Methodenartikel

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

DOI:

10.3791/53604

⸱

5. Februar 2016

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir haben das photokonvertierbare PSmOrange-System als leistungsstarkes, unkompliziertes und kostengünstiges Werkzeug für die in vivo Zellverfolgung in GFP-transgenen Hintergründen etabliert. Dieses Protokoll beschreibt seine Anwendung im Zebrafisch-Modellsystem.

Zusammenfassung

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Die schnelle Entwicklung von transparenten Zebrafischembryonen (Danio rerio) in Kombination mit fluoreszierenden Markierungen von Zellen und Geweben ermöglicht es, Entwicklungsprozesse zu visualisieren, wie sie im lebenden Tier ablaufen. Interessante Zellen können markiert werden, indem ein gewebespezifischer Promotor verwendet wird, um die Expression eines fluoreszierenden Proteins (FP) für die Erzeugung transgener Linien zu steuern. Die Verwendung von fluoreszierenden photokonvertierbaren Proteinen zu diesem Zweck ermöglicht es zusätzlich, definierte Strukturen innerhalb der Expressionsdomäne genau zu verfolgen. Wenn das Protein in der interessierenden Region beleuchtet wird, ändert sich sein Emissionsspektrum und eine bestimmte Zelle oder ein bestimmter Zellcluster wird hervorgehoben, während andere transgene Zellen in ihrer ursprünglichen Farbe verbleiben. Eine wesentliche Einschränkung ist der Mangel an bekannten Promotoren für eine große Anzahl von Geweben im Zebrafisch. Umgekehrt haben Gen- und Enhancer-Fallen-Screens enorme transgene Ressourcen generiert, die buchstäblich alle embryonalen Strukturen diskret markieren, meist mit GFP oder in geringerem Maße mit roten oder gelben FPs. Ein Ansatz, um definierten Strukturen in solchen transgenen Hintergründen zu folgen, wäre die zusätzliche Einführung eines ubiquitären photokonvertierbaren Proteins, das in der/den interessierenden Zelle(n) umgewandelt werden könnte. Die verfügbaren photokonvertierbaren Proteine weisen jedoch einen grünen und/oder seltener einen roten Emissionszustand1 auf und können daher oft nicht zur Verfolgung von Zellen im FP-Hintergrund bestehender transgener Linien verwendet werden. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir für den Zebrafisch2,3 das PSmOrange-System etabliert. Eine einfache Mikroinjektion von synthetischer mRNA, die für eine nukleäre Form dieses Proteins kodiert, markiert alle Zellkerne mit orange/roter Fluoreszenz. Bei gezielter Photokonversion des Proteins schaltet es sein Emissionsspektrum auf fernrot um. Die Quanteneffizienz und Stabilität des Proteins machen PSmOrange zu einem hervorragenden Zellverfolgungswerkzeug für Zebrafische und möglicherweise andere Teleostarten.

Einleitung

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Exponentiell verbesserte bildgebende Verfahren ermöglichen es, Entwicklungsprozesse über Zeiträume von bis zu vier aufeinanderfolgenden Tagen zu verfolgen3. Im Zebrafisch und vielen anderen Tiermodellsystemen werden bestimmte Zellen, Gewebe, axonale oder vaskuläre Strukturen durch transgene grüne oder manchmal rot oder gelb fluoreszierende Proteine markiert, um die Visualisierung zu erleichtern. In den meisten transgenen Linien wird das Transgen jedoch nicht spezifisch in den interessierenden Zellen exprimiert, sondern auch in zusätzlichen Strukturen, was die genaue Verfolgung von beispielsweise einzelnen Zellen oder Zellgruppen erschwert.

