Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll, wie Hochdurchsatz-Kryo-Elektronentomographie zu nutzen, um hochauflösende in situ Strukturen der molekularen Maschinen zu bestimmen. Das Protokoll unterstützt große Datenmengen zu verarbeiten sind, vermeidet gemeinsame Engpässe reduziert Ressourcenstillstandszeit, so dass der Benutzer auf wichtige biologische Fragen zu konzentrieren.

Abstract

Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ist ein leistungsfähiges dreidimensionales (3D) Bildgebungsverfahren zur Visualisierung makromolekularer Komplexe in ihrem nativen Kontext auf molekularer Ebene. Bei dieser Technik wird die Probe zunächst in ihrem ursprünglichen Zustand konserviert, indem die Probe schnell in Glaseis eingefroren wird, dann eine Reihe von Mikroaufnahmen aus verschiedenen Winkeln bei hoher Vergrößerung aufgenommen und schließlich eine 3D-Dichtekarte rechnerisch rekonstruiert. Die gefrorene hydratisierte Probe reagiert extrem empfindlich auf den Elektronenstrahl, so dass Mikroskopische Aufnahmen bei sehr niedrigen Elektronendosen gemacht werden, um die Strahlenschäden zu begrenzen. Infolgedessen hat das Roh-Kryo-Tomogramm ein sehr geringes Signal-Rausch-Verhältnis, das durch ein intrinsisch verrauschtes Bild gekennzeichnet ist. Um die interessierenden Motive besser zu visualisieren, werden konventionelle bildgebende Analysen und Sub-Tomogramm-Mittelwertbildung verwendet, bei denen Sub-Tomogramme des Probanden aus dem ursprünglichen Tomogramm extrahiert und ausgerichtet und gemittelt werden, um sowohl den Kontrast als auch die Auflösung zu verbessern. Große Datensätze von Tilt-Reihen sind unerlässlich, um die Komplexe in verschiedenen Zuständen, Bedingungen oder Mutationen zu verstehen und aufzulösen sowie eine ausreichend große Sammlung von Sub-Tomogrammen für die Mittelwertbildung und Klassifizierung zu erhalten. Das Sammeln und Verarbeiten dieser Daten kann ein großes Hindernis darstellen, das eine weitere Analyse verhindert. Hier beschreiben wir ein Hochdurchsatz-Kryo-ET-Protokoll, das auf einem computergesteuerten 300-kV-Kryo-Elektronenmikroskop, einer DDD-Kamera (Direct Detection Device) und einer hocheffektiven, halbautomatischen Bildverarbeitungs-Pipeline-Software-Wrapper-Bibliothek basiert, die tomoauto selbst entwickelt hat. Dieses Protokoll wurde effektiv genutzt, um das intakte Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) in Shigella flexneri-Minizellen sichtbar zu machen. Es kann auf jedes Projekt anwendbar sein, das für Kryo-ET geeignet ist.

Introduction

Typ III-Sekretion Systeme (T3SS) sind wesentliche Virulenzdeterminanten für viele gramnegative Krankheitserreger. Die Injektisoms, auch bekannt als die Nadel-Komplex bekannt ist, ist die zentrale T3SS Maschine für direkte Translokation von Effektor-Proteine ​​aus dem Bakterium in eukaryotischen Wirtszellen ^{1, 2} erforderlich. Die Injektisoms umfasst eine extrazelluläre Nadel, ein Basaltemperatur und einen zytoplasmatischen Komplex ebenfalls bekannt als Sortierkomplexe ^3. Frühere Studien haben 3-D-Strukturen von gereinigtem injectisomes aus Salmonella und Shigella erläutert, zusammen mit den atomaren Strukturen der Haupt Basaltemperatur Proteinen ^{4, 5.} Jüngste in situ Strukturen injectisomes aus Salmonella, Shigella und Yersinia wurden enthüllt Kryo-ET ^{6 , 7.} Jedoch ist die cytoplasmatische Komplexes wesentlich für Effektorzellen Auswahl und Nadelbaugruppe, nicht in diesen Strukturen sichtbar gemacht.

