Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines großflächigen, gemultiplexten zweidimensionalen DNA oder Antikörperarray, mit potentiellen Anwendungen in der Zellsignal Studien und Biomarkern.

Abstract

Antikörper-Microarrays als gut entwickelte Technologie wird derzeit von einigen anderen etablierten oder aufstrebenden Hochdurchsatztechnologien herausgefordert. In diesem Bericht erneuern wir die Antikörper-Microarray-Technologie, indem wir einen neuartigen Ansatz für die Herstellung verwenden und neue Funktionen einführen. Die Herstellung unseres High-Density-Antikörper-Microarrays erfolgt durch senkrecht ausgerichtete Strömungsmuster von einzelsträngigen DNAs und anschließende Umwandlung, die durch DNA-Antikörper-Konjugate vermittelt wird. Dieses Protokoll beschreibt die kritischen Schritte bei der Fließstrukturierung von DNA, der Herstellung und Reinigung von DNA-Antikörper-Konjugaten und der Bewertung der Qualität des hergestellten Microarrays. Die Gleichmäßigkeit und Empfindlichkeit sind vergleichbar mit herkömmlichen Microarrays, während unsere Microarray-Herstellung nicht die Hilfe eines Array-Druckers erfordert und in den meisten Forschungslabors durchgeführt werden kann. Der andere große Vorteil besteht darin, dass die Größe unserer Microarray-Einheiten 10-mal kleiner ist als die von gedruckten Arrays und die einzigartige Möglichkeit bietet, funktionelle Proteine aus einzelnen Zellen zu analysieren, wenn sie mit generischen Mikrochip-Designs verbunden sind. Diese Barcode-Technologie kann in großem Umfang bei der Detektion von Biomarkern, in Zellsignalstudien, im Tissue Engineering und in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen eingesetzt werden.

Introduction

Antikörper-Mikroarrays wurden weitgehend in der Proteomik seit Jahrzehnten verwendet, um die Anwesenheit von Zielproteinen, einschließlich Proteinbiomarker ^1-3 zu prüfen. Obwohl dieser Bereich steht derzeit vor großen Herausforderungen von anderen Hochdurchsatz-Technologien wie Massenspektrometrie (MS), gibt es noch viel Raum für die Nützlichkeit der Antikörper Microarrays, vor allem, weil diese Geräte leisten einfache Dateninterpretation und einfache Schnittstelle mit anderen Tests. In den letzten Jahren hat sich die Integration von Microarrays in die Mikrochip-Gerüsten der Antikörper Microarray eine neue Möglichkeit, gedeihen ^4-7 vorgesehen. Zum Beispiel hat der Barcode Microarray in eine Einzelzellmikrochip integriert in Zell-Kommunikation Studien ^8,9 verwendet. Diese Technologie hat deutliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Microarray-Technologien. Es verfügt über Array-Elemente auf 10-100 um, viel kleiner als die typischen 150 um Größe in herkömmlichen Microarray elemen verwendetts. Der Bau von kleineren Arrayelemente mit systematischen Strömungsmusterbildungsverfahren erreicht wird, und dies führt zu kompakten Mikroarrays, die Einzelzell sezernierten Proteinen und intrazellulären Proteinen erkennen kann. Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung eines einfachen, instrument freie Konfiguration. Dies ist besonders wichtig, weil die meisten Labors und Kleinunternehmen nicht in der Lage, um Mikroarray-Kerneinrichtungen zugreifen zu können. Solchen Barcode-Antikörper-Mikroarrays mit einer leistungsfähigen Assay Durchsatz und können verwendet werden, um hoch Multiplex-Assays an einzelnen Zellen durchzuführen, während eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität mit der von herkömmlichen Sandwich-Enzym-Immunoassay (ELISA ⁸⁾ werden. Diese Technologie hat zahlreiche Anwendungen in der Detektion von Proteinen aus Glioblastom ^9-11, T-Zellen ^{12 und 13} zirkulierenden Tumorzellen gefunden. Alternativ Barcode DNA Microarrays allein in der präzisen Positionierung von Neuronen und Astrozyten für mimick genutzt wordening der in vivo Anordnung von Hirngewebe ^14.

