synthese ist in der Regel schwierig, aufgrund der geringen Kopplungseffizienz von sterisch gehinderten Aminosäurederivate; (C) Synthese von Peptiden mit einer Modifikation in der Hauptkette, wie Azapeptiden, die durch den Austausch der C (α) eines Aminosäurerests mit einem Stickstoffatom 62 oder Peptoide, dessen Seitenkette ist mit der gebildet werden kann, Amidstickstoff anstelle des C & alpha Atom 63,64; (D) Synthese von cyclischen Peptiden 65-71; und (E) Synthese von kombinatorischen Bibliotheken 51,72. In zahlreichen Fällen die Autoren berichteten höheren Wirkungsgrad und geringere Synthesezeit unter Mikrowellenbestrahlung im Vergleich mit dem herkömmlichen Protokoll.

Mit Hilfe eines rationalen Design 73-75, Anti-Parasiten-Peptide, die vom Gerüst L eishmania des Rezeptors fo abgeleitet wurden, entwickelten wirr aktiviert C-Kinase (LACK). LACK spielt eine wichtige Rolle in der frühen Phase der Infektion mit Leishmanien 76. Parasiten ausdrücken unteren Ebenen der LACK nicht einmal, auch immungeschwächten Mäusen parasitieren 77 als LACK ist in wesentlichen Parasiten Signalprozessen und Proteinsynthese 78 beteiligt. Daher ist LACK ein Schlüsselgerüstprotein 79 und ein wertvolles Medikament Ziel. Sich auf Sequenzen in LACK, die in den Parasiten konserviert sind, aber nicht in der Wirts Säugerhomolog RACK, identifizierten wir eine 8-Aminosäuren-Peptid (RNGQCQRK), welche Leishmania sp. Lebensfähigkeit in Kultur verringert.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von cyclischem Gerüst Peptide aus dem oben beschriebenen LACK Proteinsequenz abgeleitet. Die Peptide wurden auf einem festen Träger unter Verwendung von Mikrowellenheizung durch SPPS Methodik mit Fmoc / tBu-Protokolls synthetisiert. Peptide wurden in einen TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) Trägerpeptid über eine Amidbindung als konjugiertesTeil der SPPS. TAT-basierten Transport einer Vielzahl von Ladungen in die Zellen ist seit über 15 Jahren verwendet, und die Lieferung der Ladung in subzellulären Organellen wurde bestätigt, 80. Vier verschiedenen Linkern, Bernstein- und Glutarsäureanhydrid sowie Adipin- und Pimelinsäure, wurden verwendet, um die Cyclisierung durchzuführen, um Carbonsäure-Linker von zwei bis fünf Kohlenstoffatomen zu erzeugen. Zyklisierung wurde unter Verwendung von Mikrowellenenergie durchgeführt, und die abschließende Abspaltung und Seitenketten-Gruppenoperationen manuell ohne Mikrowellenenergie erfolgt. Die Verwendung eines automatischen Mikrowellen-Synthesizer verbessert die Produktreinheit, erhöht die Produktausbeute und verringert die Dauer der Synthese. Dieses allgemeine Protokoll kann zu anderen Studien, die Peptide zu verwenden, um wichtige molekulare Mechanismus in vitro und in vivo zu verstehen und weiterzuentwickeln potentielle Arzneimittel für menschliche Krankheiten verwendet werden.

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Protocol

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1. Geräte und Reagenzien Vorbereitung

