Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Herstellungsmethode für Gold-Nanopartikel integriert fotoempfindlichen Liposome mit den im Handel erhältlichen Materialien. Es zeigt auch, wie die Mikrobläschen Kavitationsprozess der synthetisierten Liposomen bei der Behandlung von gepulsten Laser zu messen.
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Methodenartikel
Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Photoresponsive Nanopartikel (NPs) haben aufgrund ihres Potenzials bei der räumlichen, zeitlichen und Dosiskontrolle der Wirkstofffreisetzung beträchtliche Aufmerksamkeit erhalten. Die meisten der relevanten Technologien befinden sich jedoch noch im Entwicklungsprozess und sind für Kliniken nicht beschaffbar. Hier beschreiben wir eine einfache Herstellung dieser photoresponsiven NPs mit kommerziell erhältlichen Gold-NPs und thermoresponsiven Liposomen. Calcein wird als Modellmedikament verwendet, um die Verkapselungseffizienz und das kinetische Freisetzungsprofil nach Wärme-/Lichtstimulation zu bewerten. Schließlich zeigen wir, dass diese photogetriggerte Freisetzung auf die Membranauflockerung zurückzuführen ist, die durch Mikroblasenkavitation verursacht wird, die mit Hydrophon gemessen werden kann.
Einleitung
Die Möglichkeit, Arzneimittel-Freisetzung durch externe Stimuli ausgelöst wird eine attraktive Möglichkeit, die Drogen in räumlich, zeitlich-und Dosierung gesteuerten Moden mit maximierter Spezifität und minimalen Nebenwirkungen zu liefern. Unter einer Vielzahl von exogenen Stimuli reagierende Systeme (Licht, Magnetfeld, Ultraschall, Mikrowellen-Strahlung), lichtgesteuerten Plattformen sind attraktiv, wegen ihrer Nicht-Invasivität, Einfachheit und Anpassungsfähigkeit in den Kliniken. 1 Umfangreiche Forschung in den letzten zehn Jahren eine Vielzahl von Plattformtechnologien, wie beispielsweise im nahen Infrarot-Licht verantwortlich Gold (Au) Nanokäfige beschichtet mit intelligenten Polymeren, zwei Foto-labile polymere Nanopartikel (NP) konjugiert mit Drogen, 3 und selbstorganisierten porphysome Nanovesikeln zur Verfügung gestellt hat. 4 jedoch sind diese Technologien noch in den präklinischen Entwicklungsstadien, und ein klares Verständnis und die Optimierung der Parameter in den Prozess der Einleitung und Fortsetzung beteiligt erfordernWalzen der Wirkstofffreisetzung.
Eine der einfachsten und leicht zugängliche Verfahren zur Herstellung eines solchen Systems ist Gold-Nanopartikeln mit wärmeempfindlichen Liposomen 5,6, von denen beide weithin auf dem Markt verfügbar sind, zu integrieren und haben in präklinischen und klinischen Studien noch ausgiebig untersucht worden. Trotz der Beschränkung der tiefen Gewebe Aktivierung von Gold-Nanopartikeln an ihren plasmonischer Wellenlänge im Vergleich zu im nahen Infrarotbereich aktiviert Au-Nanostrukturen (zB Nanokäfige), dieses System hält immer noch sehr vielversprechend, wenn bei Kleintieren oder für topische Verabreichung beim Menschen eingesetzt. 7 Es gibt einige frühe Bemühungen in Kombination Gold-Nanopartikeln mit Liposomen für Licht ausgelöste Freisetzung. 8-11 Während die meisten von ihnen auf der Neuheit von Materialien konzentrieren, Zugänglichkeit und Skalierbarkeit Probleme müssen angegangen werden. Darüber hinaus Berichte über Freigabemechanismen dieser Nanotransporter verwenden, sind noch begrenzt.
Hierbei ist die Herstellung von fotoempfindlichenLiposomen gleichzeitig mit Drogen und hydrophilen Gold-Nanopartikel geladen ist beschrieben worden. Calcein wird als Modellverbindung verwendet, um die Verkapselungseffizienz und das Freisetzungsprofil des Systems zu bewerten. Zusätzlich wird in diesem System Licht, das von Gold-Nanopartikeln absorbiert leitet an die umgebende Mikroumgebung in Form von Wärme, was zu einer Erhöhung der lokalen Temperatur. Luftmikrobläschen während der Lasererhitzung und verursachen mechanische Zerstörung von Liposomen (Figur 1) erzeugt. Der Mechanismus der Mikrobläschen Kavitation wird durch Hydrophonmessungen bestätigt.