Dieses Protokoll konzentriert sich nur auf die experimentellen Schritte und Aufbaublöcke der zweidimensionalen (2D) Strichcode-Antikörper-Microarray, die Anwendungsmöglichkeiten in der Detektion von Biomarkern in Fluidproben hat und in einzelne Zellen. Die Technik basiert auf einem adressierbaren einzelsträngig, eindimensionale (1-D) DNA Microarray konstruiert unter Verwendung eines Orthogonal-Oligonukleotide, die sich räumlich auf Glassubstraten gemustert. Der 1-D-Muster gebildet wird, wenn parallele Strömungskanäle in Strömungsmusterungsschritt verwendet, und ein derartiges Muster wird als diskrete Banden visuell ähnlich zu 1-D Universal Product Code (UPC) Barcodes. Der Bau eines 2-D (n x m) Antikörper Array - erinnert an ein 2-D Quick Response (QR) Matrixcode - braucht mehr komplexe Strukturierungsstrategien, sondern ermöglicht für die Immobilisierung von Antikörpern mit einer höheren Dichte ^8,15. Die Fertigungerfordert zwei DNA Strukturierungsschritte, wobei das erste Muster senkrecht zu der zweiten. Die Schnittpunkte dieser beiden Muster bilden die n x m Elemente des Arrays. Durch strategische Auswahl der Sequenzen der einzelsträngigen DNA (ssDNA) in Strömungsstrukturierung verwendet wird, wird jedes Element in einem gegebenen Array eine bestimmte Adresse zugewiesen. Diese Raumbezug ist bei der Unterscheidung zwischen Fluoreszenzsignale auf dem Microarray Objektträger notwendig. Die ssDNA-Array in einen Antikörper-Array durch den Einbau von komplementären DNA-Antikörper-Konjugate umgewandelt und bildet eine Plattform genannte DNA-kodierten Antikörperbibliothek (DEAL ^16).

Diese Video-Protokoll werden die wichtigsten Schritte bei der Erstellung nxm Antikörperarrays, umfassend die Herstellung schließen Polydimethylsiloxan (PDMS) Barcode Formen, Fließmuster ssDNA in zwei Orientierungen, die Vorbereitung Antikörper-Oligonukleotid-Konjugaten DEAL, und Umwandeln des 3 x 3-DNA-Array in ein 3x 3-Antikörper-Array.

Protocol

Achtung: Einige Chemikalien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind Reizstoffe und sind im Falle von Hautkontakt gefährlich. Wenden Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung vor dem Durchführen dieses Protokoll. Die in Schritt (1.1.1) verwendet Piranha-Lösung ist stark ätzend und erfolgt durch Zugabe der Peroxid langsam zu der Säure unter Rühren hergestellt werden. Behandeln Sie diese Lösung mit äußerster Vorsicht in einer Abzugshaube. Verwenden Sie geeignete Schutzbrille und säurefeste Handschuhe. Trimethylchlorsilan (TMCS) ist eine ätzende, brennbare Chemikalie in einem optionalen Schritt nach (1.1.6) verwendet. Behandeln Sie diese Chemikalie in einem Abzug.

Hinweis: Führen Sie die Barcode-Schiebe Fertigung und kritische Strömung-Strukturierungsverfahren in einem Reinraum, um eine Verunreinigung durch Partikel zu minimieren. Staubpartikel können die Ports und Mikrokanäle PDMS Formen blockieren und stören Fluss-Strukturierung.

