Optogenetische Ansätze sind weit verbreitet zu manipulieren neuronale Aktivität und bewerten die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion verwendet. Hier wird eine Technik erläutert , dass bei in - vivo - Expression des optischen Aktivator Channelrhodopsin, ermöglicht eine ex vivo Analyse der synaptischen Eigenschaften bestimmter großer Reichweite und lokale neuronale Verbindungen in Angst bezogenen Schaltungen.
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Methodenartikel
Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Optogenetische Ansätze sind heute weit verbreitet durch die Kombination gezielte Expression von lichtaktivierten Proteine und die anschließende Manipulation der neuronalen Aktivität die Funktion neuronaler Populationen und Schaltungen, die durch Licht zu studieren verwendet. Channelrhodopsinen (CHRS) sind lichtgesteuerter Kationenkanäle, und wenn ihre Expression ermöglicht die Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung spezifischer Zelltypen und deren axonale Projektionen in definierten Bereichen des Gehirns zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Via stereotaktische Injektion von viralen Vektoren, ChR Fusionsproteine konstitutiv werden können oder bedingt in spezifischen Zellen eines bestimmten Gehirnregion zum Ausdruck gebracht, und ihre axonalen Projektionen können anschließend anatomisch und funktionell mit Hilfe von Ex - vivo - optogenetische Aktivierung in Hirnschnitten untersucht werden. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zielens synaptischen Eigenschaften der Verbindungen zu verstehen, die nicht mit herkömmlichen elektrischen Stimulations Ansätzen angegangen werden können, oder bei der Identifizierung von neuen AffeMiete und ableitende Konnektivität, die bisher kaum verstanden wurde. Hier einige Beispiele veranschaulichen, wie diese Technik angewendet werden kann, um diese Fragen zu Aufklären Angst bezogenen Schaltungen in der Amygdala zu untersuchen. Die Amygdala ist eine Schlüsselregion für den Erwerb und die Expression von Angst und Speicherung von Angst und emotionale Erinnerungen. Viele Beweislinien legen nahe, dass die medialen präfrontalen Kortex (mPFC) in verschiedenen Aspekten der Angst Erfassung beteiligt und Extinktion, aber seine genaue Konnektivität mit der Amygdala beginnt gerade zu verstehen. Zuerst wird gezeigt , wie ex vivo optogenetische Aktivierung verwendet werden können Aspekte der synaptischen Verbindung zwischen mPFC Afferenzen und Zielzellen in der basolateralen Amygdala (BLA) zu studieren. Ferner ist dargestellt , wie diese ex vivo optogenetische Vorgehensweise angewendet werden kann , um neue Konnektivitätsmuster unter Verwendung einer Gruppe von GABA - ergen Neuronen in der Amygdala, dem paracapsular interkalierten Zellcluster (mpITC) als Beispiel zu bewerten.
Einleitung
Präzise Werkzeuge zur Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung von spezifischen Verbindungen zwischen den Gehirnbereichen und bestimmten Arten von Neuronen werden immer wichtiger, um die funktionelle Konnektivität zugrunde liegende gesunde Gehirnfunktion und Krankheitszuständen zu verstehen. Idealerweise führt diese physiologische Untersuchung der genauen synaptischen Eigenschaften, mit denen identifiziert Neuronen kommunizieren. Dies gilt insbesondere für Verbindungen zwischen Gehirnbereichen, die nicht in einer einzigen akuten Hirnschnitt erhalten werden kann. In der Vergangenheit wurde dies in getrennten Experimenten weitgehend erreicht. Zum einen injizierten ....
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Protokoll
Ethik Aussage: Alle experimentellen Verfahren waren in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über die Verwendung von Tieren in der Forschung und wurden von der lokalen Animal Care und Use Committee (Regierungspräsidium Tübingen, Baden-Württemberg, Deutschland), die für die Universität Tübingen genehmigt.