Cryo-ET wird der MOS-t geeignete Technik für die Bildgebung molekulare Maschinerie in Nanometer-Auflösung in seiner nativen zellulären Kontext (in situ). Dennoch ist die erreichbare Auflösung durch Kryo-ET von Probendicke begrenzt. Um den Nachteil zu überwinden, bebildert wir intakte injectisomes in einem virulenten Shigella flexneri Stamm, der genetisch veränderten wurde auf Minizellen dünn genug für die Kryo-ET zu produzieren. Eine weitere Einschränkung der Kryo-ET ist die Empfindlichkeit der Probe auf die Strahlung von dem Elektronenstrahl, die sehr schnell zerstört die Information hoher Auflösung in der Probe induziert wird. Als Ergebnis sind extrem niedrige Dosen für einzelne neigungsBilder verwendet, so daß eine geeignete Dosis kann unter der vollen Neigungsreihe verteilt sein. Dies das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in der endgültigen Rekonstruktion, wodurch es schwierig ist, die strukturellen Merkmale des Gegen aus der großen Menge von Rauschen in dem Tomogramm zu differenzieren und begrenzt die Auflösung, die durch Kryo- erzielbaren senkt erheblich ET. Conventional Bildverarbeitung wie Fourier und Realraumfilter sowie Abwärtsabtasten kann verwendet werden, um den Kontrast zu erhöhen, aber auf Kosten der Ausfilterung viel von der Information hoher Auflösung. In jüngerer Zeit hat Unter Tomogramm Lungs machte es möglich, stark zu erhöhen das SNR und anschließend die endgültige Lösung in einigen Fällen auf Sub-Nanometerstufen ^{8, 9.} Eine detailliertere Analyse von Komplexen ermöglicht wird durch rechen Extrahieren Tausende von Teilschnittbildern, enthaltend die Bereiche von Interesse von den ursprünglichen Schichtaufnahmen und dann Ausrichten und Mittelwertbildung der Teilschnittbilder in situ komplexe Strukturen mit höherer SNR und eine höhere Auflösung zu bestimmen. Diese Verfahren können mit genetischen Methoden noch größere Einblicke in die makromolekularen Anordnungen und ihre dynamischen Konformationen in der nativen zellulären Kontext bereitzustellen integriert werden.

In der Regel Dutzende oder sogar Hunderte von tausend Unterschichtaufnahmen müssen, um zu bestimmen, Hoch gemittelt werden-Auflösung Strukturen in situ. Die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Tilt-Serie erforderlich, um zu produzieren diese große Anzahl von Unterschichtaufnahmen schnell zu einem Engpass. Die sich ergebende Tilt-Serie werden häufig durch strahlinduzierte Verschiebung der Bühne spiel sowie Vergrößerung, Rotation und Schräg Mängel, die gelöst werden müssen, um die Neigung der Serie in eine Ausrichtung vor der Rekonstruktion zu bringen betroffen. Der Neigungsserie wird in der Regel durch die Verfolgung Goldbezugsmarkierungen, die traditionell von Hand durch Inspektion des Tilt-Reihe ausgewählt sind, wodurch eine weitere Flaschenhals ausgerichtet sind. Viele Software-Pakete für die automatisierte Tilt-Serie Nahme durch computergesteuerte Elektronenmikroskopen ^{10, 11, 12,} Tilt-Serie Ausrichtung und Wiederaufbau ^{13, 14 und} Unterschichtaufnahme von durchschnittlich ^{15 bis 18} entwickelt. Da diese Pakete hand diskreten Operationen in den Workflow der Kryo-ET, wird es wünschenswert, einen höheren Abstraktionsebene in den Prozess zu systema bauendas gesamte Schema tisch zu optimieren zu einer einzigen Pipeline. Daher entwickelten wir eine Software-Wrapper-Bibliothek "tomoauto" entwickelt, um eine Reihe von diesen Paketen in einem einzigen halbautomatische Einheit zu organisieren, so dass für einfache User-Betrieb bei voller Konfiguration jeder Komponente in einer zentralisierten Weise. Die Bibliothek ist Open-Source, gut dokumentiert, fortlaufend entwickelt und für den Einsatz frei verfügbar, maßgeschneiderte Entwicklung oder die weitere Integration mit Hilfe eines Online-Remote-Quellcode-Repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Dieses High-Throughput-Kryo-ET Leitung wurde verwendet, um intakt injectisomes in S. visualisieren flexneri Minizellen. Insgesamt 1.917 Schichtaufnahmen wurden mit dieser Methode erzeugt werden, offenbart eine hochauflösende in situ Struktur des intakten Maschine einschließlich der zytoplasmatischen Sortierplattform von Unterschichtaufnahme von durchschnittlich ¹⁹ bestimmt. Zusammen mit Molecular Modeling von Wildtyp und mutant Maschinen, bietet unser Hochdurchsatz-Pipeline einen neuen Weg, um den Aufbau und die Funktion des intakten Injektisoms im nativen zellulären Kontext zu verstehen.