1. Bau des One-dimensional DNA Barcode Slide

1. Vorbereitung des SU-8 Master für Barcode-Strömungsmuster
   Anmerkung: Die Zeichnungen für den senkrechten Strömungsmuster (1A-B) unter Verwendung eines Computer-Aided Design (CAD) geschaffen. Diese Muster werden auf einer Chrommaske erstellt. Transparenten Bereichen der Maske entsprechen den Merkmalen der SU-8-Master.
   1. Reinigen einer Siliziumwafer (Durchmesser 100 mm) gründlich in einem Gemisch von 3 H _{2 SO 4:} 1 30% H _{2 O 2 (Piranha-Lösung)} auf 96 ° C erwärmt. Waschen Sie die Wafer mit deionisiertem Wasser und Isopropylalkohol, durch Trocknen mit einem Stickstoffluftpistole gefolgt.
   2. Pour etwa 4 ml SU-8-Fotolack 2025 auf dem Wafer. Verwenden einer programmierbaren Schleuderbeschichter gleichmäßig verteilt den Photoresist auf dem Wafer 10 Sekunden lang bei 500 UpM, dann 30 Sekunden bei 3.000 Umdrehungen pro Minute. Dies schafft eine Photoresistschicht mit einer Dicke von ~ 25 & mgr; m. Nach und ermöglichen zum Stillstand kommen, vor dem Anhalten zu verlangsamen - das ist nach MaiNtain eine gleichmäßige Beschichtung auf der Oberfläche des Wafers.
   3. Backen des beschichteten Wafers auf einer Heizplatte für 1 min bei 65 ° C, dann für 5 min bei 95 ° C. Dieser Schritt ermöglicht die Beschichtung zu verfestigen. Cool, für 5 min RT.
   4. Legen Sie die Chrommaske (Abbildung 1c) auf dem Fotolack beschichten. Setzen die Maske Eigenschaften, um im nahen UV-Licht (350 bis 400 nm, einer Belichtungsenergie von 150 bis 160 ^mJ / cm 2) für 20 sec.
      Hinweis: Das Design auf der Chrommaske enthält 20 Kanäle, von denen jeder 20 & mgr; m breit mit 50 & mgr; m Steigung sind. Die Kanäle Wicklung von einem Ende der Struktur auf der gegenüberliegenden Seite. Insgesamt sind die 20 Kanäle umfassen eine rechteckige Fläche mit einer Länge von ~ 40 mm und einer Breite von ca. 20 mm. Jeder Kanal ist durch zwei kreisförmige Merkmale, die zu einem Einlass und einem Auslass entsprechen flankiert. Einlässe und Auslässe sind austauschbar.
   5. Backen Sie die belichteten Wafer auf einer Heizplatte 5 min bei 95 ° C. Coole allmählich auf RT.
   6. Tauchen des Wafers in SU-8-Entwickler unter Rührenfür 5 min. Der Wafer mit einem kleinen Teil des Frisch SU-8-Entwickler, gefolgt von Isopropylalkohol zu waschen. Trocknen Sie die Wafer unter Verwendung einer Stickstoffluftpistole. Hard-bake Wafers auf einem 200 ° C-Kochplatte für 30 min und damit der Wafer schrittweise auf RT abkühlen.
      Anmerkung: Die Entwicklung kann für eine längere Zeit durchgeführt werden, wenn ein weißer Film wird nach dem Waschen in diesem Schritt festgestellt.
      Optional: silanisieren die SU-8 Master, indem es Dampf in einer verschlossenen Petrischale für 10 min Trimethylchlorsilan.
2. Herstellung der PDMS Barcode Form
   1. Kombinieren 40,0 g Siliconelastomer-Basis mit 4,0 g Härter. Rühre das Prepolymergemisch 10 min kräftig. Degas für 20 min unter Vakuum.
      Hinweis: In der Regel verwenden Sie ein 10: 1 (Basis: Härter) Massenverhältnis.
   2. Gießen Sie das Präpolymer in eine Petrischale, die einen Silizium-Wafer mit dem SU-8 Master des Barcode-Musters. Die Höhe des PDMS-Mischung sollte etwa 7,5 mm oder mehr betragen. Entgasen des Gemischs in der Petri Gericht für ein zweites Mal, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen, dann backen die Mischung für 1 h bei 75 ° C, damit PDMS zu heilen.
      Hinweis: Es ist wichtig, genügend Dicke der PDMS-Platte mit 7,5 mm zu halten ~ oder über Zugabe von zu viel Spannung auf das PDMS-Glas-Bindung beim Einsetzen der Stifte / Schlauch durch Löcher in der PDMS-Form in Schritt, um zu vermeiden (1.3.3.1)
   3. Mit einem Skalpell vorsichtig um den Bereich der PDMS-Platte, die den Barcode Formmerkmale enthält, und ziehen Sie die Platte aus dem Wafer geschnitten.
