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Methodenartikel

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

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DOI:

10.3791/53637

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18. Februar 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die dreidimensionale Kultur in Alginatkügelchen wurde aufgrund ihrer Einfachheit und Reproduzierbarkeit ausgewählt, um die Hypophysenadenomzellen zu erhalten. Die Verfahren umfassten einen initialen enzymatischen Verdau und eine mechanische Dissoziation des Tumorgewebes, und die anschließende Zellsuspension wurde in Alginatkügelchen verkapselt.

Zusammenfassung

Eine dreidimensionale Kulturverfahren ist in dem primären Hypophysenadenom Zellen sind in Alginatperlen gewachsen. Alginat ist ein Polymer aus Braun Meeresalgen abgeleitet. Kurz gesagt wird das Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und einer enzymatischen Verdauung mit Collagenase und Trypsin vorgelegt. Als nächstes wird eine Zellsuspension erhalten. Die Tumorzellsuspension wird mit 1,2% Natriumalginat gemischt und in eine CaCl 2 -Lösung und die Alginat / Zellsuspension wird bei Kontakt mit der CaCl 2 gelierten kugelförmigen Kügelchen zu bilden. Die Zellen in den Alginatkugeln eingebettet sind mit Nährstoffen durch die Kulturmedium, angereichert mit 20% FBS vorgesehen geliefert. Dreidimensionalen Kultur in Alginat-Perlen hält die Lebensfähigkeit der Zellen Adenom für längere Zeit, bis zu vier Monate. Darüber hinaus können die Zellen aus dem Alginat befreit werden, indem die Kügelchen mit Natriumcitrat gewaschen und für weitere immunzytochemischen Analysen auf Deckgläser ausgesät. Die Verwendung eines cell Kulturmodell ermöglicht die Fixierung und Visualisierung der Aktin-Zytoskelett mit minimalem Desorganisation. Zusammenfassend bieten Alginatkügelchen eine zuverlässige Kultursystem für die Wartung von Hypophysenadenom Zellen.

Einleitung

Dreidimensionale Gerüste wurden in Zellkultur ausgiebig verwendet, weil sie eine dreidimensionale strukturelle Unterstützung für kultivierte Zellen und die Aufrechterhaltung der Zell-zu-Zell-Kommunikation 1 bereitzustellen. Natürlich abgeleitete Polymer-Materialien wurden zu machen dreidimensionalen Gerüsten einschließlich Typ I-Kollagen, Chitosan und Alginat. Alginat ist ein natürliches Polymer, abgeleitet von dem braunen Meeresalgen Macrocystispyrifera (Kelp). Dieses Polymer besteht aus wiederkehrenden Einheiten von β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) 2 und bildet stabile Gele in Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Kationen, wie Calcium und Barium. Calciumchlorid (CaCl 2) Lösungen werden als Vernetzungsreagens zu bilden Alginatkügelchen verwendet. Alginat-Lösungen fiel in CaCl2 sofort dreidimensionale kugelförmige Gele bilden. Wenn die Alginat-Lösung mit Zellen gemischt wird, werden die Zellen in das Alginat b eingekapseltEADS 3.

Alginat hat Eigenschaften, die es ermöglicht haben als Matrix für die Verkapselung von einer Vielzahl von Zellen verwendet werden, einschließlich Chondrozyten 4, Skelettmyoblasten 5 und 6 neuralen Stammzellen. Es ist ein inertes Material und ermöglicht die Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff und Stoffwechselprodukte, die das Überleben der Zelle und Funktion aufrechtzuerhalten; Darüber hinaus im Gegensatz zu anderen Gelbasis Kultursystemen, in Alginatperlen kultivierten Zellen können auch aus dem Gerüst unter Verwendung von Calciumchelatoren, wie Natriumcitrat, und die Zellen können dann für weitere Untersuchungen 7 geerntet werden freigesetzt werden.

Hypophysenadenomen sind in der Regel gutartige Tumoren mit niedrigem Proliferationsraten. Ratte Hypophysenadenom Zelllinien wurden in einem zweidimensionalen System 8 erfolgreich gezüchtet worden. Allerdings ist diese Kultur des sekretorischen menschlichen Hypophysen-Zelltumoren keine effiziente Entwicklung; schlecht dispergiert Tumor der Hypophyse Zellen wachsenin Kultur zeigen die Zellen begrenzte Anhaftung und Ausbreitung, und die Zellen bilden typischerweise Floating-Aggregate in der Kulturschale 9,10.

