Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll, wie Hochdurchsatz-Kryo-Elektronentomographie zu nutzen, um hochauflösende in situ Strukturen der molekularen Maschinen zu bestimmen. Das Protokoll unterstützt große Datenmengen zu verarbeiten sind, vermeidet gemeinsame Engpässe reduziert Ressourcenstillstandszeit, so dass der Benutzer auf wichtige biologische Fragen zu konzentrieren.

Abstract

Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ist ein leistungsfähiges dreidimensionales (3D) Bildgebungsverfahren zur Visualisierung makromolekularer Komplexe in ihrem nativen Kontext auf molekularer Ebene. Bei dieser Technik wird die Probe zunächst in ihrem ursprünglichen Zustand konserviert, indem die Probe schnell in Glaseis eingefroren wird, dann eine Reihe von Mikroaufnahmen aus verschiedenen Winkeln bei hoher Vergrößerung aufgenommen und schließlich eine 3D-Dichtekarte rechnerisch rekonstruiert. Die gefrorene hydratisierte Probe reagiert extrem empfindlich auf den Elektronenstrahl, so dass Mikroskopische Aufnahmen bei sehr niedrigen Elektronendosen gemacht werden, um die Strahlenschäden zu begrenzen. Infolgedessen hat das Roh-Kryo-Tomogramm ein sehr geringes Signal-Rausch-Verhältnis, das durch ein intrinsisch verrauschtes Bild gekennzeichnet ist. Um die interessierenden Motive besser zu visualisieren, werden konventionelle bildgebende Analysen und Sub-Tomogramm-Mittelwertbildung verwendet, bei denen Sub-Tomogramme des Probanden aus dem ursprünglichen Tomogramm extrahiert und ausgerichtet und gemittelt werden, um sowohl den Kontrast als auch die Auflösung zu verbessern. Große Datensätze von Tilt-Reihen sind unerlässlich, um die Komplexe in verschiedenen Zuständen, Bedingungen oder Mutationen zu verstehen und aufzulösen sowie eine ausreichend große Sammlung von Sub-Tomogrammen für die Mittelwertbildung und Klassifizierung zu erhalten. Das Sammeln und Verarbeiten dieser Daten kann ein großes Hindernis darstellen, das eine weitere Analyse verhindert. Hier beschreiben wir ein Hochdurchsatz-Kryo-ET-Protokoll, das auf einem computergesteuerten 300-kV-Kryo-Elektronenmikroskop, einer DDD-Kamera (Direct Detection Device) und einer hocheffektiven, halbautomatischen Bildverarbeitungs-Pipeline-Software-Wrapper-Bibliothek basiert, die tomoauto selbst entwickelt hat. Dieses Protokoll wurde effektiv genutzt, um das intakte Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) in Shigella flexneri-Minizellen sichtbar zu machen. Es kann auf jedes Projekt anwendbar sein, das für Kryo-ET geeignet ist.

Introduction

Typ III-Sekretion Systeme (T3SS) sind wesentliche Virulenzdeterminanten für viele gramnegative Krankheitserreger. Die Injektisoms, auch bekannt als die Nadel-Komplex bekannt ist, ist die zentrale T3SS Maschine für direkte Translokation von Effektor-Proteine ​​aus dem Bakterium in eukaryotischen Wirtszellen ^{1, 2} erforderlich. Die Injektisoms umfasst eine extrazelluläre Nadel, ein Basaltemperatur und einen zytoplasmatischen Komplex ebenfalls bekannt als Sortierkomplexe ^3. Frühere Studien haben 3-D-Strukturen von gereinigtem injectisomes aus Salmonella und Shigella erläutert, zusammen mit den atomaren Strukturen der Haupt Basaltem....

Protocol

1. Minicell Vorbereitung

1. Um S. machen flexneri Minizellen, zu transformieren 1 ul Plasmid pBS58, die konstitutiv exprimiert Escherichia coli Zellteilungsgene ftsQ, FTSA und ftsZ aus einem low-copy Spectinomycin-resistente Plasmid in 5 ul elektrokompetente Streptomycin-resistente Serotyp 5a (M90T-Sm) Zellen durch Elektroporation bei 2,5 kV für 5 ms in 1 mm Küvetten.
2. Speicher Minizellenproben bei -80 ° C in 15% Glycerin in 1,5 ml Kryo-Mikroröhrchen. Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, kratzen etwa 5 & mgr; l von Zellen aus dem unthawed Mikroröhrchen mit einer Pipettenspitze und die Zellen in 4 ml trypt....

Results

Proben von Minizellen S. flexneri wurden gesammelt und verarbeitet, wie in der schematischen Abbildung 1 mit tomoauto folgende der Pipeline in Figur 2 detailliert gezeigt. Tilt-Serie wurden mit SerialEM ^{10, die} für die Hochdurchsatz-Tilt-Serie Erfassung an seitens des Nutzers auf schwachen Vergrößerungs montage Karten bezeichneten Punkten ermöglicht (Abbildung 3) gesammelt. Aufnahmen wurden mit Dosi.......

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren mit hohem Durchsatz konnten wir 1917 Kryo-Tilt-Serie verarbeiten und produzieren über 4.500 Unterschichtaufnahmen des intakten S. flexneri Injektisoms ^19. Die gesammelten Daten führten zur detaillierten Charakterisierung von in situ Injektisoms, einschließlich der zytoplasmatischen Sortierkomplexe. Das Verfahren wurde auch verwendet, um mehrere mutante Zellen mit spezifischen Deletion des mutmaßlichen Protein-Komponenten, erläutern die Zusammensetzung.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerin	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptische Sojabrühe	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Elektroporationsapparatur	Bio-rad	165-2100
1 mm Küvette	BTX	45-0124
1,5 ml Kryoröhrchen	Thermowissenschaftlich	5000-1020
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Elektronenmikroskopie)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glimmentladungsgerät	hauseigene		kommerzielle Alternative verfügbar
Vakuumexsikkator	Sigma-Aldrich	Z119016	Wird in hauseigenen Glimmentladungsgeräten verwendet
Hochfrequenz-Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	der in hauseigenen Glimmentladungsgeräten verwendet wird. ACHTUNG: Dieses Gerät erzeugt hohe Spannungen.
Zentrifugenzange
	Dumont (Elektronenmikroskopie)	72705-D	Style 5 Antimagnetisches
kolliodales Gold	Aurion		BSA 10nm
Filterpapier	Whatman		#2
Ethan	Matheson Tri-Gas	UN1035
Stickstoff	Matheson Tri-Gas	UN1977
Kolbengerät	Hauseigene		kommerzielle Alternative verfügbar
Kryo-Gitter-Aufbewahrungsbox	Elektronenmikroskopie Sciences	71166-30
Transmissionselektronenmikroskop	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Kamera mit direktem Detektionsgerät	Gatan		K2 Summit
Tomogramm Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternativen: UCSF-Tomographie, Leginon, FEI Batch-Tomographie
Strahlinduzierte Bewegungskorrektursoftware	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html erfordert >2 GB Nvidia GPU
Tilt-Series Ausrichtungssoftware	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternativen: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternativen: RAPTOR (in IMOD0 enthalten (verwendbar in tomoauto)
CTF-Bestimmungssoftware	IMOD		Alternativen: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Verwendbar in tomoauto)
Tilt-Series Rereconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternativen: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternativen: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternativen: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org