   4. Die Kanten der Platte, um die gewünschte Form des PDMS Barcode-Form zu erreichen. Stempel 20 Löchern (1,0 mm Durchmesser) durch die Form mit Hilfe einer Biopsie Schlag mit Kolben. Sicherzustellen, dass die Löcher mit den kreisförmigen Merkmalen der Strichcodemuster ausgerichtet sind. Diese Löcher dienen als Ein- und Ausgänge.
3. Eindimensionale Strukturierung von Poly-L-Lysin (PLL)
   1. Entfernen Sie Staub auf der Oberfläche einer Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträger unter Verwendung einer Stickstoffluftpistole. Attach die PDMS-Form auf die sauberen Glasobjektträger. Sicherzustellen, dass die Kanten der Form und dem Schlitten ausgerichtet sind.
   2. Backen für 1,5 h bei 75 ° C, um die Bindung zwischen der PDMS-Form und der PLL-beschichteten Objektträger zu verstärken. Währenddessen werden 20 Stücke aus flexiblem Polyethylenschlauch (3- bis 4-Zoll-Stücke, mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm und einem Außendurchmesser von 1,5 mm).
      Anmerkung: Die Anzahl der Schlauchstücke, entspricht der Anzahl von Einlässen im PDMS Barcodeform. Der Schlauch dient zur Kopplung der Kanäle auf dem PDMS Barcodeform zu einem Stickstoffgastank mit einem Druckregler ausgestattet ist.
   3. An einem Ende jedes Rohrstück, befestigen eine Edelstahlhohlbolzen (1 mm Durchmesser). Aspirat sterilfiltriert Poly-L-Lysinlösung durch den Stift, bis mindestens 1 cm des Schlauchs wird mit der Lösung gefüllt.
      1. Befestigen Sie die Stifte (zur Lösung gefüllten Schlauch verbunden) an den Einlässen der PDMS Barcode Form (1E). Schließen Sie das andere Ende der Rohre zueine druckgeregelte Stickstofftank Set-up. Die Lösung wird durch die Form mit einem Druckbereich von 0,5-1 bar für mindestens 6 h fließen.
         Hinweis: Siehe Schritt (1.3.3) für alle Flussstrukturierungsverfahren.
4. Eindimensionale Strukturierung ssDNA ¹⁴
   Anmerkung: Die Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) in den nachfolgenden Schritten verwendet wird, aus 137 mM NaCl, 10 mM Na _{2 HPO 4} und 2 mM KH _{2 PO 4. Der} pH-Wert des Puffers beträgt 7,4 hergestellt.
   1. Vorzubereiten 2 mM Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) -Lösung in PBS. Vorzubereiten 300 uM Lösungen A, B und C ssDNA (5'-Amin-modifizierten, 80 Nukleotide) in PBS oder Reinstwasser.
      Hinweis: Mit der BS3-Lösung innerhalb von 30 min nach der Herstellung, da die N-Hydroxysuccinimid Ester leicht eine Hydrolyse.
   2. Kombinieren 2,5 ul 300 uM A, B oder C ssDNA mit 2,5 ul 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberat in PBS für jeden Kanal. A, B, und C-DNA mit den Kanälen 1, 2 und 3 bezeichnet, und sind. Dieser Auftrag wird auch die verbleibenden Gruppen von 3 Kanälen (2A) angelegt wird.
   3. Führen Sie Schritt (1.3.3). Dieses Mal absaugen 5 ul BS3 / DNA-Lösungen durch Edelstahlbolzen und in die Polyethylenschlauch, dann koppeln die PDMS Form, um die Stickstoffquelle. Damit der BS3 / DNA-Lösung, durch die Strichcodeform für etwa 40 Minuten oder bis an die Kanäle gefüllt sind, fließen.
   4. Stoppen Sie den Fluss, wenn alle Kanäle belegt sind, dann inkubieren BS3 / DNA-Lösung in der Barcode bei RT für 2 h. Erlauben nicht die Lösung zu trocknen. Backen Sie die PDMS-Form mit angeschlossener Barcode-Schieber für 1 h bei 75 ° C.
      Hinweis: Um die Ausrichtung in den nachfolgenden Flussstrukturierungsschritte zu erleichtern, können die Ränder der Kanalmuster auf dem Barcode Schieber umrissen. Dies geschieht durch vorsichtiges Kratzen der Glasoberfläche mit einem Diamant Scrib getane an Ausrichtmarkierungen an der Unterseite des Objektträgers generiert. Ausrichtung in späteren Stufen des Protokolls können unter einem Mikroskop geprüft werden.
   5. Entfernen Sie die PDMS-Form von der Barcode-Folie. Sanft SDS einmal und dreimal mit hochreinem Wasser Waschen Sie die Objektträger mit 0,01%.
      1. Trocknen Sie die Barcode-Schieber mit einem Mikroskop-Objektträger Spinner. Bewahren Sie die Barcode-Folie in einer sauberen 50-ml-Zentrifugenröhrchen für die spätere Verwendung.