Mehrere Versuche wurden unternommen, einen Tumor hypophysären Zellsuspension, einschließlich einer enzymatischen und mechanischen Dispersion Ansatz 11 ist eine ausschließlich mechanische Dispersion Ansatz 12 und der Kultivierung von Tumor Explantate 10 zu erhalten, hergestellt. Mit diesen Ansätzen wurden verschiedene Autoren erhaltene lebensfähige anhaftende Kulturen für unterschiedliche Zeiträume. Die Kapazitäten der Tumor sekretorischen Zellen in diesen zweidimensionalen Systemen hängen von der Tumorart und ihre Proliferationsraten 9 zu überleben. Jedoch wird in Langzeitkulturen, Zellen mit Fibroblasten-Phänotypen wiegen 11,13. Dieser Beitrag beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Primärkultur von Hypophysenadenom Zellen in Alginatbeads eingekapselt zu erhalten, die weiter sie von der Alginat-Gerüst befreit, die detaillierte ermöglicht Analysen vonAspekte ihrer Zellbiologie, zB deren Zytoskelett-Arrangements.

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Protokoll

Diese Studie wurde für die Verwendung von menschlichem Material von den lokalen Ethikkommissionen der medizinischen Einrichtung und dem Zentrum für Forschung und Voraus Studien des Nationalen Polytechnischen Institut genehmigt.

1. Tumorprobe Acquisition

  1. Beziehen Sie die Hypophysenadenom Gewebebiopsie aus einem Patienten durch eine trans-Keilbein chirurgischen Eingriff 14.
  2. Sammeln Sie die Hypophysenadenom Probe und legen Sie sie in eine sterile Glasflasche mit 50 ml frischem 199 Kulturmedium (M199), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 0,6 mg / ml Natriumbicarbonat, 2,4 mg / ml HEPES und 1% Antibiotika (Penicillin / Streptomycin) bei pH 7,4. Pflegen Sie die Probe in einer Glasflasche auf Eis.
    Hinweis: Das Tumorgewebe mehrere Stunden nach der Operation verarbeitet werden können.
  3. Transportieren Sie das Tumorprobe an das Labor in der Glasflasche auf Eis.

2. Herstellung der Gewebedissoziation Lösungen enzymatische, dieTrypsininhibitorlösung und das Alginat-Lösungen

Hinweis: Vor dem Zellkulturverfahren die folgenden Lösungen vorbereitet. Filter alle Lösungen unter Verwendung eines 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung.

  1. Bereiten Kollagenase 1% ige Lösung durch Auflösen von 5 mg Collagenase (Typ I) in 5 ml M199-Serum frei.
  2. Bereiten 0,01% Trypsin-Lösung durch Auflösen von 0,01 g Trypsin in 10 ml PBS-EDTA 0,3%.
  3. Bereiten 0,1% Trypsin-Inhibitor-Lösung durch Auflösen von 2 mg Soja-Trypsin-Inhibitor in 20 ml M199-Serum frei.
  4. Bereiten DNAse-Lösung von 20 & mgr; l DNAse I 134 U / ml in 4 ml der Trypsin-Inhibitor-Lösung auflöst.
  5. Bereiten EGTA-Lösung (1,2 M) durch Auflösen von 22,8 mg EGTA in 40 ml von 155 mM NaCl. Den pH-Wert auf 7,4. Weiterhin auf ein Endvolumen von 50 ml.
  6. Bereiten HEPES-Lösung (20 mM) durch Auflösen von 238 mg HEPES in 50 ml von 155 mM NaCl.
  7. Bereiten 1,2% Alginat-Lösung um 1,2 Auflöseng Natriumalginat in 100 ml des HEPES-Lösung. Autoklavieren die Alginat-Lösung.
  8. Bereiten Calciumlösung (102 mM) durch Auflösen von 750 mg CaCl 2 in 50 ml HEPES-Lösung, pH-Wert auf 7,4