  1. Vorbereiten der Geräte
    1. Führen Sie alle Schritte innerhalb einer Abzugshaube unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.
    2. Chemisch synthetisieren Peptide auf einem festen Träger unter Verwendung einer Mikrowelle Peptide Synthesizer mit einem zusätzlichen Modul Discover mit einem faseroptischen Temperaturfühler ausgestattet zur Steuerung der Mikrowellenleistungsabgabe in einem Teflon-Reaktionsgefäß (30 ml, mit einer Glasfritte) oder in einem Einweg-Polypropylen Patrone (12 ml, mit einer groben Fritte).
    3. Für die richtige Mischung, schließen Stickstoffzufuhr in den Reaktionsbehälter oder alternativ zu versiegeln die beiden Enden des Polypropylen-Kassette, und legen Sie auf einem Rotationsschüttler.
    4. Um Reaktionsgemische oder Waschungen Drain, an den Hausvakuum zu verbinden über ein Siphon.
    5. Platzieren der faseroptischen Sonde in das Reaktionsgefäß.
  2. Vorbereiten Reagenzien
    1. Bereiten Sie das Harz durch Wiegen Rink-Amid AM Harz 100-200 mesh (0,204 mg), 5 ml 1: 1-Mischung von N, N-Dimethylformamid (DMF) / Dichlormethan (DCM) in das Reaktionsgefäß / Polypropylen-Patrone, um das Harz nach unten zu waschen, schütteln Sie für 2-4 Stunden, um richtig anschwellen, und abtropfen lassen.
    2. Vorbereitung 0,2 M 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) amino-Säure-Lösungen durch Auflösen der entsprechenden Fmoc-Aminosäure in DMF und Vortex der Mischung, bis die Aminosäuren, gelöst (Tabelle 1).
    3. Vorzubereiten 0,45 M Aktivatorlösung Mischung durch Lösen von 18.96 g O - (Benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) in 100 ml DMF und Verwirbeln der Mischung, bis der Feststoff gelöst ist (Tabelle 1).
    4. Vorzubereiten 2 M Aktivator Basenlösung Gemisch durch Kombinieren 34,8 ml N, N-Diisopropylethylamin (DIEA) mit 65.2 ml 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) (Tabelle 1).
    5. Vorbereitung 0,1 M Lösung Entschützung Mischung durch Lösen von 3,37 g 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)in 250 ml einer 20% v / v Lösung von Piperidin in DMF und Verwirbeln der Mischung, bis der Feststoff gelöst ist (Tabelle 1).

2. Fmoc-geschützten Aminosäure Kupplung

  1. Aminosäure-Kopplung
    1. In Aminosäure (2,5 ml) / Aktivator (1 ml) / Aktivator-Basis (0,5 ml) zum Reaktionsgefäß / Polypropylen-Kassette und ließ die Reaktion ablaufen zu 300 Sekunden (25 W, 75 ° C, Tabelle 2). Entleeren Sie die Lösung.
    2. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, RT) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.
  2. Fmoc-Abspaltung
    1. 7 ml 20% Piperidin in DMF mit 0,1 M HOBt Reaktionsgefß / Polypropylen-Patrone und Inkubation für 30 sec (45 W, 75 ° C, Tabelle 2).
    2. Lassen Sie das Reaktionsgemisch.
    3. In 7 ml 20% Piperidin in DMF mit 0,1 M HOBt, um Reaktionsgefäß / Polypropylen-Kassette und Inkubation für 180 Sekunden (45 W75 ° C, Tabelle 2).
    4. Lassen Sie das Reaktionsgemisch.
    5. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.
      Hinweis: Optional können Sie hier den Vorgang unterbrechen und wieder zu einem späteren Zeitpunkt.
  3. Nach Aminosäure Kopplungsschritt das Harz mit DCM und Speicher für mindestens mehrere Tage bei 4 ° C (für eine längere Zeitspeicher des Harzes bei - 20 ° C).
    1. Bewegen des Harzes aus dem Reaktionsgefäß auf eine Polypropylenkartusche.
    2. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
    3. Verschließen Sie den Polypropylenkartusche fest mit einem oberen Deckel und Hahn.
    4. Vor dem Start einer neuen Synthese, schwellen des Harzes für 3-4 h in DMF (7 ml).
  4. Überwachung der Synthese
    1. Verwenden Sie den Kaiser (Ninhydrin-Test) oder Chloranil-Test, um den Fortschritt der schnell festzustellen,Synthese. Optional führen eine kleine Spaltreaktion, um die Reinheit und die Masse der synthetisierten Peptids zu bestimmen. Siehe Abschnitt 9.
      Hinweis: Weitere Hinweise zur Fehlerbehebung finden Sie in Tabelle 3.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2, wie gewünscht, um gezielte Peptid zu synthetisieren: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anhydrid / Säure-Kopplung