Fluoreszierende photokonvertierbare Proteine eignen sich gut für die Zellverfolgung während der Embryonalentwicklung. Die Voraussetzungen für die Anwendung solcher Proteine sind eine lange Lebensdauer, ein gut getrennter Emissionsbereich bei der Umwandlung und eine helle Fluoreszenz. Zu den verfügbaren photokonvertierbaren Proteinen gehören solche, die ihren Emissionsbereich bei der Umwandlung ändern, wie Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 oder Dendra27 und andere, die nur bei Photoaktivierung fluoreszieren (PAmCherry8, PAGFP9 oder PATagRFP10). Ihre Anwendungen zur Verfolgung von Zellen in bestehenden FP-transgenen Tieren sind jedoch begrenzt, da sie oft einen grün fluoreszierenden Zustand aufweisen oder nicht alle oben genannten Kriterien erfüllen. Erst kürzlich berichteten Subach und Kollegen über das PSmOrange-Protein, das seine Emission bei der Photokonversion von orange/rot zu dunkelrot ändert und erfolgreich in Zellen in Kultur und kultivierten Zellen angewendet wurde, die in Mäuse injiziert wurden2.

Um die Eignung des Proteins für die Zellverfolgung in einem lebenden Embryo zu untersuchen, haben wir ein Expressionskonstrukt für die Mikroinjektion von nuklear-markiertem H2B-PSmOrange in Zebrafischembryonen generiert. Wir stellen fest, dass das Protein alle Voraussetzungen für eine erfolgreiche Zellverfolgung in GFP-transgenen Hintergründen während der ersten 4 (und möglicherweise mehr) Tage der Embryonalentwicklung von Zebrafischen erfüllt. Während dieser Zeit werden die meisten Zellmigrationsereignisse in Fischen abgeschlossen, was das PSmOrange-System zu einer hervorragenden Ergänzung des Zebrafisch-Toolkits macht.

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Protokoll

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1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro-Transkription und mRNA Purification

  1. Linearisieren die H2B-PSmOrange enthält pCS2 + Plasmid, das die NotI-Restriktionsenzym unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Führen Sie die nächsten Schritte mit geeigneten Schutzmaßnahmen wie Handschuhe und Kittel mRNA Verschmutzung und Verschlechterung zu verhindern.
  2. Reinige den linearisierten DNA einer PCR Purification Kit oder Phenol-Chloroform-basierte Verfahren nach Herstellerprotokollen.
  3. Verwenden 1 ug linearisierte Matrizen-DNA für Sp6-mRNA-Transkription nach Herstellerangaben.
  4. Entfernen DNA durch Zugabe von 1,0 U RNase freie DNaseI für 10-20 min bei 37 ° C.
  5. Clean up the mRNA eine RNA bereinigen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  6. Zur Erhöhung der mRNA Reinheit und Konzentration, fallen die mRNA durch Zugabe von 6 ul Natriumacetat (3,0 M, pH 5,2) und 150 & mgr; l 96% Ethanol. Inkubieren Sie die mixed Lösung bei -20 ° C für mindestens 30 min und bis zu 24 Stunden.
  7. Sammeln Sie die mRNA, indem die Lösung bei 18,407 xg Zentrifugieren für 45 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren die mRNA in 150 ul 70% Ethanol. Mischen und Zentrifugieren der Lösung für weitere 15 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit, trocknet das Pellet für 5 Minuten auf Eis und resuspendieren die mRNA in 20 ul ultrareinem RNase freies Wasser.
  8. Bewerten Sie die Konzentration und Reinheit der mRNA durch photometrische Messung einer 1: 100-mRNA-Verdünnung (1 ul mRNA in 99 & mgr; l ultrareinem RNase freies Wasser).
  9. Für kurzzeitige Lagerung, halten Sie die mRNA-Lösung bei -20 ° C. Für die langfristige Lagerung, halten Sie die mRNA bei -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroinjektion in Zebrafischembryonen