Protocol

1. Minicell Vorbereitung

1. Um S. machen flexneri Minizellen, zu transformieren 1 ul Plasmid pBS58, die konstitutiv exprimiert Escherichia coli Zellteilungsgene ftsQ, FTSA und ftsZ aus einem low-copy Spectinomycin-resistente Plasmid in 5 ul elektrokompetente Streptomycin-resistente Serotyp 5a (M90T-Sm) Zellen durch Elektroporation bei 2,5 kV für 5 ms in 1 mm Küvetten.
2. Speicher Minizellenproben bei -80 ° C in 15% Glycerin in 1,5 ml Kryo-Mikroröhrchen. Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, kratzen etwa 5 & mgr; l von Zellen aus dem unthawed Mikroröhrchen mit einer Pipettenspitze und die Zellen in 4 ml tryptische Sojabrühe mit Spectinomycin hinzugefügt, um 100 ug / ml-Konzentration. Wachsen Sie O / N bei 37 ° C.
3. Pipette wurden 2 ml der Kultur von 1,2 in 200 ml tryptischer Sojabrühe mit Spectinomycin erneut auf 100 & mgr; g / ml Konzentrationen zugegeben. Wachsen bei 37 ° C bis zur späten log-Phase.
4. Um Minizellen, Zentrifugen bereichern200 ml der Kultur von 1,3 bei 1.000 xg für 5 min. Die Überstandsfraktion in ein neues Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere sorgfältig gießen bei 20.000 × g für 10 min. Vorsichtig abgießen und den Überstand verwerfen Fraktion und vorsichtig mischen des Pellets mit der verbleibenden Flüssigkeit mit einer Pipettenspitze und übertragen etwa 100 & mgr; l des Pelletmischung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