  1. Anhydrid-Kopplung
    1. Das Harz mit NMP. In NMP zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
    2. Auflösen 10 Äquivalenten des entsprechenden Anhydrids in NMP (5 ml) wird mit 1 Äquivalent 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 10 Äquivalenten DIEA in die Lösung (Tabelle 1).
    3. Fügen Sie einen 10: 1: 10-Gemisch von Anhydrid / DMAP / DIEA zum Harz und Inkubation für 300 Sekunden (25W, 75 ° C, Tabelle 2). Entleeren Sie die Lösung.
    4. Das Harz mit NMP. In NMP zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
  2. Säurekupplungs
    1. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
    2. Auflösen 10 Äquivalenten der entsprechenden Dicarbonsäure in DMF (5 ml). 1 Äquivalent DMAP und 10 Äquivalente N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) zu der Lösung (Tabelle 1).
    3. Pre-Aktivierung der Mischung durch Mischen für 30 min.
    4. Fügen Sie die Mischung auf dem Harz und Inkubation für 300 Sekunden (25 W, 75 ° C, Tabelle 2) und lassen Sie das Lösung.
    5. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und Drain-Lösung. Wiederholen Sie Schritt dreimal.

4. N-Methyltrityl (MTT) Schutzgruppe entschützenIon

Hinweis: Der Lysin-Seitenkette mit N-Methyltrityl (Mtt) 81, eine Schutzgruppe, die selektiv unter sauren Bedingungen labil 82,83 entschützt werden können, geschützt. Entschützen Mtt Schutzgruppe manuell auf einem Schüttler ohne Mikrowellenenergie.

  1. Übertragen Sie das Harz auf eine Polypropylen-Kassette mit Deckel Stecker und Hahn ausgestattet.
  2. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
  3. Hinzufügen 15-25 ml einer Mischung aus 1% Trifluoressigsäure (TFA), 5% Triisopropylsilan (TIS) und 94% DCM in der Polypropylenkartusche pro Gramm Harz.
    Anmerkung: TFA ist eine starke Säure und korrosiven und ist äußerst reizend für die Haut, Augen und Lungengewebe.
    1. Halten konzentrierten Lösungen von TFA in der Haube zu allen Zeiten.
    2. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe) und die Arbeit in einem gut belüfteten Haube. Handschuhe wechseln promptwenn sie in Kontakt mit TFA und unmittelbar Rein Verschüttetes. Wenn Haut oder Augen in Kontakt mit der Säure die betroffenen Stellen sofort mit Wasser und waschen Sie für weitere 15 Minuten.
  4. Setzen Sie den Polypropylenkartusche auf einem Schüttler und schütteln für 5 min bei RT.
  5. Abfluss der Lösung aus dem Polypropylenkartusche durch Anlegen von Vakuum.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4,3 bis 4,5, dreimal.
  7. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.

5. Die Cyclisierung des linearen Peptids

  1. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.
  2. In einem 50 ml-Polypropylenröhrchen, aufzulösen 5 Äquivalenten Benzotriazol-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) in Dibrommethan (DBM, 5 ml) und füge 10 Äquivalenten DIEA in die Lösung (Tabelle 1).
  3. Fügen Sie die Mischung auf dem Harz und Inkubation für 300 Sekunden (25 W, 75 ° C, Tabelle 2). Entleeren Sie die Lösung.
  4. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.

6. Abspaltung und Entschützung der Seitenkettengruppen

  1. Mit DCM und Diethylether Waschen des Harzes.
    1. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie zweimal.
    2. Zugabe von Diethylether zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, RT) und Drain die Lösung. Wiederholen Sie zweimal.
  2. Trocknen des Harzes im Vakuumtrockenschrank bei RT für mindestens 3 h über Kaliumhydroxid (KOH, 1-10 g).
  3. Wiegen Sie das getrocknete Harz und überträgt es auf einem Polypropylen-Patrone.
  4. 10 ml einer vorgekühlten Trifluoressigsäure (TFA) Spaltungscocktails (zB 90% TFA, 2,5% Wasser, 2,5% TIS und 5% Phenol) zu jedem Gramm Harz.
  5. Schütteln 3 hbei RT.
  6. Sammeln des TFA Spaltungslösung durch Filtrieren des Harzes in einem 50 ml Polypropylenröhrchen. Für die Filtration, verwenden Sie die Fritte, die in der 12 ml-Polypropylen-Kassette.
  7. Mit kaltem Diethylether (35 ml) zu dem Rohr.
  8. Zentrifuge für 5 Minuten bei 1.207 × g bei 4 ° C.
  9. Dekantiert man die Ether-Schicht.
  10. Wiederholen Sie Schritt 6,7 bis 6,9, fünf Mal.