2. Validierung der eindimensionalen Muster auf dem Barcode-Slide

Anmerkung: Diese Validierungsprotokoll können auch zur Verwendung bei der Beurteilung der Qualität von Nachfließen Strukturierungsschritten angepasst werden.

1. Blockieren des Schiebers
   1. Vorbereitung 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. Filtern dieser Lösung durch einen 0,45 um-Spritzenfilter vor dem Gebrauch. Verwendung eines gel-Ladespitze gelten 50 ul 1% BSA-Lösung, um einen Rand des Barcodeträger.
   2. Inkubieren Sie die 1% BSA solutIon für 1 h bei RT.
2. Inkubation mit Cyanine 3 (Cy3) -konjugiertem komplementäre DNA
   1. Bereiten Sie einen Cocktail von A ', B' und C 'Oligonukleotide an einem Ende konjugiert an Cy3. Die Sequenzen der A ', B' und C 'sind komplementär zu denen von A, B und C sind. Die Arbeitskonzentration des Cy3-DNA beträgt 0,05 & mgr; M in 0,1% BSA.
   2. Entfernen Sie die BSA-Lösung aus der Folie durch Pipettieren, so gelten 30 ul der DNA-Cocktail-Lösung auf dem gleichen Rand des Objektträgers. Inkubieren Sie die Cy3-DNA-Cocktail auf der Folie bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Führen Sie diese Inkubationsschritt in der Dunkelheit, die Cy3-Einheit von Photobleaching zu schützen.
3. Analyse der Fluoreszenzintensität
   1. Pipettieren Sie die Cy3-DNA-Cocktail und waschen Sie die Folie in 1% BSA, PBS und schließlich in PBS verdünnt (1 S.Kunst PBS mit 50 Teilen hochreinem Wasser). Trocknen Sie den Schieber unter Verwendung einer Schleuder.
   2. Beachten Sie die Fluoreszenz (2B) mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Microarray-Scanner. Bei der Verwendung eines Microarray-Scanner, stellen Sie den Laser-Emissionswellenlänge auf 532 nm, die Pixelgröße auf 5 Mikrometer, Photomultiplier (PMT) Verstärkung bei 450 und Leistung bei 15%.

