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Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry

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DOI:

10.3791/53624

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10. März 2016

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um den Mechanismus der Lipidverwertung in Dottersackmembranen während der späten Stadien der Embryonalentwicklung von Vögeln zu untersuchen, haben wir ein primäres endodermales Epithelzellkultursystem für japanische Wachteln etabliert.

Zusammenfassung

Wir gründeten eine endodermaler epithelialen Zellkulturmodell (EWG) für die Funktion bestimmter Enzyme zu studieren und Proteine, die in Nährstoffverwertung von Vogelembryonen während der Entwicklung zu vermitteln. Befruchtete japanischen Wachteleier wurden für 5 Tage bei 37 ° C inkubiert und dann Dottersackmembranen (YSM) gesammelt wurden die EWG-Kultursystem zu etablieren. Wir isolierten die embryonale Endoderm Schicht aus YSM und in Scheiben geschnitten, die Membran in 2 - 3 mm Stücke und teilweise mit Kollagenase verdaut, bevor sie in 24-Well-Kulturplatten mit Animpfen. Die EECs proliferieren aus dem Gewebe und sind für die Zellkultur-Studien bereit. Wir fanden , dass die EECs typischen Eigenschaften YSM in vivo hatten, beispielsweise Akkumulation von Lipidtröpfchen, die Expression von Sterol O-Acyltransferase und Lipoprotein - Lipase. Die partielle Verdauung Behandlung signifikant erhöht die erfolgreiche Rate der EWG Kultur. Verwendung der EECs haben wir gezeigt, dass die Expression von SOAT1 durch die cAMP d reguliert wurdeependent Protein-A-verwandten Weg Kinase. Diese primäre japanische Wachtel EWG Kultursystem ist ein nützliches Werkzeug embryonale Lipidtransport zu untersuchen und die Rolle der Gene bei der Vermittlung der Nährstoffverwertung in YSM während avian Embryonalentwicklung beteiligt zu klären.

Einleitung

Der Hauptnahrungsressource des Vogelembryo yolk ist, bestehend aus 33% Lipiden, 17% Protein und 1% Asche. 1 Während der embryonalen Entwicklung, der Dottersack - Membran (YSM) wächst aus der embryonalen Bauchhöhle und erstreckt sich allmählich das Eigelb Oberfläche. Beginnend am embryonalen Tag 2, die Genexpression , die mit Lipid - Metabolismus und die Angiogenese wird in YSM allmählich erhöht, und die YSM entwickelt sich langsam villus artige Vorsprünge. 8,9 Diese Vorsprünge erhöhen die Absorption von Nährstoffen yolk embryonalen Entwicklung zu unterstützen. Die YSM ist ein extraembryonic Gewebe , das drei Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und Ektoderm enthält. 14 Der Dottersack ectoderm steht das Eiweiss und Verbindungen mit der Dotterhaut vorsichtig auf die Dottersack abzudecken. Die endodermaler Epithelzellen direkt auf das Eigelb und dienen als Nährstoffverwertung Portale konfrontiert. 6 Wie der YSM erweitert, endodermaler Epithelzelle (EECs) durch shap unterteilt werdene und Funktionalität in zwei Gruppen, Bereich Dotter und Bereich vasculosa. 7

Gebiet vitelline besteht aus Entodermzellen und ist weit entfernt von dem Embryo; Bereich vasculosa aus mesodermalen Zellen zusammengesetzt und umfasst differenzierte EECs mit Blutgefäßen und Bindegewebe. Durch die embryonale Tag 5 wird das Eigelb vollständig von Ektoderm und Entoderm von YSM bedeckt und das Gefäßbereich ist schnell gewachsen. Die YSM absorbiert, neu zusammensetzt und gibt Lipiden (wie Eigelb abgeleitetes Lipoprotein sehr niedriger Dichte) und Proteine ​​in die embryonalen Kreislaufsystem. 9, 2 Daher wir eine primäre japanischen Wachteln embryonalen endodermalen epithelialen Zellkultur - System, die Mechanismen von Lipid zu studieren Nutzung in YSM während aviären embryonalen Entwicklung.