7. Trocknen der Backbone zyklische Peptid

  1. Halten Sie das ausgefällte Peptid in derselben Röhre und trocknen Sie sie in einer Haube für 30 min.
  2. Auflösen des Peptids in einem 1: 1 Gemisch aus Wasser und Acetonitril (ACN).
  3. Frieren Sie das Endprodukt-Lösung in flüssigem Stickstoff.
  4. Lyophilisieren Endprodukts.

8. Charakterisierung der Backbone zyklische Peptid

  1. Aufzulösen eine kleine Probe (1 mg) des Produkts in Wasser (400 ul).
  2. Spritzen Sie die gelöste Peptid (10-200 ul) auf eine Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-chromatography (RP-HPLC-System), um die Reinheit des Peptids 34 zu testen.
  3. Überprüfen Sie die Masse des Peptids unter Verwendung von Massenspektrometrie matrix-unterstützte Laser-Desorption Ionisation (MALDI-MS) 84.
    1. Mix 1 & mgr; l (100 & mgr; M) -Peptid in einer 1: 1 (v / v) Gemisches aus Acetonitril: Wasser mit 1 & mgr; l Matrix (5 mg / ml, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) in einem 1: 1 (v / v) Mischung aus Acetonitril: Wasser mit TFA (0,1%).
    2. Spot 1 & mgr; l auf der MS-MALDI-Platte.
    3. Trocknen Sie die Probe und legen Sie sie in das Massenspektrometer.
  4. Wiegen Sie das Peptid und berechnen Sie die prozentuale Ausbeute.
  5. Lagerung bei -20 ° C.

9. Überwachung der Synthese

  1. Kaiser (Ninhydrin-Test) 85
    1. Bereiten Sie die Reagenzienlösungen.
      1. Vorbereitung der Lösung A durch Auflösen von 16,5 mg Kaliumcyanid (KCN) in 25 ml destilliertem Wasser. Verdünnen von 1 ml der obigen Lösung und mit 49 ml Pyridin.
      2. Bereiten Lösung Bdurch Auflösen von 1 g Ninhydrin in 20 ml Ethanol.
      3. Vorbereitung der Lösung C durch Lösen von 40 g Phenol in 20 ml Ethanol gelöst.
    2. Verwenden Sie die Kaiser-Test, um die Fertigstellung der Aminosäurekupplung oder die Abspaltung der Schutzgruppe zu überprüfen.
      1. Bringen Sie ein paar Perlen aus dem Harz in ein Reagenzglas.
      2. In drei Tropfen (~ 100 & mgr; l) jeder Lösung (A, B und C) und mischen.
      3. Erhitzen das Reagenzglas auf einem Heizblock bei 110 ° C für 5 min.
        Hinweis: Blau farbigen Perlen (positives Ergebnis) zeigen unvollständige Kopplungsreaktion oder Entschützung der Fmoc-Schutzgruppe.
  2. Chloranil-Test 86
    1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien frisch für jeden Test.
      1. Bereiten Sie eine Lösung von 2% Chloranil in DMF-Lösung A.
      2. Es wird eine Lösung von 2% Acetaldehyd in DMF Lösung B.
    2. Führen Sie die Chloranil-Test, um die Fertigstellung der Aminosäurekupplung oder t zu überprüfener Abspaltung der Schutzgruppe.
      1. Mischungs 100 ul Lösung A mit 100 ul der Lösung B in einem 1,5-ml-Röhrchen.
      2. Lassen Sie die Perlen in und schütteln für 5 min.
        Hinweis: Dunkelbraun farbigen Perlen (positives Ergebnis) zeigen Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe oder eine unvollständige Kupplung.
  3. Kleinen Maßstab Spaltungsreaktion
    1. Entfernen Sie eine kleine Menge des Harzes auf eine 3 ml-Polypropylen-Kassette mit Deckel Stecker und Hahn ausgestattet.
    2. Behandlung mit einer 2 ml-Gemisch von 95% TFA, 2,5% Wasser und 2,5% TIS.
    3. Schüttelt das Gemisch 30 min bei RT.
    4. Entfernen des Harzes durch Filtration mit der Fritte des Polypropylenkartusche und die Lösungsmittel werden verdampft durch einen Strom von Stickstoff.
    5. Der Rückstand wird in Wasser und Analyse des Produkts mittels HPLC und / oder MS.