2. EM Grid Vorbereitung

1. Legen Sie eine R2 / 2 löchrigen Kohlenstofffilm 200 mesh Kupfernetz Kohlenstoffseite nach oben auf einen Glasobjektträger.
   HINWEIS: Ein R2 / 2 200-mesh Gitter ausgewählt ist, um die Anzahl der Tilt-Serie, die eingestellt werden können, in einem einzelnen Rasterquadrat erwerben bei gleichzeitiger Unterstützung der Probe und Platzieren der Kante der Kohlenstoffschicht im Bereich der Kamera zu maximieren bei der gewünschten Vergrößerung. Feineren Maschengitter und kleinere löchrigen Kohlenstoffschichten, wie R1.2 / 1.3 400 Mesh kann für Proben bei höherer Vergrößerung abgebildet werden; größere löchrigen Kohlenstoffschichten, wie R3.5 / 1 200 mesh können nützlich seind für Proben, die bei geringer Vergrößerung abgebildet wird, oder wenn die Mikrophotographie sollte nicht die Kohlenstoffkante und löchrigen Kohlenstoffschichten mit größerer Abstand wie R1 enthalten / 4 200 mesh verwendet, um die Ausrichtung der Bühne, um den interessierenden Bereich und der Schutz Bereiche aus zu unterstützen Überbelichtung in Fokussier- und Spur Routinen.
2. Setzen Sie den Schieber auf der Plattform in einer Glimmentladung Gerät.
   HINWEIS: Wir verwenden eine interne Vorrichtung, in der eine Anode und Plattform wurde in einem Vakuumexsikkator bearbeitet worden und wird von einem Hochfrequenzgenerator gespeist. Nach dem Anlegen eines Vakuums, befestigen Sie den Hochfrequenzgenerator-Sonde an die Anode und schalten Sie die Sonde für 1 min, um eine Glimmentladung das Raster. Die erforderliche Zeit, um eine Entladung das Gitter kann von wenigen Sekunden bis zu einer Minute liegen glühen. Variieren der Gasentladungszeit kann verwendet werden, um Probleme mit der Probenkonzentration und Netze, die ohne Glaskörper Eis trocken erscheinen zu diagnostizieren.
3. Entfernen Sie das Gitter mit einer Reihe von Pinzetten, und verriegeln Sie die Zange mit einer elastischen b geschlossenund.
4. Fügen Sie 100 ul von 10 nm kolloidalem Gold Lösung des Mikrozentrifugenröhrchen mit den in 1.4 hergestellte Minizellen und mischen durch vorsichtiges Schwenken der Röhre mit einem Finger. Mit einer neuen Pipetten Platz 4 ul der Mischung auf die in 2.2 hergestellte Raster.
   HINWEIS: Kolloidales Gold ist in einer Vielzahl von Größen und es sollte darauf geachtet werden, dass die Größe der Gold größer als 5 Pixel aufgrund der Bildpunktgröße der Mikroaufnahmen an das erworbene Vergrößerung verarbeitet werden, werden zwar nicht zu groß, um dunkle Merkmale von Interesse.
5. Bereiten Sie den Sprung Gefriergeräte; füllen die äußeren Gefrierbehälter mit flüssigem Stickstoff und füllen Sie dann die innere Kammer mit flüssigem Ethan. Befestigen Sie die Zange mit dem Raster, um die Kolbenstange und verriegeln Sie die Kolbenstange in die angehobene Position.
   HINWEIS: Siehe Iancu et al ²⁰ für ein Protokoll, welche die Verwendung eines handelsüblichen Tauchgefriergerät..
6. Tupfen Sie das Raster durch vorsichtiges berühren ein Stück Filterpapier zu ter der Probe fallen, bis der Meniskus zwischen dem Gitter und Filterpapier trennt und die Docht auf dem Filterpapier hält, dann kurz die Kolbenstange, das Einfrieren des Gitters. Die Zange vorsichtig aus der Kolbenstange und setzen Sie das Gitter in eine Gitterhalter.
7. Bereiten Sie die Kryo-EM-Transferstation durch Füllen der Ladefläche und Absorptionspumpe Behälter mit flüssigem Stickstoff. Sobald der Ladebereich ist Temperatur von flüssigem Stickstoff statt der Netzhalter und ein Mikroskop Probenpatrone in den Ladebereich.
8. Entfernen Sie vorsichtig den Sicherungsring, der entweder eine kleine Gewindeverriegelungsring auf früheren Polara Mikroskopen oder einem C-Stil-Clipring bei späteren Modellen ist; platzieren Sie den EM Grid in die Patrone mit einer Pinzette und dann sanft bringen Sie den Sicherungsring wieder auf die Patrone Befestigung des Gitters.
9. Entfernen Sie die Mehrfachprobenhalter aus dem Mikroskop und befestigen es an der Übergabestation. Setzen Sie die Patrone in den Probenhalter mit einer Pinzette eine Patroned Legen Sie den Halter von der Ladefläche zurückziehen und übertragen Sie die Mehrfachprobenhalter zurück in das Mikroskop.
   Hinweis: Siehe Chen et al ²¹ für eine visuelle Protokoll Detaillierung 2,1-2,9..