1. Stereotactic Injektionsverfahren
- Bereiten Sie sterile Werkzeuge (Schere, Skalpell, Klemmen, Bohrer, Nadeln, Nahtmaterial) mit einem Sterilisator. Anordnen sterile Instrumente und andere erforderliche Lösungen und Chirurgie liefert wie sterile Baumwoll Swaps, Desinfektionsmittel, sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und H ....
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Ergebnisse
Dieser Abschnitt zeigt den Workflow eines ex vivo optogenetischen Ansatz und repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen experimentellen Strategien , um die physiologischen Eigenschaften von sensorischen und modulierende Langstrecken - Projektionen BLA und mpITC Neuronen sowie Eigenschaften der lokalen Konnektivität zwischen mpITC und BLA zu untersuchen.
Nach stereotaktische Injektion des ausgewählten Virusvektor an d.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur ex vivo optogenetische Untersuchung von neuronalen Schaltkreise und lokale Konnektivität , die leicht auf die meisten umgesetzt werden können, wenn alle aufrechten Scheibe Patch-Clamp - Aufnahme - Setups , indem sie mit einem ~ 470 nm LED an der Epifluoreszenz Licht Port Ausrüstung nicht. Ein großer Vorteil der optogenetische Stimulation der axonale Projektionen in Scheiben ist, dass es für die spezifische Aktivierung und Untersuchung von Eigenschaften von Verbindun.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken Cora Hübner und Andrea Gall für ihre Hilfe bei der Erfassung einiger repräsentativer Ergebnisse. Diese Arbeit wurde gefördert durch das Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) an der Universität Tübingen, eine von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzinitiative (EXC 307) geförderte Exzellenzinitiative und aus Mitteln der Gemeinnützigen Hertie-Stiftung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Surgery | |||
| Stereotaktischer Rahmen | Stoelting, USA | 51670 | kann durch einen anderen stereotaktischen Rahmen für Mäuse ersetzt |
| Steretoxischer Rahmen Mausadapter | Stoelting, USA | 51625 | kann durch einen anderen stereotaktischen Rahmen für Mäuse ersetzt |
| Gasanästhesiemaske für Mäuse | Stoelting, USA | 50264 | nicht mehr lieferbar, ersetzt durch Art.-Nr. 51609M |
| Druckinjektionsgerät, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | andere Druckinjektionsgeräte (z.B. Picospritzer) können verwendet werden |
| Kwik Fill Glaskapillaren | World Precision Instruments, Deutschland | 1B150F-4 | |
| Anästhesiegerät, IsoFlo | Eickemeyer, Deutschland | 213261 | |
| DC Temperaturregler und Heizkissen | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontaler Mikropipettenabzieher Modell P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Sterilisator für chirurgische Werkzeuge, Sterilisator 75 | Melag, Deutschland | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (Serotyp 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (Serotyp 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (Serotyp 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| schnell grün | Roth, Deutschland | 0301.1 | |
| Isofluran Anästhetikum, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Deutschland | ||
| Antiseptikum, Betadin (Providon-Jod) | Purdure Products, USA | BSOL32 | kann durch anderes Desinfektionsmittel ersetzt |
| werden Analgetikum, Metacam Lösung (5mg/ml Meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Deutschland | kann durch andere Analgetika ersetzt werden | |
| Bepanthen Augensalbe | Bayer, Deutschland | 0191 | kann durch andere Augensalbe ersetzt werden |
| Bohrer NM3000 (SNKG1341 und SNIH1681) | Nouvag, Schweiz | ||
| Sutranox Nahtnadel | Fine Science Tools, Deutschland | 12050-01 | |
| Geflochtene Seide Naht | Fine Science Tools, Deutschland | 18020-60 | |
| Aufzeichnungen, Lichtstimulation und Analyse | |||
| künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) | für die Zusammensetzung siehe Referenzen #16 und #23 | ||
| Interne Patch-Lösungen | für die Zusammensetzung siehe Referenzen #16 und #23 | ||