10. Leishmania donovani-Promastigoten Lebensfähigkeit in Kultur Assay

  1. Leishmania donovani (L. donovani) Wachstum und Behandlungsbedingungen
    1. Kultur L. donovani-Promastigoten in Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g / l Glucose, L-Glutamin und Natriumpyruvat bei 26 ° C.
    2. Behandeln Sie die L. donovani-Promastigoten mit cyclischen Peptiden (100 & mgr; M) für 24 Stunden bei 26 ° C.
  2. Leishmania donovani (L. donovani) Lebensfähigkeitstest
    1. Beurteilen Parasiten Lebensfähigkeit mit 20 ul alamarBlue nach dem Protokoll des Herstellers.
    2. Bestimmen alamarBlue Reduktion durch Messung der Fluoreszenz (bei 570 nm Anregung und 590 nm Emission). Höhere Fluoreszenz-Werte zeigen höhere Stoffwechselaktivität und erhöhte Parasitenlebensfähigkeit.

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Results

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Hier beschreiben wir die Entwicklung einer fokussierten kleine Bibliothek von Backbone zyklische Peptide, die speziell auf lebenswichtige PPIs des Leishmania Parasiten und fungieren als Antiparasitika (für einen Überblick über Peptide, die PPI als Antiparasitika 87 Ziel). Durch die Synthese neuartiger Rückgrat zyklischen Peptide sind Pharmakophore in einem Gerüst von ausfahrbaren Größe konserviert. Die Stärke der fokussierten Bibliothek hier vorgeschlagen wird, ist die Fähigkeit, Peptidgerüst Größen ...