3. Hochdurchsatz Automatisierte Tilt-Serie Sammlung

1. Sammlung von Low-Vergrößerung Karten
   1. Öffnen Sie eine neue Navigator-Fenster, indem Sie auf "Öffnen" in der "Navigator" Menü SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Finden Planquadrate, die akzeptable Abbildungsbedingungen enthalten (dh dünnem Eis, keine Verunreinigung, Thema von Interesse) mit dem Leuchtschirm bei niedriger Vergrößerung (~ 2,300X für die Minizellenprobe).
      HINWEIS: [Optional:. Dieser Schritt kann mit SerialEM durch Anbringung von das gesamte Raster automatisiert werden, aber es schneller sein, senden Sie einfach ein paar Bereiche manuell]
   3. Stellen Sie die Bühne, um euzentrischen Höhe durch Neigen des Probenhalters um 50 ° und stellen Siedie z-Höhe, bis die XY-Translationsbühnen minimal zwischen den geneigten und nicht geneigten Ansichten.
   4. Zu bewegen, um das Zentrum der Planquadrat und klicken Sie auf "Hinzufügen Bühnen Pos" Knopf im Navigator-Fenster, um die aktuelle Tischposition zu speichern.
   5. Weiter Schritte 3.1.1-4 oben, bis alle akzeptable Planquadrate Tischpositionen gespeichert wurden.
   6. Öffnen Sie eine neue Montage MRC-Datei, indem Sie auf 'New montage "im Menü" Datei ". In der Montage Setup Dialog, die sich öffnet, wählen Sie eine Reihe von Stücken in X und Y, die den gesamten Planquadrat (zB 10 x 10 für eine Standard-200 mesh Gitter) erwerben wird. Verwenden Sie eine hohe Binning wie 8 und wählen Sie die "Move Bühne statt Shifting Bild 'und' überspringen Korrelationen verwendet, um Stücke auszurichten 'Radio-Buttons.
   7. Im Navigator-Fenster klicken Sie auf die erste Stufe Position und setzen Sie ihn auf, indem Sie die "Acquire" Checkbox, erworben werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Stufe Position im Navigator-Fenster.
   8. Öffnen Sie den Navigator Erwerben Dialog, indem Sie auf "Erwerben Sie bei Punkte" in der "Navigator" -Menü. Überprüfen Sie die "Acquire Kartenbild" und "Raue eucentricity" Kontrollkästchen und stellen Sie sicher, dass alle anderen Kontrollkästchen deaktiviert sind. Klicken Sie auf "Weiter", um eine Montage in jeder Phase Position zu sammeln.
2. Tilt-Serie Acquisition
   1. Im Navigator-Fenster wählen Sie eine der erworbenen Karten und klicken Sie auf den 'Load Karte' button.
   2. Im Navigator-Fenster klicken Sie in der Karte, an dem einen Tilt-Serie erwerben die 'Add Punkte "Taste und wählen Sie Punkte. Klicken Sie dann auf die "Stopp Hinzufügen von Punkten 'button. Wiederholen Sie für jede Karte gesammelt.
   3. Im Kamera-Menü wählen Sie "Parameter" und definieren Sie die Parameter für die Bildschärfe, Gerichtsverhandlung, und Aufnahmemodi. [Optional:. Dosis-fraktioniert Daten können in Parameter für Record-Modus festgelegt werden]
   4. Wählen Sie einen Punkt im Navigator-Fenster und überprüfen Sie die "Tilt-Series9; Kontrollkästchen. Klicken Sie im Dialogfenster Setup-Tilt-Series, die wählen Sie die Parameter öffnet Wunsch für den Tilt-Serie Sammlung. Wiederholen Sie dies für den Rest der ausgewählten Punkte im Navigator-Fenster, aber nicht die Karten zu wählen.
   5. Im Navigator-Menü wählen Sie erneut die "Erwerben Sie bei Punkte". Im Navigator Erwerben Dialog wählen Sie "Richten Sie den Artikel" Autofokus "und" Raue eucentricity ', wie Vorarbeiten, und wählen Sie "Acquire Kippserie' als primäre Aufgabe, und wählen Sie" Schließen Spalte Ventile am Ende ", um die Spalte zu schließen, wenn alle der Punkte wurden gesammelt. Nach fortfahren einem Tilt-Serie wird an jedem Punkt in jeder Karte gesammelt werden.