Lipids wie Triacylglycerol, Lecithin, Phospholipid und Cholesterinester (CE) sind die primären Energiequellen für Vogelembryonen. In den frühen Stadien der Entwicklung, yolk Lipide sind Cin Vogelembryo YSM omposed von nur 1,3% CE und es steigt auf 10-15% bei Halbzeit der aviären Embryonalentwicklung 3, 11. Cholesterinester wird aus Cholesterin durch Sterin O-Acyltransferase 1 (SOAT1) synthetisiert. 4

Die Speicherform von Cholesterin ist CE, CE in Lipoproteinen getragen wird, und Lipoproteine ​​durch Zirkulation zu den Geweben transportiert werden. 13 Eine Woche vor Luke dort schnelle Wachstum von Vogelembryonen ist. Etwa 68% der verbleibenden Lipidgehalte in Eigelb werden in dieser Phase absorbiert. 10 Der Mechanismus , mit dem Eigelb Lipide verwendet werden , können durch eine EWG - Forschungsmodell geklärt werden. Ein Huhn EWG Kulturprotokoll wurde festgestellt , diese Forschungsziel zu erreichen. 2, 9 jedoch aufgrund der geringen Erfolgsrate von Gewebeexplantaten wird eine verbesserte EWG Zellkulturverfahren benötigt , um die Funktion bestimmter Enzyme und Proteine ​​, die in der Vermittlung Nährstoffausnutzung zu untersuchen , indem Vogelembryos während der Entwicklung.

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Protokoll

Hinweis: Dieses Verfahren ist eine Modifikation eines Huhns Modellkulturprotokoll von Bauer entwickelte et al 2013 und Nakazawa et al, 2011. 2,9..

1. Bereiten Sie gesunde embryonale Tag 5 Embryonen aus der japanischen Wachtel

  1. Platz 1 männliche und 3 weibliche geschlechtsreif japanischen Wachtel zusammen im selben Käfig. Versorgung Futter und Wasser ad libitum. Stellen Sie die Licht im Tierraum bis 14 h Licht und 10 h Dunkelheit.
  2. Sammeln Sie befruchtete Eier in Plastiktüten jeden Tag am Nachmittag und halten sie in einem 16 ° C Kühl die Wachstumsrate von Embryonen zu verzögern.
  3. eine ausreichende Anzahl von Eiern in einem Zeitraum von zwei Wochen, brüten die befruchteten Eier in einem 37 ° C Inkubator mit guter Belüftung für fünf Tage Nach dem Sammeln.

2. Bereiten Sie Basal Medium und Waschlösungen

  1. Verwenden DMEM / F-12-Medium (eingestellt auf pH 7,2) als Wachstumsmedium und ergänzen esmit 10% Neugeborenen Kälberserum (NBCS) und 1% Pen-Strep Ampho. Lösung (PSA; Penicillin, 10 5 Einheiten / L; Streptomycin, 100 mg / L; Amphotericin B, 0,25 mg / L).
  2. Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Lösung bei einer 10-fach-Konzentration für die Lagerung; verwenden 1x PBS - Lösung (enthaltend NaCl, 137,93 mM; KCl, 2,667 mM; KH 2 PO 4, 1,471 mM; Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 8,06 mM; einstellen auf pH 7,2) , um den Dottersack Membran , während zu waschen und zu befeuchten Trennen des Endoderm aus Eigelb und Albumin.
  3. Verwenden DMEM-Medium (eingestellt auf pH 7,2) auf Endoderm Pellets resuspendieren.