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Protokoll
1. Vorbereitung
- Saubere 100 ml Rundkolben mit Königswasser (1 Teil konzentrierter Salpetersäure (HNO3) und 3 Teilen konzentrierter Salzsäure (HCl)) und waschen Sie die Flaschen mit DI-Wasser. Autoklavieren der Kolben und trocknen Sie sie in einem Heißluftofen bei 100 ° C für 15 min. Wickeln Sie und speichern Sie die sterile Fläschchen bis zur Verwendung.
- Sterilisieren des Hand Mini-Extruder Satz mit 70% Ethanol.
- Schalten Sie den Rotationsverdampfer und stellen Sie die Temperatur des heißen Wasserbad und den Kühlturm bei 37 ° C und 4 ° C auf.
- Vorbereitung 60 mM Calcein Stammlösung durch Auflösen von 374 mg von Calcein in 10 ml von 0,1 mM phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4). Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH) -Lösung.
2. Synthese von Liposomen
- Entfernen der Lipide (1,2-Dipalmitoyl- sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphochoLeitung (MPPC) und 1, 2-Distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanol-Amin- N - [Carboxy (Polyethylenglykol) -2000] (Ammoniumsalz) (DSPE-PEG2000)) aus dem Gefrierschrank (-20 ° C) und tauen sie auf RT.
- Wiegen 15,9 mg DPPC, 1,3 mg gängigste Preisklasse und 2,8 mg DSPE-PEG2000. Man löst sie in 2 ml Chloroform zusammen.
- Übertragen der Chloroform-Lösung in den sterilen Kolben mit rundem Boden und verdampfe das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck unter Verwendung eines dünnen, trockenen Lipidschicht zu bilden.
- Hydrat der Lipidschicht bei 45 ° C mit 2 ml wässrige Lösung 30 min enthält, 1,95 ml 60 mM Calcein, hergestellt in Schritt 1,4 und 50 & mgr; l Gold-Nanopartikel (3,36 × 10 16 Partikel / ml).
- Vorheizen Heizblock auf 45 ° C. Legen Sie eine 200 nm Polycarbonat-Membranfilter zwischen den Filterträger und montieren Sie den Mini-Extruder-Set. Schauen Sie sich die möglichen Leckagen mit DI-Wasser.
- Füllen einer der Spritzen mit 1 ml Liposomenlösung aus Schritt 2.4 und EXTRUde der Probe, indem die Lösung auf die Spritze am anderen Ende des zusammen Mini-Extruder verläuft. Wiederholen Sie 11 mal.
- Führen Sie die synthetisierten Liposomen durch eine PD-10 Entsalzungssäule der freien Gold-Nanopartikeln, Lipide und Calcein unter Verwendung von PBS als Laufmittel zu entfernen, dem Protokoll des Herstellers nach.
- Lagern Sie die Proben in sterilen Röhrchen bei 4 ° C und in 2 Tagen nutzen.
3. Calceinfreisetzung von Liposomen mit Heizung
- Berechnen der Lipid Molarität der Vorratslösung durch die Molaritäten von DPPC, MPPC Addition und DSPE-PEG2000 in Schritt 2.2. Verdünne die Liposomenstammlösung zu 5 mM Lipidkonzentration unter Verwendung von 0,1 mM PBS-Puffer (pH 7,4). Übertragen Sie die Proben in ein Zentrifugenröhrchen (2 ml).
- Das Röhrchen wird in ein heißes Wasserbad, und erhöhen die Temperatur nach und nach von 25 bis 70 ° C. Erhöhen der Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 1 ° C / min zu.
- Sammeln Aliquots (10 ul) bei verschiedenen Temperaturpunkten (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 und 70 ° C).
- Zugabe von 10 ul 2% Triton X-100 2 ml Aliquot von liposomalen Lösung, die die Liposomen für 10 min bei RT zu verdauen und vollständigen Freisetzung von Calcein zu erzielen.
- Übertragen Sie 200 ul der liposomalen Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Mikroplatten und messen die Fluoreszenzintensität der gesammelten Proben eine Fluoreszenz-Mikroplattenlese verwenden. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen von Calcein sind 480 und 515 nm auf.