3. Herstellung von 2-dimensionalen (3x3) DNA-Arrays ¹⁴

1. Herstellung der PDMS Barcode Form
   1. Zuführen Verfahren (1.1), eine andere SU-8 Master realisiert werden, aber dieses Mal mit einem Chrommaske mit einem Strömungsmuster senkrecht zu der ersten Design. Führen Sie das Verfahren (1.2), um eine neue PDMS-Form mit der Senkrechten Muster zu konstruieren.
2. Zweidimensionalen Strömungs Strukturieren ssDNA
   1. Für einen 3 x 3-Matrix, bereiten 150 uM Vorratslösungen A'-i, B'-ii, iii C'-A'-iv, B'-v, vi C'-A'-VII, B'-VIII und C'-ix DNA in 3% BSA / PBS. Diese Oligonukleotide dienen als "Brückensequenzen" (2A). Verbinden die Oligonukleotid-Lösungen (Lösungen 1 bis 3), so dass die Arbeitskonzentration von 50 & mgr; M für jedes Oligonukleotid. Benutzen Sie den Leitfaden in der Tabelle 1 zur Verfügung gestellt.
   2. Fließen 3% BSA / PBS Blocklösung in alle 20 Kanäle für 1 h bei 0,5-1 bar.
   3. Strömungs Lösungen 1, 2 und 3 in den Kanälen 1, 2 und 3. Folgen Sie dieser Reihenfolge für nachfolgende Sätze von 3 Kanälen. Stroms normalerweise in etwa 40 min abgeschlossen. Die DNA-Lösungen bei RT inkubieren für 2 Stunden, damit die DNA zu hybridisieren.
   4. Fließen 3% BSA / PBS Blocklösung in alle 20 Kanäle für 1 h bei 0,5-1 psi bis unhybridisierten DNA zu entfernen. Ziehen Sie die PDMS-Platte, und waschen Sie die erhaltenen DNA-Microarray-Objektträger durch Eintauchen der Objektträger in 3% BSA / PBS einmal und PBS zweimal durch verdünnte PBS (1 Teil PBS und 50 Teilen hochreinem Wasser) gefolgt. Dry die Folie mit einem Mikroskop-Objektträger Spinner.
   5. Führen Sie eine zweite Validierungsschritt (2C) ähnlich wie in Abschnitt 2. Verwenden Oligonukleotide i 'bis ix', die Cy3-konjugiert sind. Speichern die 3 x 3-Matrix Folie in einer 50-ml-Zentrifugenröhrchen für eine nachfolgende Verwendung.
      Anmerkung: Die DNA-Mikroarray bei RT in einem Exsikkator Monate gelagert werden.