4. Hochdurchsatz Automatisierte Tilt-Serie Verarbeitung und Rekonstruktion Mit Tomoauto

1. Korrektur der Lichtstrahl-induzierte Bewegung in Dosis-fraktioniert Daten [optional]
   HINWEIS: Tomoauto verwendet MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) zu strahlen-induzierte Bewegung von Dosis-fraktioniert mikroskopischen Aufnahmen zu entfernen. NOTIONCORR ¹⁶ muss auf dem System installiert werden.
   1. Mit dem Original Tilt-Serie, der Ausgabeprotokoll aus SerialEM ^{10 und} der Einzeldosis-fraktionierten Bilder aller im aktuellen Arbeitsverzeichnis, in einem Terminal den Befehl:
      dose_fractioned_to_stack
      ist der Name des Tilt-Serie zu verarbeiten.
2. Ausrichtung und Rekonstruktion der Tilt-Serie
   HINWEIS: Tomoauto standardmäßig verwendet IMOD ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) zu kippen-Serie automatische Bezugsmodellgeneration, Ausrichtung, Bestimmung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF), CTF-Korrektur ^23, Handgriff und Wiederaufbau. Alternativ Nutzer haben die Möglichkeit, in tomoauto zu RAPTOR ²⁴ verwenden (in IMOD enthalten) für die automatische Bezugsmodellgeneration, CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf), um die CTF bestimmen und tomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) zur Rekonstruktion oder in irgendeiner Kombination von Software-Paketen durch Konfiguration. Diese Konfiguration sowie die verfügbaren Parameter in jedem Paket wird von einem globalen Konfigurationsdatei, die bearbeitet werden können, um die Werte am häufigsten in einem Labor verwendet werden, angepasst werden, während lokale Konfigurationsdateien können auch Detail-Parameter für eine bestimmte Probe verwendet, Sammlung erstellt werden behandelt eingestellt oder einzelne Tilt-Serie. Alle Pakete, die verwendet werden will, muss auf dem System installiert werden.
   1. Mit der Tilt-Serie in der aktuellen Arbeitsverzeichnis, in einem Terminal den Befehl
      tomoauto --CTF --mode = align
      ist der Tilt-Serie verarbeitet werden und der Durchter der Bezugsmarkierungen in Nanometern. Dieser Befehl wird ausrichten und schätzen Sie die CTF des Neigungs-series automatisch. Es ist möglich, CTF Verarbeitung durch Entfernen der --CTF Option aus dem Befehl zu überspringen.
   2. Untersuchen Sie das ausgerichtet Tilt-Serie optisch für eklatante Fehler bei der Ausrichtung Verarbeitung und überprüfen den geschätzten CTF durch Ausführen der Befehle:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      jeweils, wobei ist der Name des Tilt-Serie ohne Suffix. Überprüfen Sie auch die Ausgabe des Befehls tomoauto, um die durch die Ausrichtung, die eine quantitative statistische der Ausrichtungsqualität erzeugt mittlere Restfehler zu sehen.
   3. Angesichts eine akzeptable Ausrichtung gehen Verarbeitung durch Ausführung des Befehls:
      tomoauum --CTF --mode = reconstruct
      mit den gleichen Benutzer Substitutionen wie in 4.2.1. Dieser Befehl wird die CTF zu beheben, löschen Sie die Bezugsmarkierungen vom Tilt-Serie und berechnen den Wiederaufbau. Wieder CTF Verarbeitung kann wie in 4.2.1 übersprungen werden.
   4. [optional] Um die visuelle Inspektion Schritt überspringen und vollständig zu automatisieren die Verarbeitung und Rekonstruktion führen Sie den Befehl
      tomoauto --CTF
   5. [optional] Um eine bestimmte lokale Konfiguration verwenden, finden Sie in der tomoauto Dokumentation, wie man eine lokale Konfigurationsdatei zu erstellen, und führen Sie dann den Befehl
      tomoauto [Optionen] -L
      wobei ist der Name des lokalen configuration Datei.

5. Unter Tomogramm Averaging

HINWEIS: Wir verwenden die i3-Paket ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/), um Unter Tomogramm Lungsversuche Verfahren ist jedoch beschrieben, das Protokoll gilt generell für die meisten verfügbaren Unter Tomogramm Lungssoftware packages16to Prozessunter Tomogramm Lungsversuche, jedoch beschrieben das Protokoll gilt generell für die meisten verfügbaren Unter Tomogramm Lungssoftwarepakete ^16-18.