- Unter dem Fluoreszenzintensität der Triton X-100 behandelten Proben als 100% Release, berechnen den Anteil des frei Calcein zu jedem Zeitpunkt, nach der Formel:
Ft ist die Fluoreszenzintensität bei einer gegebenen Zeitpunkt Lösung. F i und F x die normalisierten Anfangs- und End-Fluoreszenzintensitäten der Lösung sind.
4. Calcein ReLeasing von Liposomen mit Pulsed Laser
- Übertragen Sie 100 ul Liposomen-Lösung zu einer Quarzküvette und legen Sie sie in einem Küvettenhalter. Verwenden eines gepulsten Nd: YAG-Laser mit einer Pulsdauer von 6 ns bei 532 nm Wellenlänge als Lichtquelle. Verwenden Sie das folgende Laserparameter - Wiederholungsrate: 1 Hz; Laserenergiedichte: 1 mJ / cm 2; Strahldurchmesser: 0,5 mm.
- Führe den kollimierten Laserstrahl durch die Küvette so dass das Licht durch die Liposomenlösung und sammeln Aliquots nach verschiedenen Impulse.
- Zugabe von 10 ul 2% Triton X-100 2 ml Aliquot von liposomalen Lösung, die die Liposomen für 10 min bei RT zu verdauen und vollständigen Freisetzung von Calcein zu erzielen.
- Calcein Anbetracht ist lichtempfindlich und können während der Laser Experiment Prämaß der bleichenden Wirkung gepulster Laser auf Calcein Lösung zur Normalisierung der Daten von Liposomenfreigabe gebleicht werden.
- Insbesondere Calcein-Lösung (60 mM) auf gepulste Laser wi aussetzenth Frequenz von 1 Hz für variierende Impulszahlen (0, 25, 50 und 100). Messen der Fluoreszenzintensität von Calcein mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 480 und 515 nm jeweils vor und nach der Laserbelichtung.
- Berechnen Sie die Menge an Bleich (Fluoreszenzintensität von Calcein vor der Laserbelichtung / Fluoreszenzintensität von Calcein nach dem spezifischen Impulszahl). Verwenden dieser Faktor die Werte aus Liposom erhaltenen Proben zu normalisieren, indem die Fluoreszenzintensität der Liposomen mit dem Faktor multipliziert wird.
- Messen der Fluoreszenzintensität des aufgefangenen Probe eine Fluoreszenzmikroplattenlesegerät bei Anregungs- und Emissionswellenlängen bei 480 und 515 nm unter Verwendung von jeweils.
- Unter dem Fluoreszenzintensität der Triton X-100 behandelten Proben als 100% Release, berechnen den Anteil des frei Calcein bei jedem Pulszahl, nach der Formel:
Ft ist die Fluoreszenzintensität bei einer bestimmten Impulszahl nach Normalisierung der Lösung. F i und F x die normalisierten Anfangs- und End-Fluoreszenzintensitäten der Lösung sind.
5. Messung der Druckimpulse
- Zeigen 100 ul der Probe auf einen Objektträger und den Fokus des Lasers auf die Probe.
- Tauchen eine Nadel Hydrophon (1 mm Durchmesser und 450 nV / Pa Empfindlichkeit) in die Lösung.
Achtung: Das Hydrophon darf nicht durch das Laserlicht beleuchtet werden, um die Beschädigungen zu vermeiden. - Bestrahlen der Probe mit dem gepulsten Laser mit unterschiedlichen Impulszahlen (0-100) und Pulsenergie (20-160 & mgr; J / Impuls).
- Nehmen Sie die Drucksignale ein digitales Oszilloskop.
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Ergebnisse
10: 4 oder 7,95: 0,65: Liposomen wurden in einem Molverhältnis von 86 ein herkömmliches Dünnfilm Hydratation Technik mit DPPC, MPPC und DSPE-PEG2000 aufgestellt. 1,39 mg / ml 12 Die Größe der Gold-Nanopartikel ist entscheidend, das Licht zu ermitteln, Umwandlungswirkungsgrad während des folgenden Laseranregung Experiment zu erhitzen. Kleiner die Größe von Gold-Nanopartikeln, höher ist die Wandlereffizienz. 13 So 5 nm Gold-Nanopartikeln, die kleinsten Proben des Anbi...