4. Umwandlung der 3 x 3 DNA-Array in ein Array Antikörper

1. Herstellung von Antikörper-Oligonukleotid (DEAL) Konjugate
   1. Werden die Lösungen von 200 mM Succinimidyl-4-formylbenzoat (S-4FB) und 40 mM Succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (S-HYNIC) in wasserfreiem N, N-Dimethylformamid (DMF).
   2. Vorbereitung bis zu 7 getrennte Lösungen von Fänger-Antikörper (1 mg / ml) in PBS.
      Hinweis: Wenn die Antikörper-Stammlösungen enthalten Natriumazid Bakteriostatikum, führen Pufferaustausch mit PBS unter Verwendung von Spin-Entsalzung columns 7 kDa Molekulargewichtsausschlußgrenze (MWCO).
   3. Bereiten separaten 400 & mgr; M Lösungen von I ', II', III ', IV', v ', VI' und vii 'DNA. Ordnen Sie jedem Capture-Antikörper auf einem Oligonukleotid-Sequenz. Kombinieren Sie 40 ul 400 uM DNA mit 12.25 ul DMF in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-Down, um gründlich zu mischen.
      1. Zu jeder DNA / DMF-Lösung, fügen 2,3 & mgr; l 200 mM S-4FB in DMF. Für jede 100 ug Capture-Antikörper, fügen 2,25 & mgr; l 40 mM S-HYNIC in DMF.
   4. Antikörper / S-HYNIC und DNA / S-4FB Lösungen inkubieren 4 h bei RT.
   5. In Vorbereitung für den Antikörper-DNA-Kupplungsreaktion vorzubereiten neuen Spin Entsalzungssäulen (eine für jede DNA-Lösung und eines für jeden Antikörper) durch Waschen mit Citrat-Puffer bei pH 6.
   6. Nach 4 Stunden Inkubation, führen Pufferaustausch für jeden Antikörper / S-HYNIC und DNA / S-4FB Lösung. Kombinieren Sie die S-4FB konjugierten I ', II', III ', IV', v ', VI' und vii 'Oligonukleotide mit den Antikörper-S-HYNIC Konjugate. Die Gemische Inkubieren für 2 h bei RT.
   7. Inkubieren Sie die Reaktion O / N bei 4 ° C.
2. Die Reinigung von Antikörper-Oligonukleotid (DEAL) Konjugate
   Hinweis: Um die Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate zu reinigen, führen schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) auf einer Standard-FPLC-System mit einer Superose 6 10/300 GL-Säule ausgestattet.
   1. Set der Wellenlänge des UV-Detektors der FPLC-System bis 280 nm. Verwenden isokratisch Fluss von PBS (pH 7,4) bei 0,3 ml / min, um die Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate von der überschüssigen S-4FB-DNA zu trennen.
   2. Bündeln die Fraktionen, die das Konjugat und konzentrieren sich die Fraktionen auf ein Volumen von 150 ul unter Verwendung von Spin-Filter mit einer 10 kDa MWCO.
3. Zweidimensionalen Strukturierung von Antikörpern
   1. Bereiten Sie einen anderen PDMS-Form mit Kleinstkammern oder Mikrovertiefungen unsing Herstellungsverfahren in Schritt (1.2). Die PDMS-Form kann Mikroliter bis Nanoliter-Vertiefungen für Immunoassays enthalten.
      Hinweis: Für allgemeine Biomarkern in fluidischen Proben wird ein PDMS-Form mit mehreren Vertiefungen, die mit dem Array Objektträger gedeckt. Die Merkmale der PDMS-Form hängen von das System untersucht. Zum Beispiel kann der Nachweis von Proteinen, die aus Einzelzellen-Experimente mit einem PDMS-Form enthaltenden Mikrokammern mit 0,15-nl Volumen durchgeführt werden.
   2. (Optional) Betreff der PDMS-Form an Plasmareinigung (18 W) für 1,5 min um seine strukturierte Oberfläche hydrophil zu machen. Vor dem Plasmareinigung mit Klebeband alle anderen Oberflächen, die direkt an die 3 x 3-Matrix Schieber verbunden werden blockieren.
      Hinweis: Schritt (4.3.2) ist optional, aber ist in der Regel durchgeführt, wenn das PDMS-Form ist für den Einsatz in Einzelzellexperimenten bestimmt.
   3. Kamerad die PDMS-Form mit dem 3 x 3-Array Rutsche, dann sperren Sie die Folie mit 1% BSA in PBS. Inkubieren für 1 h bei RT. Meanwhile, bereiten Sie einen Cocktail (200 ul Endvolumen) von Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate. Die Arbeitskonzentration jedes Konjugat 10 ug / ml in 1% BSA / PBS.
   4. Hinzufügen des Antikörper-Oligonukleotid-Cocktail, dann Inkubieren für 1 h bei 37 ° C, damit das Oligonucleotid-Einheit der Konjugate mit bestimmten Stellen auf den 3 x 3 Matrizen hybridisieren, wodurch das DNA-Array-Konvertierung in einem Antikörper-Array.
   5. Wiederholen Sie Schritt (3.2.4) zu reinigen und trocknen Sie die Folie. Die höchste Empfindlichkeit wird erreicht, wenn der Antikörper-Array sofort verwendet werden. Längere Lagerung kann zu einem Verlust der Empfindlichkeit führen.
4. Nachweis von Proteinen
   1. Rekonstituieren rekombinanten Proteinen oder bereiten Sie eine gefilterte Zellprobe.
   2. Kamerad des Mikroarrays mit einem speziell angefertigten Chip, und blockieren Sie die Oberfläche mit 3% BSA in PBS für 1 Stunde. Entfernen Sie dann die BSA-Lösung und gelten Proben und Inkubation für 2 Stunden.
   3. Abwaschen der Proben unter Verwendung von 3% BSA in PBS dreimal eind fügen Nachweisantikörper in einer von der Produktdatenblatt vorgesehen Konzentration. Inkubieren für 2 Stunden.
   4. Abwaschen der Nachweisantikörper durch 3% BSA in PBS dreimal, und fügen Cyanin 5 (Cy5) -streptavidin bei 1 ug / ml, gefolgt von einer Inkubation für 1 Stunde.
   5. Wiederholen Sie Schritt (3.2.4) zu reinigen und trocknen Sie die Folie für das Scannen.