3. Primärzellkultur und Alginat Encapsulation

  1. Innerhalb einer Sterilbank, legen Sie das Tumorgewebe in einer Schale 35 mm Petri etwa 20 ml PBS Ca enthält 2+ und Mg 2+ frei, pH 7,4 (PBS *).
  2. Nehmen Sie das Gewebe mit einem chirurgischen Pinzette und legen Sie sie in eine andere Petrischale mit frischem PBS *, sanft in das Gewebe zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die roten Blutzellen und Schmutz entfernt werden.
  3. Mit Hilfe eines chirurgischen Pinzette, halten Sie die Hypophysenadenom Gewebe, und mit einem kleinen chirurgischen Schere, schneiden Sie sie in kleine Stücke schneiden. Mit einer Pasteur-Pipette mit abgerundeten Kanten, übertragen Sie die Gewebefragmente und die PBS * in einen 15-ml-Tube, Zentrifugieren bei 68 × g für 10 min bei RT.
    Hinweis: Um die Kanten einer Pasteur rundenPipette, leicht die Spitze der Pipette in Flamme eines Bunsenbrenners.
  4. Entfernen Sie die PBS * mit einer Pasteurpipette und 5.3 ml der Collagenase-Lösung hinzu (ca. 5 ml für 65 mm 3 von Gewebe), zwei bis drei Mal mischen durch Umdrehen. Inkubieren des Gewebes in der Kollagenase für 30 min bei 37 ° C in ständiger Rotation.
  5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 68 g für 10 min bei RT und entfernen Sie die Collagenase mit einer Pasteur-Pipette.
  6. 5 ml DNAse und zwei- bis dreimal durch Invertieren mischen, dann Zentrifugieren der Röhre bei 68 × g für 10 min bei RT.
    Hinweis: Wenn das Gewebe nicht völlig losgelöst ist, führen bei 37 ° C eine zweite enzymatische Verdauung mit Trypsin für 3 min. Stoppen Sie die Verdauung durch die Zugabe von 2 Volumina Trypsininhibitorlösung.
  7. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette Pasteur und entsorgen. Resuspendieren des Pellets in 1 Volumen EGTA-Lösung und mit 2 Volumina Alginatlösung mischen.
  8. Vorsichtig mischen die Zellsuspension und Alginatdurch Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette. Nehmen Sie eine sterile Spritze mit einer 21 G-Nadel, entfernen Sie den Kolben; Verwendung einer Pipette die Spritze mit dem Alginat und Zelllösung zu laden.
  9. Vorsichtig den Kolben in die Spritze und sorgfältig das Alginat-Zell-Lösung tropfen von Drop in ein Becherglas, das etwa 30 ml der kalziumreiche Lösung verzichtet werden kann.
  10. Legen Sie die Nadel der Spritze ca. 5 cm bis zu der CaCl 2 -Lösung. Die Alginat-Zellsuspension Gele bei Kontakt mit der CaCl 2 sphärische Kügelchen zu bilden. Halten Sie die Alginat-Perlen in der Calcium-Lösung für 5 min.
    Hinweis: Rühren Sie die Becherglas, in dem die Kugeln fallen gelassen werden. Bewegen Sie es langsam mit der Hand in kreisförmigen Bewegungen, um zu verhindern, miteinander verkleben.
  11. Entfernen Sie vorsichtig die Calciumlösung mit einer Pasteur-Pipette, und Waschen der Kügelchen zweimal mit 3-5 ml M199 mit 20% FBS angereichert.
  12. Übertragen Sie die Alginat-Perlen in eine reguläre T25-Gewebekulturbei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 Kolben mit einem sterilen Spatel verwenden, fügen Sie 4-5 ml M199 mit 20% FBS angereichert und inkubiert. jeden dritten Tag Ändern des Kulturmediums.

4. Befreien Zellen aus dem Alginat

Hinweis: Vor der Zellen aus dem Alginat-Perlen zu befreien, Mantel Durchmesser von 13 mm Deckgläser mit Poly-D-Lysin.

ACHTUNG: Schwefelsäure ist stark korrosiv Säure und APTS CAN Reizungen der Augen und der Haut verursachen. Latexhandschuhe verwenden diese Reagenzien zu behandeln.