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Diskussion
Dünnfilmflüssigkeitszufuhr ist das herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Liposomen. Organische Lösemittel (Chloroform in diesem Fall) wurden zuerst verwendet, um die Lipide zu lösen und dann bei 37 ° C in einem Rotationsverdampfer entfernt, um einen Lipid-Dünnfilm auf dem Kolben zu erzeugen. Dieser Lipidfilm wurde mit der wässrigen Lösung hydratisiert 60 mM Calcein und 5 nm Gold-Nanopartikeln enthält. Während des Hydrationsvorganges wurde die Temperatur etwa 50 ° C gehalten und der Kolben wurde ständig gerührt, ind...
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Offenlegungen
Kein Interessenkonflikt deklariert.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Tier-1-Academic Research Fonds von Singapur Bildungsministerium (RG 64/12 zu CX) und NTU-Northwestern Institut für Nanomedizin unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) | Avanti Polare Lipide (Alabama, USA) | 850355P | Pulver, lagern bei -20 &de; C |
| 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin (MPPC) | Avanti Polare Lipide (Alabama, USA) | 855675P | Pulver, lagern bei -20 &de; C |
| 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polare Lipide (Alabama, USA) | 880120P | Pulver, lagern bei -20 ° C |
| Gold Nanopartikel | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 nm-Partikel, stabilisiert bei 0,1/nbsp; mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60 mM, pH 7,4 (einstellbar mit NaOH) |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0,1 mM, pH 7,4 |
| Doppeltes destilliertes Wasser | Millipore Milli-DI Wasseraufbereitungssystem | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | Zum Aufbrechen der Liposomen zur Berechnung der Gesamtverkapselung |
| Rotavapor | Büchi (Schweiz) | R 210 | Für die Lipososme-Aufbereitung |
| Heizbad | Buchi (Schweiz) | B 491 | Für die Lipososme-Aufbereitung |
| Vakuum-Controller | Büchi (Schweiz) | V-850 | Wird für die Lipososme-Aufbereitung |
| verwendet Vakuumpumpe | Büchi (Schweiz) | V-700 | Wird für die Lipososme-Aufbereitung |
| verwendet Rezirkulationsbad mit Temperaturregler | Polyscience | Wird für die Lipososme-Aufbereitung | |
| verwendet Mini-Extruder-Baugruppe mit Heizblock | Avanti Polar Lipids (Alabama, USA) | 610000 | Wird für die Extrusion von Liposomen |
| verwendet Spritzen, 1.000 μ l | Avanti Polar Lipids (Alabama, USA) | 610017 | Wird für die Extrusion von Liposomen |
| verwendet Polycarbonat-Filtermembran, 200 nm | Whatmann | 800281 | Wird für die Extrusion von Liposomen verwendet |
| Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, USA) | 610014 | Wird für die Extrusion von Liposomen |
| verwendet PD 10 Entsalzung von Coulums, Sephadex G-25 Medium | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0851-01 | Wird verwendet, um die Liposomen |
| zu reinigen Zentrifuge | Sigma Laborzentrifugen | 3K30 | Zur Konzentration der liposomalen Lösung |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Zur Konzentration der liposomalen Lösung |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Wird zur Bestimmung der Liposomengröße und des Zetapotentials | |
| verwendet UV-Sichtbares Spektralphotometer | Shimadzu | UV-2450 | Wird verwendet, um die Absorption der Proben zu messen |
| Fluoreszenzspektrofluorometer | Molekulare Bauelemente | SpectraMax M5 | Zur Messung der Fluoreszenzemission der |
| Proben Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximale Leistung: 17 Mj; Breite: 406 Nsec; Verwendet für die Probenbestrahlung | |
| HNR Hydrophon | ONDA | HNR-1000 | mm Durchmesser und 450 nV / Pa Empfindlichkeit, Geeigneter Arbeitsfrequenzbereich: 0,25-10 & nbsp; Mhz; Kalibrierung: 50 mV/Balken; Zur Messung der akustischen Signale |
| Digitales Oszilloskop | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | Frequenz: 600 MHz; Maximale Abtastrate: 10 Gs/sec (bei zwei Kanälen); Wird verwendet, um die gemessenen akustischen Signale aufzuzeichnen |
Referenzen
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