Results

Die Entwürfe für die PDMS-Form (1A-1B) wurden unter Verwendung eines CAD-Programms (AutoCAD) erstellt. Zwei Entwürfe gezeigt Funktion Kanäle für Strömungs Strukturierung, eine horizontale und eine vertikale. Die linke und rechte Teile jedes Design symmetrisch sind; einer von ihnen könnte Einlässen oder Auslässen sein. Jeder der 20 Kanäle ist Wicklung von einem Ende hin zum anderen Ende. Jedes Design ist auf einem Chrom-Photomaske (Abbildung 1c) gedruckt....

Discussion

Strömungsmuster Design ist der erste wichtige Schritt bei der Herstellung der 2-D-Mikroarray. Um zwei überlappende DNA-Muster auf einem Glassubstrat zu erzeugen, müssen die Kanal Merkmale des ersten Design senkrecht zu denen des zweiten (1A-B). Die Entwürfe beachten Sie auch die nachgelagerten Anwendungen des Mikroarrays. Im Fall der Einzelzellanalyse wird der Mikroarray verwendet werden, um Proteine, die von einzelnen Zellen in Mikrokammern umschlossen erfassen, damit die Kanalabmessungen mit ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silikonelastomer-Basis	Dow Corning	3097366-1004
Sylgard 184 Silikonelastomer-Härter	Dow Corning	3097358-1004
SU-8 2025 Fotolack	MicroChem	Y111069
Siliziumwafer	University Wafers	452
Poly-L-Lysin-beschichtete Glasobjektträger	Thermo Scientific	C40-5257-M20
Oligonukleotide	Integrated DNA Technologies		*Sonderanfertigung bei Integrated DNA Technologies, siehe Tabelle 2.
Poly-L-Lysin-Klebstoff-Stammlösung	Newcomer Supply	1339
Bis (Sulfosuccinimidyl) suberat  (BS3)	Thermo Scientific	21585
1x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	Qualität Biologisch	114-058-101
Ä kta Explorer 100 Schnelles Protein-Flüssigchromatographie-System (FPLC)	GE (Amersham Pharmacia)	18-1112-41
Superose 6 10/300 GL Säule	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Capture Antikörper	verschiedene	verschiedene	*Auswahl der Antikörper hängt von der Anwendung
ab Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamid (S-HyNic)	Solulink	S-1002
Succinimidyl-4-formylbenzamid (S-4FB)	Solulink	S-1004
N,N-Dimethylformamid	Sigma-Aldrich	227056
Zitronensäure, wasserfrei	Acros	42356
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S318
Amicon Ultra Spin Filter 10 kDa MWCO	EMD Millipore	UFC201024
Spin Coater	Laurell Technologies	WS-650-MZ
Biopsie-Stanze mit Kolben (1,0 mm Durchmesser)	Ted Pella, Inc.	15110-10
Diamantritzer (Typ 60)	SPI liefert	6004
Trimethylchlorsilan	Sigma Aldrich	92361