  1. In einer Abzugshaube, mit einem Punkt Pinzette die Deckgläser in einer Glaspetrischale mit 20% igen wässrigen Schwefelsäure 1 h bei RT eintauchen.
  2. Man dekantiert die Schwefelsäure, und waschen Sie die Deckgläser fünfmal mit destilliertem Wasser für jeweils 5 Minuten. Mit einem Punkt Pinzette Platz die sauberen Deckgläser in einer Petrischale mit 0,1 M NaOH für 5 min bei RT 15.
  3. Man dekantiert die NaOH und wasche einmal mit destillierenführte Wasser, das Wasser abzusaugen und die Deckgläser trocknen.
  4. Mithilfe einer Mikropipette zu beschichten die Deckgläser mit APTS (Aminopropyltriethoxysilan) für 4 min (verwenden Sie 500 ul 6 Deckgläser) mit destilliertem Wasser, um die Petrischale überfluten. Schnell das Wasser ansaugen und weiterhin mit destilliertem Wasser zu waschen, die Deckgläser mit Punkt Pinzette bewegen, damit das Wasser unter einzudringen.
  5. Saugen Sie das Wasser ab und trocknen Sie die Deckgläser, die Deckgläser in eine saubere Petrischale einen Punkt Pinzette Ort mit und sterilisieren sie in der Mikrowelle bei 3-mal, 45 sec jeder. Hinzufügen 1.000 ul sterilem Wasser auf 100 & mgr; g poly-D-Lysin (0,1 mg / ml).
  6. Inkubiere die Deckgläser mit ca. 50 & mgr; l Poly-D-Lysin für 5 min bei RT. Absaugen Poly-D-Lysin vollständig.
    Anmerkung: Dies ist wichtig, weil löslichen Poly-D-Lysin in dem Kulturmedium der Zellproliferation hemmen können.
  7. Spülen Sie die Deckgläser fünfmal mit sterilem Wasser für jeweils 5 Minuten. Saugen Sie das sterile Wasser und lassen Deckgläser in einer Sterilbank zu trocknen.
  8. Um das Aktin-Zytoskelett analysieren, befreien die Hypophyse Zellen aus dem Alginat. Nehmen Sie einige der Alginat-Perlen aus der Kulturflasche ein 1 ml Pipettenspitze und legen Sie sie in einen 15-ml-Tube.
  9. 5 ml 55 mM Natriumcitrat (auflösen 323,6 mg Na 3 C 6 H 5 O 7, H 2 O 2 in 20 ml HEPES-Lösung) und Zentrifugation bei 68 × g für 10 min bei RT. Saugen Sie den Überstand und entsorgen.
  10. Resuspendieren des Pellets in 1 ml warmem M199 mit 20% FSB angereichert; sanft die mit einer Pasteur-Pipette Zellsuspension mischen.
    ACHTUNG: Phalloidin UND DAPI sind giftig. Handschuhe verwendet werden diese Reagenzien behandeln.
  11. Um die Zellen zu zählen, Transfer 125 ul von 0,4% Trypanblau Lösung in ein 1,5-ml-Tube. Hinzufügen von 75 ul M199 und 50 ul der Zellsuspension in der letzten Stufe (Verdünnungsfaktor = 5). Gründlich mischen.
  12. Verwenden Sie einen Mikropipettenspitze zu place etwa 10 ul des Trypanblau-Zellsuspension in die Kammer Hämozytometer.
  13. Zählen Sie die Zellen in der Zählkammer Zähler ein inverses Mikroskop mit Phasenkontrast-Beleuchtung. Graf alle Zellen in der 1 mm Mitte Platz und vier 1 mm Eckquadrate. Besorgen Sie sich die Zelldichte pro Milliliter durch die durchschnittliche Anzahl an pro Quadrat mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert -. 10 4 Zum Beispiel, wenn die gemessenen Durchschnittswerts pro Quadrat 45 Zellen x 5 x 104 = 2,25 x 106 Zellen / ml.
    Hinweis: Zählen Sie die Zellen in zehn Plätzen der Hemocytometer Kammer. Zählen Sie nicht Zellen, die die Mittellinie am unteren und rechten Seite zu berühren.
  14. Seed 35.000 Zellen auf 13 mm Durchmesser Deckgläschen abgedeckt mit Poly-D-Lysin.