  1. Richten Sie Paare in der Nacht vor der Injektion Paarung mit tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) doppelt transgenen Fisch (oder jede andere GFP transgenen Fische). Lassen Sie den Fisch getrennt durch einen Abstandshalter platzierenzwischen ihnen die Zeit der Paarung zu steuern.
  2. Entfernen Sie die Abstandshalter am Morgen der Einspritzung und lassen die Fische Kumpel für 20 min.
  3. Während der Zeit der Paarung, verdünnte die H2B-PSmOrange mRNA zur endgültigen Konzentration von 130 pg / nl (in RNase freies Wasser) und Transfer 6 ul Injektionslösung in einem Mikroinjektion Kapillare eine Micro Trick. Schauen Sie sich die Einspritzmenge mit einem kalibrierten Glasträger. Stellen Sie den Einspritzdruck zu injizieren 2 nl mRNA-Lösung (260 pg).
  4. Sammeln Sie die Eier in eine sterilisierte Kunststoffpetrischale mit 1x Embryo (E3) Medium.
  5. Übertragen Sie 20 bis 30 Embryonen zu einem Einspritzschale mit einem Kunststoffpasteurpipette.
  6. Injizieren 2 nl mRNA Lösung in der Zelle enthalten oder direkt unter der Zelle in das Eigelb an der Ein-Zell-Stadium 11.
  7. Transfer injizierten Embryonen in eine Petrischale 1x E3-Medium, das Entfernen unbefruchtete oder nicht normal Embryonen und wachsen sie bei 28 ° C zu entwickeln.
    Hinweis: Lichtschutz of den Embryonen nicht während des ganzen Experiments erforderlich.
  8. Heben Zebrafischembryonen in 1x E3 Medium und fügen 0,2 mM PTU (1-Phenyl-2 Thioharnstoff) nach gastrulation Pigmentierung zu hemmen. Ändern Sie das Medium zweimal pro Tag, um die Gefahr von bakteriellen Kontaminationen zu minimieren.

3. Embryo Einbetten

  1. Wählen Sie das GFP (grün) und PSmOrange (orange / rot) co-exprimierenden Embryonen ein Binokular mit einem Fluoreszenz-Lampe und angemessene Emissionsfiltern. Übertragen Sie die positiven Embryonen in eine sterile Petrischale mit 1x E3 Medium.
  2. Dechorionate Embryonen unter einem Stereomikroskop Pinzette 12.
  3. Transfer eines Embryos in ein 1,5 ml Röhrchen mit 1,0 ml vorgewärmten 1,0% niedrig schmelzender Agarose (LMA) in ultrareinem Wasser hergestellt, indem ein Cut-Spitze Pipette (P200) verwendet. Hinweis: Wärmen Sie die LMA bis 80 ° C und Abkühlung für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur, bevor der Embryo Einbettung.
  4. Übertragen Sie die Embryos in 150 ul LMA in einemKammerdeckgläser und passen Sie die Ausrichtung des Embryos, zum Beispiel Rückenseite nach unten in das Experiment für den invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + (oder einem anderen geeigneten Mikroskop) beschrieben, eine feine Spitze aus Kunststoff verwenden. Wenn die LMA polymerisiert wird, füllen Sie die Kammer mit Fisch Wasser, das 0,2 mM PTU und 0,02% Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat (Tricaine) für die Anästhesie.
  5. Bevor die Probe Bildgebung, warten Sie 15 Minuten, um die Wirkung von Tricaine zu ermitteln. Die Anästhesie verhindert Embryo Bewegungen, die ein Stereomikroskop mit Hellfeldbeleuchtung überwacht werden kann.
    Anmerkung: Die Kammern zweimal wiederverwendet werden kann.