3. Erhebung von Primär EECs aus der japanischen Wachtel YSMs

  1. Inkubieren Sie die gesammelten Eier für 5 Tage (Schritt 1.3). Untersuchen Sie die Eier von einem Ei candler zur normalen embryonalen Entwicklung bestätigen.
    HINWEIS: Bei den embryonalen Tag 5, ist die Grenze von YSM Mesoderm sehr klar, und die drei embryonalen Schichten sind weniger eng miteinander verbunden sind, so ist es leicht zu OBTain endoderm. Verwenden Sie nur die Eier normalen Kapillarzirkulation Entwicklung für YSM Sammlungen zeigen.
  2. Reinigen Sie die Eischale sorgfältig frisches Wasser und 75% Ethanol. Öffnen Sie die Eischale aus der Luftzelle Position durch eine Schere, sanft schälen heraus und das gesamte YSM mit einer Pinzette und in eine 10 cm Kulturschale gefüllt mit 37 ° C 1x PBS.
  3. Mit Schere den Embryo, Eigelb und Eiweiß, zu entfernen und vorsichtig die YSM mit 1x PBS dreimal waschen und legen YSM in PBS-Lösung in einer 10 cm Kulturschale.
  4. Verwenden einer Pinzette und eine Schere das Ektoderm von YSM zu entfernen. Verwenden Sie zwei Zangen, ein fest halten Sie die endodermaler Zellschicht, und die andere die Kapillare Mesoderm zu halten.
  5. Unter einem Binokular, auseinanderziehen und die endoderm vom Rand des Mesoderms in Richtung auf den Embryo zu trennen. Sammeln Sie die hellgelbe endoderm in 50 ml Zentrifugenröhrchen eine Pipette und in 15 ml Wachstumsmedium in einem 37 ° C wat miter Bad, bis alle Gewebesammlungen sind abgeschlossen.

4. Die Verdauung des Endoderm Scheiben von Collagenaseverdau

  1. auflösen frisch 6,5 Einheiten vom Typ IV-Kollagenase in 10 ml DMEM.
  2. Zentrifugieren der 50-ml-Röhrchen (3.4) bei 130 × g für 3 min bei RT. Saugen Sie das Medium und legen alle endoderm in einer 6 cm Kulturschale mit einer Pipette. 1 ml Kollagenase-Lösung dieses Kulturschale.
  3. Schneiden Sie sammelte die endoderm von 2 Wachteln Embryonen mit einem Paar von gebogenen Schere, bis die Größe jeder Scheibe beträgt ca. 2 bis 3 mm. Verwenden Sie eine Pipette, sammeln Sie alle Scheiben in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 9 ml frischem Kollagenase-Lösung.
  4. Digest des Gewebes mit Kollagenase für 30 min in einem 37 ° C Schüttelwasserbad bei 175 Umdrehungen pro Minute. Diese partielle Digestion mit Kollagenase wird verwendet, um das Explantat-Zellproliferation zu verbessern.
  5. Zentrifuge bei 130 × g für 3 min bei RT und entfernen leicht die Überstandsfraktion mit einer Pipette. Waschen Sie das Pellet durch Suspension in 20 ml DMEM und entfernen Sie die überstehenden Fraktion nach 130 xg Zentrifugation für 3 min.
  6. Re-suspend das Pellet mit 12 ml Wachstumsmedium (DMEM / F12 mit 10% NBCS und 1% PSA) und sanft und gleichmäßig in einer 24-Well-Platte (jeweils gut mit 500 ul Zelllösung) Samen.
  7. Inkubieren Gewebeexplantaten bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft für 2 Tage Zellen zu ermöglichen aus dem Gewebe zu vermehren.
  8. Inkubiere Zellen für weitere 2 Tage und Charakterisierung von für die Lebensfähigkeit der Zellen durch eine Assayprotokoll die Zellebensfähigkeit. 15
    HINWEIS: Lebende Zellen pflegen eine reduzierende Umgebung im Cytosol. Resazurin, der Wirkstoff, ein nicht-toxisches, zellpermeablen Verbindung, die in der Farbe blau ist und praktisch nicht fluoreszierend. Wenn zu Zellkulturen gegeben, ist Resazurin reduzierte durch mitochondriale Enzyme im Cytosol zu Resorufin. Resorufin ist in der Farbe rot und stark fluoreszierend. Lebensfähige Zellen kontinuierlich konvertieren Resazurin zu Resorufin, increAsing die Gesamtfluoreszenz und die Farbe des Kulturmediums umgebenden Zellen.
  9. Führen Sie endoderm Epithelzelle Gesamt - RNA Isolierung, reverse Transkription und quantitative Echtzeit - PCR von Marker - Gen - mRNA - Expression , wie beschrieben. 16,17
    1. Verwendung der PCR-Reverse-Transkriptase-SOAT1 mRNA zu detektieren (sense: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; Antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR product = 168 bp) als ein spezifischer Marker für den EWG-Zellen. Verwenden β-Actin-mRNA (Sense: 5 'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3'; Antisense: 5 'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR-Produkt = 151 bp) als Housekeeping-Gen und die interne Kontrolle.
    2. Verwenden Sie Gel-Elektrophorese die Produktgröße von RT-qPCR zu erkennen. Bereiten Sie 1% Agarose-Gel und mischen 10 ul qPCR-Produkt mit 2 & mgr; l Lade Farbstoff. Last 10 ul Gemisch in jede Vertiefung in der 1% Agarose-Gel, und führen Sie das Gel durch 100V für 30 min.