1. Mit dem rekonstruierten Tomogramms in das aktuelle Arbeitsverzeichnis öffnen, die Tomogramm für die Partikel Kommissionierung mit dem Befehl:
   tomopick .rec
   wobei ist, wie in 4.2.2. In dem Fenster, das Sie mit der linken Maustaste, um klicken Sie zuerst die Basaltemperatur und dann die Nadelspitze eine Injektisoms auszuwählen und verwenden Sie die Pfeiltasten, um durch die Scheiben des tomogra Riff eröffnetMeter Markieren Sie alle sichtbare injectisomes auf diese Weise. Dieser speichert die Koordinaten in einer Textdatei die lange Achse der Struktur definieren, als auch die Schätzung zwei der drei Euler-Winkel die Orientierung beschreibt der Struktur.
2. Rechnerisch Extrakt 400 ³ Voxel Würfel aus dem Tomogramm in dem Mittelpunkt der langen Achse definiert durch Ausführen des Befehls zentriert:
   Clip resize -CX -cy -cz -ix 400 -iy 400 -iz 400
   .rec _001.mrc
   wobei , , sind die Mittelpunktkoordinaten der Struktur und ist, wie in 4.2.2. Die Größe des extrahierten Würfels sollte von der Struktur und dem verwendeten Vergrößerung variieren und sollte groß genug sein, um die Struktur von Interesse, die für diese Probe beträgt 400 ³ Voxeln ausreichend umschließen.
3. Down-Probe (bin) der Teilschnittbildes um einen Faktor von vier, um die Rechenzeit für die Anfangsausrichtung mit dem Befehl zu reduzieren:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   wobei ist wie in 5.2.
4. Übernehmen der Euler-Winkel bestimmt den Unterschichtaufnahmen und berechnen Sie die globalen Durchschnitt, um die anfängliche Vorlage mit dem Befehl zu erzeugen.
   I3totsum.sh
5. Richten und zu klassifizieren abwärts abgetastet Unterschichtbilder mit Hilfe eines binären Klassifizierungsmaske der cytoplasmatischen Region. Führen Sie Unter Tomogramm Lung im Fourierraum, um die fehlenden Keils Artefakte Merkmal der Tomographie zu minimieren. Für Binning 4 Daten, nutzen Sie bitte SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Wiederholen Sie Schritt 5.5 mit Teilschnittbilder mit einem Faktor von zwei (SAMPFACT = & Downsampling# 34; 2 2 2 ") und noch einmal mit den ursprünglichen Daten (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

Results

Proben von Minizellen S. flexneri wurden gesammelt und verarbeitet, wie in der schematischen Abbildung 1 mit tomoauto folgende der Pipeline in Figur 2 detailliert gezeigt. Tilt-Serie wurden mit SerialEM ^{10, die} für die Hochdurchsatz-Tilt-Serie Erfassung an seitens des Nutzers auf schwachen Vergrößerungs montage Karten bezeichneten Punkten ermöglicht (Abbildung 3) gesammelt. Aufnahmen wurden mit Dosi...

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren mit hohem Durchsatz konnten wir 1917 Kryo-Tilt-Serie verarbeiten und produzieren über 4.500 Unterschichtaufnahmen des intakten S. flexneri Injektisoms ^19. Die gesammelten Daten führten zur detaillierten Charakterisierung von in situ Injektisoms, einschließlich der zytoplasmatischen Sortierkomplexe. Das Verfahren wurde auch verwendet, um mehrere mutante Zellen mit spezifischen Deletion des mutmaßlichen Protein-Komponenten, erläutern die Zusammensetzung...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerin	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptische Sojabrühe	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Elektroporationsapparatur	Bio-rad	165-2100
1 mm Küvette	BTX	45-0124
1,5 ml Kryoröhrchen	Thermowissenschaftlich	5000-1020
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Elektronenmikroskopie)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glimmentladungsgerät	hauseigene		kommerzielle Alternative verfügbar
Vakuumexsikkator	Sigma-Aldrich	Z119016	Wird in hauseigenen Glimmentladungsgeräten verwendet
Hochfrequenz-Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	der in hauseigenen Glimmentladungsgeräten verwendet wird. ACHTUNG: Dieses Gerät erzeugt hohe Spannungen.
Zentrifugenzange
	Dumont (Elektronenmikroskopie)	72705-D	Style 5 Antimagnetisches
kolliodales Gold	Aurion		BSA 10nm
Filterpapier	Whatman		#2
Ethan	Matheson Tri-Gas	UN1035
Stickstoff	Matheson Tri-Gas	UN1977
Kolbengerät	Hauseigene		kommerzielle Alternative verfügbar
Kryo-Gitter-Aufbewahrungsbox	Elektronenmikroskopie Sciences	71166-30
Transmissionselektronenmikroskop	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Kamera mit direktem Detektionsgerät	Gatan		K2 Summit
Tomogramm Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternativen: UCSF-Tomographie, Leginon, FEI Batch-Tomographie
Strahlinduzierte Bewegungskorrektursoftware	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html erfordert >2 GB Nvidia GPU
Tilt-Series Ausrichtungssoftware	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternativen: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternativen: RAPTOR (in IMOD0 enthalten (verwendbar in tomoauto)
CTF-Bestimmungssoftware	IMOD		Alternativen: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Verwendbar in tomoauto)
Tilt-Series Rereconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternativen: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternativen: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternativen: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org