4. PSmOrange Photokonversion

  1. Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe um den Bereich zu identifizieren, um photoconvert mit 488 nm und 561 nm Laser zur Abbildung GFP und PSmOrange sind.
    Hinweis: Mit der umgekehrten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + auf dem umgekehrten stage TiEcontrolled durch das Mikroskop Imaging-Software und ausgestattet mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser für die Photokonversion und Bildgebung. Jedoch ist die Anwendung sicher nicht auf diese beschränkt Mikroskop solange die Laserlinien zur Umwandlung und Bild verfügbar sind.
    1. Setzen Sie den 20X Luft Objektiv ein (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
    2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen des Mikroskops die PSmOrange Protein vor Photokonversion zu erkennen: 561-nm-Laser, 0,74 mW bei der Fokusebene über dem Ziel gemessen.
      Hinweis: Diese auf diesem System bis zu 40% entspricht (in der Fokusebene messen, ist der einzige Weg, um die Wirkleistung zu bestimmen). Stellen Sie die Laserleistung nach experimentellen Anforderungen wie die Effizienz der H2B-PSmOrange Injektionen variieren.
    3. In Zoomfaktoren den Bereich von Interesse zu markieren. Höhere Vergrößerungen reduzieren Bildaufnahmezeit und damit Phototoxizität.
  2. Erwerben Sie eine Z-Stack für den Aufbaus von Interesse unter Verwendung von 488 nm und 561 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-> 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren.
  3. Scannen Sie die Probe und wählen Sie die Region of Interest (ROI) Werkzeug, um den Bereich zu markieren, um photoconvert. Befestigen Sie den ROI als Stimulationsbereich. Wählen Sie das Foto Aktivierung / Bleaching-Modul, aktivieren Sie die 488-nm-Laser durch das entsprechende Kontrollkästchen aktivieren und stellen Sie die 488-nm-Laser bis 80% (1 mW Laserleistung auf dem Ziel gemessen). Stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit bis 0,5 sec / Frame.
  4. Öffnen Sie die Photo Dienstprogramm (ND Stimulation) und die Photo Einstellungen angeben.
    1. Klicken Sie auf den Befehl "Hinzufügen" die Photo Protokoll anzugeben.
    2. Stellen Sie "Phase" ein in der "Erwerb / Stimulation" -Menü auf "Übernahme" und geben Sie die Anzahl der Bilder vor Photo erworben werden in der "Loops" -Menü.
    3. Stellen Sie "Phase" 2 auf "St.imulation "und die Anzahl der Stimulationsereignisse geben durchgeführt werden.
    4. Stellen Sie "Phase" 3 wie für "Phase" 1. Optional beschrieben, legen Sie eine Warte "Phase" nach der "Phase" 2 durch die Zeit vor der letzten Runde der Bildaufnahme zu warten eingeben.
    5. Sobald alle Parameter eingestellt werden, gelten die Stimulation Einstellung und die Photo laufen.
      Hinweis: Die Laserleistung, die Frequenz des Scannens und der Anzahl der Wiederholungen für jede Runde von Photo variieren und unterscheiden sich von Embryos Embryos. Eine Einstellung zu beginnen, ist in Tabelle 1 gezeigt.
  5. Erwerben Sie eine endgültige Z-Stapel mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser, wie oben die Einstellungen zu übernehmen. Stellen Sie die 640-nm-Laser die konvertierte PSmOrange mit hoher Laserleistung (bis zu 4,5 mW) zu visualisieren.

5. Demontieren Embryo aus LMA

  1. Entfernen Sie den Embryo aus dem Mikroskop enthaltenden Kammer. Entfernen Sie vorsichtig den Embryo aus der Agarose usingen Zange.
  2. Bringen Sie den Embryo in eine neue sterilisierte Kunststoffpetrischale oder in eine sterilisierte 6-Well-Platte mit 1x E3 und 0,2 mM PTU. Inkubieren des Embryos bei 28 ° C, bis die gewünschte Stufe der Entwicklung.