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Ergebnisse

Um das Ziel der Schaffung eines konsistenten und nützliche Zellmodell zu erreichen, müssen wir die Proliferationsrate und Leistung der aviären EECs zu erweitern und zu stabilisieren. Wir verglichen direkte Inkubation der Endoderm ohne Enzymverdauung mit Endoderm teilweise mit proteolytischen Enzymen wie Kollagenase oder Kollagenase und 0,6 U von Dispase verdaut. Dispase ist ein amino-Endopeptidase, die die N-terminalen Peptidbindungen von nicht-polaren Aminosäureresten hydrolysiert. Währ...

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Diskussion

Da die vorherige Kultursystem nur begrenzten Erfolg hat, wird eine bessere Kultursystem erforderlich. Die japanische Wachtel YSM endoderm erfordert eine Behandlung mit proteolytischen Enzymen wie Kollagenase, die Zell-Zell-Verbindungen zu lösen bessere Wachstumsleistung in den ex-vivo-Explantate zu erreichen. Unsere Daten zeigen , dass die Zellzahlen von partiellen Verdau Behandlung waren größer als der unverdauten Gewebekultur nach 2 Tagen nach der Aussaat (Abbildung 1). Daher ist die partielle proteol...

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Offenlegungen

Es bestehen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder sonstige Interessenkonflikte. Wir haben keine Finanzierung von einem privaten Unternehmen erhalten.

Danksagungen

Die Finanzierung für die Entwicklung des aktuellen Protokolls ist vor allem durch "Ziel für die Top-Universität Plan" von der National Taiwan University, Taiwan (Zuschuss ID-104R350144) sowie das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (Erteilungs ID unterstützt: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Wir danken vor allem das Zentrum für Biotechnologie der National Taiwan University zur Bereitstellung eines Tierraum und Laborflächen für die aktuelle Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco von Life technologies12800-017 10 X 1 LZum Waschen der EECs
Pellets D-MEM/F-12Gibco von Life technologies12400-024 10 X 1 LAls Basalmedium bei der Kultivierung von EECs
NBCSGibco von Life technologies16010-159Als Versorgungsserum bei der Kultivierung von EECs
Pen-Strep Ampho. LösungBI (Biologische Industrie)03-033-1B 100 mlZur Eindämmung einer möglichen Infektion 
Kollagenase Typ IVGibco von Life technologies17104-019 1 g  Kollagenase ist eine Protease mit Spezifität für die Bindung zwischen einer neutralen Aminosäure (X) und Glycin in der Sequenz Pro-XGly-Pro. Als Protease für die Dissoziation von Zellen vom Primärgewebe.
24-Well-PlatteFALCON® REF-353047Für EWGs zum Anbringen und Verlängern
50 ml PP-ZentrifugenröhrchenCorning® CentriStarTM430829Für den Transport von Membranen und den Enzymaufschluss
50 ml Röhrchen mit konischem Boden und KappePRO TECHCT-50-PL-TWFür den Transport von Membranen und den Enzymaufschluss
Reziprokes SchüttelbadDEAGLESB302Für einen besseren enzymatischen Aufschluss auf Membranen
von

Referenzen

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Kollagenase VerdauZellproliferationsassayRT qPCR AnalyseLipidtr pfchenakkumulationSOAT1 ExpressioncAMP Signalwegregulierungavi re Embryonalentwicklung

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