5. Aktin-Zytoskelett Arrangement

  1. Nach 48 Stunden in Kultur, entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Pipette Pasteur und schnell 500 ul pro Deckglas PBS hinzufügen, sofort die PBS zu entfernen.
  2. Fix und Permeabilisierung ter Zellen mit 500 ul pro Deckglas Fixierungspuffer (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 0,5% Triton X-100 und 2% Formaldehyd) für 10 min bei 37 & deg; C
  3. Entfernen Sie die Fixierung Puffer und fügen 500 ul pro Deckglas von 3,5% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei RT. Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung.
  4. Waschen Sie die Deckgläser dreimal durch Zugabe von 500 ul pro Deckglas von PBS für jeweils 5 Minuten. Spülen Sie die Deckgläser bei RT, in ständiger Bewegung.
  5. Inkubieren der Zellen mit 50 mM Ammoniumchlorid für 10 min, um das Ammoniumchlorid-Lösung ansaugen und wiederholen Schritt 5.4.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit 1% BSA (IgG-frei, Proteasen frei) in PBS für 30 Minuten, entfernen Sie die BSA-Lösung und wiederholen Sie Schritt 5.4.
  7. Inkubieren Sie die Zellen mit 50 & mgr; M Rhodamin-Phalloidin für 7 min bei RT, wiederholen Sie Schritt 5.4.
  8. Inkubieren Sie die Zellen mit 255 & mgr; M DAPI in PBS für 5 min bei RT, wiederholen Sie Schritt 5.4. Schließlich montieren ter Deckgläser mit einer Montage Medium und versiegeln sie mit Nagellack.
  9. Erwerben Sie Bilder der Zytoskelett-Arrangements Aktin mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 63X Ziel verwenden, bei 541 nm Anregungswellenlänge.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde für unterschiedliche Zeiträume erfolgreich in der Kultur und Wartung von Adenom der Hypophyse Zellen in Alginat-Perlen aufgebracht Abbildung 1 zeigt eingebetteten Zellen in Alginat-Perlen nach drei Monaten. Diese Zellen bi-Brechungs abgerundeten Formen unter einem umgekehrten Lichtmikroskop (Abbildung 1) zeigen, Fig. 2 die Lokalisierung von N-Cadherin in rat Hypophysenadenom Zellen in Alginat eingebettet zeigt. Die...

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Diskussion

Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Die erste ist Perlgröße Homogenität, die erforderlich ist, die gleichen Bedingungen der Diffusion der Nährstoffe und Gase in der gesamten Zellkultur aufrecht zu erhalten. Nach unserer Erfahrung ist die Verwendung einer 21 G Nadel der Alginatkügelchen ermöglicht die Übernahme eines effizienten Kultur einheitliche Perlengrße zu machen. Der zweite wichtige Faktor ist der Abstand von der Nadel; Dieser Abstand darf nicht mehr als 5 cm von der Calciumlösung verformt Perlen und t...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Herrn O. Rios für seine technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz
199 Kulturmedium Invitrogen 31100-027Für Kultur, warm in einem 37 Grad; C Wasserbad vor dem Gebrauch 
Fötales Rinderserum PAAA15-751
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Merck106329
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N&akut;-2Ethansulfonsäure (HEPES)Sigma H-4034
Penicillin/StreptomycinPAAP11-010
PBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)Invitrogen 21600-044
Kollagenase Typ IWorthington4176
Trypsin Invitrogen 27250-018
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Research Organics3002E
Sorbeanischer Trypsin-InhibitorInvitrogen 17075-029
DNAseWorthington2139
Alginsäure, aus Macrocystis pyrifera (Seetang)Sigma A-2158
Calciumchlorid (CaCl2)J.T. Baker1332
Natriumcitrat (Na3C6H5O7)J.T. Baker3646
Piperazin-N,N′-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)Forschung Organische Stoffe9624P
Polyethylenglykol 6000 (PEG 6000)Calbiochem528877
Ethylen Glykoltetraessigsäure (EGTA)Forschung Organische Stoffe9574E
Magnesiumsulfat (MgSO4)J.T. Baker2500
Triton-X 100SigmaX100
FormaldehydJ.T. Baker2106
ParaformaldehydSigmaP6148
Ammoniumchlorid (NH4Cl)J.T. Baker660
BSA Rinderserumalbumin IgG-freiJackson Immuno Research001-000-161
Phalloidin– Tetramethylrhodamin B-IsothiocyanatSigmaP1951Giftig. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben 
4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI)Invitrogen D1306Giftig. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben 
Schwefelsäure (H2SO4)J.T. Baker9681Hochkorrosiv. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben 
Natriumhydroxid (NAOH)Merck1.06498Kann Augen- und Hautreizungen verursachen. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben 
(3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTS)SigmaA-3648
Poly-D-LysinhydrobromidSigmaP7280
Trypanblau-LösungSigmaT8154 
Name    Unternehmen  Katalognummer  Kommentare
Ausstattung  Giftig: Kann Krebs verursachen. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben 
Rotator Boekel ScientificModell 230300
ZentrifugeDuPont Corporation Modell sorvall TC6
Shaker LaborgeräteModell 314-820 

Referenzen

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