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Discussion

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Die Synthese einer fokussierten Bibliothek Rückgrat aus dem Mangel Protein der Leishmania-Parasiten mit einem vollständig automatisierten Mikrowellen-Synthesizer abgeleitet cyclische Peptide beschrieben. Ein fokussierter Bibliothek zyklischer Peptide wurde mit konservierten Pharmakophore und verschiedene Linker entwickelt. Zugabe verschiedener Linker wie Glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Adipinsäure, Pimelinsäure, Lysin, Ornithin und andere Bausteine ​​verwendet werden, um die Vielfalt einer der Konf...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Wir danken Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang und Daria Mochly-Rosen für hilfreiche Diskussionen. Die Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) unterstützt, um NQ Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Erstellung des Manuskripts.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENZIEN
Fester Träger, Rink Amide AM Harz MLCBLBR-1330Beladung: 0,49 mmol/g
Fmoc-Ala-OHAdvanced ChemtechFA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OHAdvanced ChemtechFR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OHAdvanced ChemtechFN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OHAdvanced ChemtechFD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OHAdvanced ChemtechFC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OHAdvanced ChemtechFQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OHAdvanced ChemtechFE2237
Fmoc-Gly-OHAdvanced ChemtechFG2275
Fmoc-His(Trt)-OHAdvanced ChemtechFH2316
Fmoc-Ile-OHAdvanced ChemtechFI2326
Fmoc-Leu-OHAdvanced ChemtechFL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OHAdvanced ChemtechFK2390
Fmoc-Met-OHAdvanced ChemtechFM2400
Fmoc-Phe-OHAdvanced ChemtechFF2425
Fmoc-Pro-OHAdvanced ChemtechFP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OHAdvanced ChemtechFS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OHAdvanced ChemtechFT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OHAdvanced ChemtechFW2527
Fmoc-Tyr(But)-OHAdvanced ChemtechFY2563
Fmoc-Val-OHAdvanced ChemtechFV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP)Sigma328634Vorsicht giftig/leicht entzündlich/reizend.
N,N-Dimethylformamid (DMF)Alfa Aesar43465Vorsicht Giftig.
Verwenden Sie hochwertiges DMF, um Nebenreaktionen wie die Femoc-Entfernung infolge der Dimethylaminspuren aus der DMF-Zersetzung zu eliminieren.
Dichlormethan (DCM)SigmaD65100Vorsicht gesundheitsschädliches
Dibromethan (DBM)SigmaD41868Vorsicht gesundheitsschädliche
Trifluoressigsäure (TFA)SigmaT62200Vorsicht Ätzende/giftige
Trifluoressigsäure, HPLC-Qualität (TFA)Sigma91707Vorsicht Ätzender/giftiger
DiethyletherSigma31690Vorsicht Leicht entzündliches/gesundheitsschädliches
Triisopropylsilan (TIS)Sigma233781Vorsicht Reizendes/entzündliches
Wasser, HPLC-QualitätSigma270733
Acetonitroil, HPLC-Klasse (ACN)Fisher WissenschaftlichA998-4Vorsicht Entzündlich/Reizend/gesundheitsschädlich
N,N-Diisopropylethylamin (DIEA)Sigma3440Vorsicht Ätzend/leicht entzündlich
PiperidinSigmaW290807Vorsicht giftig/leicht entzündlich
Pyridin Sigma270970Vorsicht Leicht entzündliches/gesundheitsschädliches
Ethanol (EtOH)Sigma459844Vorsicht Leicht entzündlich/reizend
1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (HOBt)Sigma157260Vorsicht Leicht entzündlich/Reizend/gesundheitsschädlich
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′ - Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU)Sigma12804Vorsicht Reizend/gesundheitsschädlich
Benzotriazol-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP)Advanced ChemtechRC8602Vorsicht Reizend
NinhydrinSigma454044Vorsicht Gesundheitsschädlich
PhenolSigma P3653Vorsicht Korrosives/giftiges
Kaliumcyanid (KCN)Sigma11813Vorsicht Sehr giftiges
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma221473Vorsicht Giftig
N,N" -Diisopropylcarbodiimid (DIC)Sigma38370Vorsicht Entzündlich/ giftig
4-Dimethylaminopyridin (DMAP)Sigma522805Vorsicht giftig/reizend
GlutarsäureanhydridSigmaG3806Vorsicht Entzündlich/reizend/gesundheitsschädlich
BernsteinsäureanhydridSigma239690Vorsicht Reizend/gesundheitsschädlich
AdipinsäureSigmaA26357Vorsicht giftig/reizend
PimelsäureSigmaP45001Vorsicht giftig/reizend
ChloranilSigma23290Vorsicht giftig/reizend
AcetaldehydSigma402788Vorsicht Entflammbar<
stark>AUSRÜSTUNG
ZentrifugeBeckman CoulterAllegra 6R Zentrifuge
LyophilisiererLabconcofreezone 4.5
VakuumpumpeFranklin ElectricModell 1101101416 mit 3/4 PSAlcatel Pumpe mit Franklin Motor
Polypropylen-Kartusche 12 mlAngewandte Trennung2419
Verschlussstopfen für 12 ml Polypropylen-KartuscheAngewandte Trennung8157
Polypropylen-Kartusche 3 mlAngewandte Trennung2413
Verschlussstopfen für 3 ml Polypropylen-KartuscheAngewandte Trennung8054
Absperrhähne PTFEAngewandte Trennung2406
Röhrchen flach, 50 mlVWR21008-240
Extraktionsverteiler, 20 pos, 16 x 100 mm RöhrchenWasserWAT200609
Schüttler, BD adams Nutator MischerFisher scientific22363152
Nalgene HDPE Enghalsflaschen IP2 Flaschen, 125  mlFisher scientific03-312-8
ErlenmeyerkolbenFisher ScientificFB-501, 500 ml
HeizblockThermolyne1760 dri bath
Einwegröhrchen aus Borosilikatglas mit glattem EndeFisher Scientific14-961-25
Mikropipetten und Spitzen FinnpipetteThermo20– 200 und 100– 1.000 μ l
HPLC-Fläschchen - micro vl pp 400 µ l PK100   VWR69400-124
HPLC-Fläschchen - Blaue Snap-It-KappeVWR66030-600
Analytische HPLC-SäulePeeke ScientificU1-5C18Q-JJultro 120 5 & micro; m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm
Prep HPLC-Säule, XBridge WasserOBD C18 5 µ m Säule19 mm &fach 150 mm
MassenspektrometerApplied BiosystemsVoyager DE-RP 
Analytisches RP-HPLC-System Shimadzu LC-20ausgestattet mit: CBM-20A Systemcontroller, SPD-20A Detektor, CTO-20A Säulenofen, 2 x LC-20AD Lösungsmittelzufuhreinheit, SIL-20AC Autosampler, DGU-20A5 Entgaser (Shimadzu, MD, USA).
Präparatives RP-HPLC-System Shimadzu LC-20ausgestattet mit: CBM-20A Systemcontroller, SPD-20A Detektor, CTO-20A Säulenofen, 2 x LC-6AD Lösungsmittelzufuhreinheit und FRC-10A Fraktionssammler (Shimadzu, MD, USA).
Stickstoffflaschen-Exsikkator

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