Um den Mechanismus der Lipidverwertung in Dottersackmembranen während der späten Stadien der Embryonalentwicklung von Vögeln zu untersuchen, haben wir ein primäres endodermales Epithelzellkultursystem für japanische Wachteln etabliert.
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Um den Mechanismus der Lipidverwertung in Dottersackmembranen während der späten Stadien der Embryonalentwicklung von Vögeln zu untersuchen, haben wir ein primäres endodermales Epithelzellkultursystem für japanische Wachteln etabliert.
Wir gründeten eine endodermaler epithelialen Zellkulturmodell (EWG) für die Funktion bestimmter Enzyme zu studieren und Proteine, die in Nährstoffverwertung von Vogelembryonen während der Entwicklung zu vermitteln. Befruchtete japanischen Wachteleier wurden für 5 Tage bei 37 ° C inkubiert und dann Dottersackmembranen (YSM) gesammelt wurden die EWG-Kultursystem zu etablieren. Wir isolierten die embryonale Endoderm Schicht aus YSM und in Scheiben geschnitten, die Membran in 2 - 3 mm Stücke und teilweise mit Kollagenase verdaut, bevor sie in 24-Well-Kulturplatten mit Animpfen. Die EECs proliferieren aus dem Gewebe und sind für die Zellkultur-Studien bereit. Wir fanden , dass die EECs typischen Eigenschaften YSM in vivo hatten, beispielsweise Akkumulation von Lipidtröpfchen, die Expression von Sterol O-Acyltransferase und Lipoprotein - Lipase. Die partielle Verdauung Behandlung signifikant erhöht die erfolgreiche Rate der EWG Kultur. Verwendung der EECs haben wir gezeigt, dass die Expression von SOAT1 durch die cAMP d reguliert wurdeependent Protein-A-verwandten Weg Kinase. Diese primäre japanische Wachtel EWG Kultursystem ist ein nützliches Werkzeug embryonale Lipidtransport zu untersuchen und die Rolle der Gene bei der Vermittlung der Nährstoffverwertung in YSM während avian Embryonalentwicklung beteiligt zu klären.
Der Hauptnahrungsressource des Vogelembryo yolk ist, bestehend aus 33% Lipiden, 17% Protein und 1% Asche. 1 Während der embryonalen Entwicklung, der Dottersack - Membran (YSM) wächst aus der embryonalen Bauchhöhle und erstreckt sich allmählich das Eigelb Oberfläche. Beginnend am embryonalen Tag 2, die Genexpression , die mit Lipid - Metabolismus und die Angiogenese wird in YSM allmählich erhöht, und die YSM entwickelt sich langsam villus artige Vorsprünge. 8,9 Diese Vorsprünge erhöhen die Absorption von Nährstoffen yolk embryonalen Entwicklung zu unterstützen. Die YSM ist ein extraembryonic Gewebe , das drei Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und E....
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Hinweis: Dieses Verfahren ist eine Modifikation eines Huhns Modellkulturprotokoll von Bauer entwickelte et al 2013 und Nakazawa et al, 2011. 2,9..
1. Bereiten Sie gesunde embryonale Tag 5 Embryonen aus der japanischen Wachtel
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Um das Ziel der Schaffung eines konsistenten und nützliche Zellmodell zu erreichen, müssen wir die Proliferationsrate und Leistung der aviären EECs zu erweitern und zu stabilisieren. Wir verglichen direkte Inkubation der Endoderm ohne Enzymverdauung mit Endoderm teilweise mit proteolytischen Enzymen wie Kollagenase oder Kollagenase und 0,6 U von Dispase verdaut. Dispase ist ein amino-Endopeptidase, die die N-terminalen Peptidbindungen von nicht-polaren Aminosäureresten hydrolysiert. Währ.......
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Da die vorherige Kultursystem nur begrenzten Erfolg hat, wird eine bessere Kultursystem erforderlich. Die japanische Wachtel YSM endoderm erfordert eine Behandlung mit proteolytischen Enzymen wie Kollagenase, die Zell-Zell-Verbindungen zu lösen bessere Wachstumsleistung in den ex-vivo-Explantate zu erreichen. Unsere Daten zeigen , dass die Zellzahlen von partiellen Verdau Behandlung waren größer als der unverdauten Gewebekultur nach 2 Tagen nach der Aussaat (Abbildung 1). Daher ist die partielle proteol.......
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Es bestehen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder sonstige Interessenkonflikte. Wir haben keine Finanzierung von einem privaten Unternehmen erhalten.
Die Finanzierung für die Entwicklung des aktuellen Protokolls ist vor allem durch "Ziel für die Top-Universität Plan" von der National Taiwan University, Taiwan (Zuschuss ID-104R350144) sowie das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (Erteilungs ID unterstützt: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Wir danken vor allem das Zentrum für Biotechnologie der National Taiwan University zur Bereitstellung eines Tierraum und Laborflächen für die aktuelle Studie.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco von Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | Zum Waschen der EECs |
| Pellets D-MEM/F-12 | Gibco von Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | Als Basalmedium bei der Kultivierung von EECs |
| NBCS | Gibco von Life technologies | 16010-159 | Als Versorgungsserum bei der Kultivierung von EECs |
| Pen-Strep Ampho. Lösung | BI (Biologische Industrie) | 03-033-1B 100 ml | Zur Eindämmung einer möglichen Infektion |
| Kollagenase Typ IV | Gibco von Life technologies | 17104-019 1 g | Kollagenase ist eine Protease mit Spezifität für die Bindung zwischen einer neutralen Aminosäure (X) und Glycin in der Sequenz Pro-XGly-Pro. Als Protease für die Dissoziation von Zellen vom Primärgewebe. |
| 24-Well-Platte | FALCON® | REF-353047 | Für EWGs zum Anbringen und Verlängern |
| 50 ml PP-Zentrifugenröhrchen | Corning® CentriStarTM | 430829 | Für den Transport von Membranen und den Enzymaufschluss |
| 50 ml Röhrchen mit konischem Boden und Kappe | PRO TECH | CT-50-PL-TW | Für den Transport von Membranen und den Enzymaufschluss |
| Reziprokes Schüttelbad | DEAGLE | SB302 | Für einen besseren enzymatischen Aufschluss auf Membranen |
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