| MagnesiumSulfat-Heptahydrat | Roth, Deutschland | P027.1 | Bereiten Sie 2M Stammlösung in gereinigter Flüssigkeit vor Wasserschneider |
| , Microm HM650V | Fisher Scientific, Deutschland | 920120 | |
| Kühleinheit für Tissue Slicer, CU65 | Fisher Scientific, Deutschland | 770180 | |
| Saphirklinge | Delaware Diamond Knives | Sonderanfertigung, Anfrage bei der Firma | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite Leuchtstofflampe (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Kanada | 2012-12699 | |
| Patch-Mikroskop, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B Patch-Verstärker | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp Software, Version 10 | Molecular Devices, USA | zur Steuerung der Datenerfassung und -stimulation | |
| Bad-Temperaturregler, TC05 | Luigs & Neumann, Deutschland | 200-100 500 0145 | |
| Dreiachsiger Mikromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Deutschland | 210-100 000 0010 | |
| Mikromanipulator-Steuerung SM7 | Luigs & Neumann, Deutschland | 200-100 900 7311 | |
| Glaskapillaren für Patch-Pipetten | World Precision Instruments, Deutschland | GB150F-8P | |
| Zellulosenitrat-Filterpapier für die Grenzflächenkammer | Satorius Stedim Biotech, Deutschland | 13006--50----ACN | |
| LED-Einheit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED oder USL 70/470 und entsprechende Adapter sind zwei alternative Optionen für die LED-Stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTER-50E | CoolLED oder USL 70/470 und entsprechende Adapter sind zwei alternative Optionen für LED-Stimulation |
| LED-Einheit, USL 70/470 | Rapp Optoelektronische | L70-000 | CoolLED oder USL 70/470 und entsprechende Adapter sind zwei alternative Optionen für die LED-Stimulation |
| Dual-Port-Adapter | Rapp Optoelectronic | erkundigen Sie sich bei der Firma | CoolLED oder USL 70/470 und entsprechende Adapter sind zwei alternative Optionen für die LED-Stimulation |
| Filterset rot (Anregung) | AHF, Deutschland | F49-560 | Filter können als Set gekauft werden F46-008 |
| (Strahlteiler) | AHF, Deutschland | F48-585 | Filter können als Set F46-008 gekauft werden |
| (Emission) | AHF, Deutschland | F47-630 | Filter können als Set gekauft werden F46-008 |
| Filterset grün (Anregung) | AHF, Deutschland | F39-472 | Alternativ: Filterset F36-149 oder F46-002 (mit Bandpass-Emission) |
| (Strahlteiler) | AHF, Deutschland | F43-495W | Alternativen: Filterset F36-149 oder F46-002 (mit Bandpass-Emission) |
| (Emission) | AHF, Deutschland | F76-490 | Alternativen: Filterset F36-149 oder F46-002 (mit Bandpass-Emission) |
| LaserCheck, Handheld-Leistungsmesser | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | für die elektrophysiologische Datenanalyse, andere alternative Softwarepakete können ebenfalls verwendet werden | |
| Neuromatische Makro-Suite für IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | für die elektrophysiologische Datenanalyse, andere alternative Softwarepakete können ebenfalls verwendet werden | |
| Post-hoc-Analyse von Injektionen und Projektionen | |||
| Paraformaldehyd-Pulver (PFA) | Roth, Deutschland | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blau fluoreszierender Nissl-Farbstoff | Invitrogen | N-21479 | |
| Agar-Agar zum Einbetten und Resektionieren | Roth, Deutschland | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm Petrischalen zum Einbetten | SPL Life Naturwissenschaften | Alternativen können verwendet werden | |
| Objektträger, Super Frost | R. Langenbrinck, Deutschland | 61303802 | Alternativen können verwendet werden |
| Deckgläser | R. Langenbrinck, Deutschland | 3000302 | Alternativen können verwendet werden |
| Vecta Shield Eindeckmedium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative Eindeckmedien können verwendet werden |
| Zellulosenitratfilter zum Abflachen Scheiben zur Fixierung | Satorius Stedim Biotech, Deutschland | 11406--25------N | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop LSM 710 | Zeiss, Deutschland |
Referenzen
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale....
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Nachdrucke und Genehmigungen