6. Die Analyse der Fate of photokonvertiertem PSmOrange Protein exprimierenden Zellen

  1. Re-einbetten den Embryo als 3.3 und 3.4 unter den Punkten beschrieben.
  2. Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe zu photokonvertiertem Zellen (640 nm) in der GFP transgenen Struktur von Interesse (488 nm) zu identifizieren.
  3. Erwerben Sie eine Z-Stapel Abdecken der Strukturen von Interesse unter Verwendung von 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-> 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren.
  4. Verwenden Sie eine der folgenden Methoden, um Zellen zu identifizieren, die Co-express GFP und die photokonvertiertem Protein.
    1. Maß automatische Fidschi BildJ Makro 3
      1. Convolve der Originalstapel die "Weichzeichnen" Plugin (→ Bearbeiten → Filter → Weichzeichnen) und subtrahieren die glatten Stapel von der ursprünglichen Verwendung der "Bild Rechner" Plugin (→ Prozess → Bildrechner) verwenden. Verwenden Sie diesen Schritt, um die Strukturen von Interesse zu visualisieren und zur Verringerung der Rechenzeit für die Analyse.
      2. Übernehmen bestimmte Schwellenwerte zu den grünen und dunkelroten Kanäle, um die photokonvertiertem Zellen zu markieren (→ Bild → → Stellen Threshold). Verwenden Sie den "Analyze Particles" Werkzeug, um die Schwelle Bereiche mit einem passenden Rahmen zu erkennen (→ Analysieren → Analysieren Partikel).
      3. Öffnen Sie die "Bild Rechner" Plugin und zeigen die überlappenden ROIs im grünen und dunkelroten Kanal in gelb (→ Prozess → Bildrechner).
    2. Microscope Imaging-Software für 3D-Datenauswertung
      1. Zeigen Sie den Stapel in3D die Show Volumen Ansichtsoption (→ 3D-Visualisierung Menü → Show Volume anzeigen) verwenden. Verwenden Sie die grafische Schnittstelle, um die grünen, roten und dunkelrotes Kanäle, die Helligkeit, den Kontrast und die Ernte der 3D-Stapel zu wählen Sie die photokonvertiertem Bereich (Abbildung 1) zu markieren.
        Hinweis: Ähnliche Verfahren werden die Daten sind in den meisten der gemeinsamen Software zur Bildanalyse zu analysieren.

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Ergebnisse

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1 veranschaulicht ein Beispiel des PSmOrange Photosystem. Die Zirbeldrüse Komplex ist eine konservierte Struktur im Wirbeltier dorsalen Zwischenhirn. Wie in vielen anderen Wirbeltieren besteht dieser Komplex der Pinealorgan in der Mitte des Zwischenhirns und den linksseitigen parapineal Zellen. Elegant, aber zeitaufwendig Uncaging Experimente zeigten, dass parapineal Zellen 13 in den vorderen Teil des Pinealorgan stammen. In tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) tran...

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Diskussion

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Transgene Embryonen fluoreszierenden Reporter trägt grundlegend zu verstehen, die embryonale Entwicklung geholfen. Es besteht jedoch immer noch die wesentliche Notwendigkeit für Promotoren die spezifische Visualisierung von besonderen Strukturen zu erleichtern. In ihrer Abwesenheit, verlassen sich die Forscher auf Techniken wie die Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen über den Ursprung und die Entwicklung ihrer Struktur von Interesse zu erfahren. Dies wiederum ist eine wesentliche Voraussetzung, die molekulare...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken O. Subach für die Bereitstellung des originalen H2B-PSmOrange-Plasmids und unserem Fischeinrichtungsteam für die Fischpflege. Wir danken dem Nikon Imaging Center an der Universität Heidelberg für den Zugang zu Mikroskopiegeräten und Analysesoftware. Wir danken der Core Facility Live Cell Imaging Mannheim am CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG) für die Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Raum-zeitliche Koordination von Signalprozessen (EcTop 2), Universität Heidelberg bis C.A.B. und die Medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg und die DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 und 298/6-1) bis M.C.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PCR-AufreinigungskitQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 TranskriptionskitAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup KitQiagen74204
Kunststoff Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920Das in der Arbeit beschriebene Plasmid ist erhältlich im Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Pinzette (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 Deutsches Deckglassystem Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH DeutschlandNr
Nikon PLAN Apo λ 20X Luftobjektiv Nikon GmbH DeutschlandNo Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germany/Laboratory ImagingNo Number
. Nummer

Referenzen

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Photokonvertierbares ProteinKonfokalmikroskopieZelltrackingPhotokonversionsprotokollZ Stapel AkquisitionImage J FijiNIS Elements SoftwareKolokalisationsanalyse

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