Modeling Chemotherapie beständig Leukämie In Vitro

Zusammenfassung

Der vorliegende Bericht fasst ein Protokoll zusammen, das verwendet werden kann, um den Einfluss der Mikroumgebungsnische des Knochenmarks auf leukämische Zellen zu modellieren, wobei der Schwerpunkt auf der Anreicherung der chemoresistentesten Subpopulation liegt.

Zusammenfassung

Es ist allgemein bekannt, dass die Mikroumgebung des Knochenmarks einen einzigartigen Zufluchtsort für hämatopoetische Erkrankungen bietet, die an dieser Stelle sowohl initiieren als auch fortschreiten. Das im aktuellen Bericht vorgestellte Modell verwendet humane primäre Knochenmarkstromazellen und Osteoblasten als zwei repräsentative Zelltypen aus der Knochenmarknische, die den Phänotyp von Tumorzellen beeinflussen. Die in vitro Co-Kulturbedingungen, die für humane leukämische Zellen mit diesen primären Nischenkomponenten beschrieben wurden, unterstützen die Erzeugung einer chemoresistenten Subpopulation von Tumorzellen, die effizient aus der Kultur für die Analyse durch verschiedene Techniken gewonnen werden kann. Ein strenger Fütterungsplan zur Vermeidung von Nährstoffflüssen, gefolgt von Gel-Typ-10-vernetzten Dextran (G10)-Partikeln, der Rückgewinnung der Population von Tumorzellen, die unter die adhärenten Knochenmarkstromazellen (BMSC) oder Osteoblasten (OB) gewandert sind und eine "Phase Dim" (PD)-Population von Tumorzellen erzeugen, bietet eine konsistente Quelle für gereinigte, therapieresistente Leukämiezellen. Diese klinisch relevante Population von Tumorzellen kann mit Standardmethoden zur Untersuchung apoptotischer, metabolischer und zellzyklusspezifischer Regulationswege bewertet werden und bietet ein strengeres Ziel für die Erprobung neuartiger therapeutischer Strategien vor präklinischen Untersuchungen, die auf eine minimale Resterkrankung abzielen.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Methode ist es, einen effizienten, kostengünstigen in vitro Ansatz bereitzustellen, der die Untersuchung der Mechanismen unterstützt, die dem knochenmarkgestützten Überleben von Leukämiezellen während der Chemotherapie-Exposition zugrunde liegen. Es ist gut dokumentiert, dass überlebende Resttumorzellen, die nach der Behandlung bestehen bleiben, zum Rückfall der Krankheit beitragen, der oft aggressiver ist als der bei der Diagnose und oft weniger effektiv behandelt wird^1-8. Modelle, die Leukämiezellen isoliert einbeziehen, wie z. B. solche, die auf die Kultivierung von Zellen in Medien allein beschränkt sind, um therapeutische Ansätze zu testen, berücksichtigen diese kritischen Signale oder die Heterogenität der Krankheit nicht, die als Reaktion auf die Verfügbarkeit von Nischen-abgeleiteten Hinweisen auftritt, in denen Tumorzell-Subpopulationen mit sehr spezifischen Wechselwirkungen mit Nischenzellen einen erhöhten Schutz ableiten. Standardmäßige 2D-Co-Kulturmodelle, die aus dem Knochenmark gewonnene Stromazellen und leukämische Zellen co-kultivieren, haben den Beitrag der Knochenmarknische etwas berücksichtigt und gezeigt, dass die Interaktion mit Zellen der Knochenmarkmikroumgebung ihre Resistenz gegen Chemotherapie erhöht und ihre Wachstumseigenschaften verändert^9-14. Diese Modelle sind jedoch oft nicht in der Lage, das Langzeitüberleben von Tumorzellen zu rekapitulieren und informieren nicht genau über die Ergebnisse, die mit den resistentesten leukämischen Zellpopulationen verbunden sind, die zur MRD beitragen. In-vivo-Modelle sind nach wie vor von entscheidender Bedeutung und stellen den "Goldstandard" für die Untersuchung innovativer Therapien vor klinischen Studien dar, aber sie werden oft durch den Zeit- und Kostenaufwand für die Überprüfung von Hypothesen in Bezug auf resistente Tumoren und Krankheitsrückfälle in Frage gestellt. Daher wäre die Entwicklung aussagekräftigerer 2D-Modelle für Pilotuntersuchungen von Vorteil, um das Design des nachfolgenden präklinischen Designs auf Mausbasis besser zu informieren.

Das in vitro 2D-Modell, das in diesem Bericht vorgestellt wird, hat nicht die Komplexität der echten in vivo Mikroumgebung, bietet aber ein kostengünstiges und reproduzierbares Mittel, um Tumorinteraktionen mit der Mikroumgebung zu untersuchen, die sich speziell für die Anreicherung der chemoresistenten Subpopulation von Tumorzellen eignet. Diese Unterscheidung ist wertvoll, da die Bewertung der gesamten Population von Tumorzellen den Phänotyp einer kleineren Gruppe therapieresistenter Tumorzellen maskieren kann, die das wichtigste Ziel darstellen. Ein weiterer Vorteil ist die Skalierbarkeit des Modells, um es an die interessierende Analyse anzupassen. Für Analysen, die eine signifikante Rückgewinnung von Tumorzellen erfordern, können Bulk-Kulturen etabliert werden, während Co-Kulturen in kleinen Maßstäben in Multi-Well-Platten für PCR-basierte Analysen oder mikroskopiebasierte Auswertungen verwendet werden können.

Basierend auf diesem Bedarf haben wir ein In-vitro-Modell entwickelt, um die Heterogenität der Krankheit zu berücksichtigen, die für die akute lymphatische Leukämie (ALL) der B-Linie charakteristisch ist. Wir zeigen, dass ALLE Zellen, die viele Gemeinsamkeiten mit ihren gesunden Gegenstücken aufweisen, in unterschiedlichen Kompartimenten der BMSC- oder OB-Co-Kultur lokalisiert sind. Es werden drei Populationen von Tumorzellen generiert, die unterschiedliche Phänotypen aufweisen, die für die Untersuchung des therapeutischen Ansprechens wertvoll sind. Insbesondere zeigen wir, dass (ALL)-Zellen, die aus der "Phase Dim"-Population (PD) der Co-Kultur gewonnen wurden, durchweg therapierefraktär sind, mit einem Überleben, das sich Tumorzellen annähert, die keinen zytotoxischen Wirkstoffen ausgesetzt waren. Diese ALL-Zellen, entweder aus etablierten Zelllinien oder primären Patientenproben, wandern unter adhärente Stromazellen oder Osteoblastenschichten, können aber nach der Trypsinisierung von Kulturen und der Trennung von Zelltypen unter Verwendung von Geltyp 10 vernetzten Dextran (G10)-Partikelsäulen¹⁵ eingefangen werden.

Hier präsentieren wir einen Aufbau einer 2D-Co-Kultur, die verwendet werden kann, um Interaktionen zwischen Stromazellen der Knochenmarkmikroumgebung (BMSC/OB) und leukämischen Zellen zu modellieren. Von besonderer Bedeutung ist die Beobachtung, dass leukämische Zellen relativ zur Stromazell-Monoschicht drei räumliche Subpopulationen bilden und dass die PD-Population aufgrund ihrer Interaktion mit dem BMSC oder OB eine Chemotherapie-resistente Tumorpopulation darstellt. Darüber hinaus zeigen wir, wie die leukämischen Zellpopulationen effektiv durch G10-Säulen isoliert werden können. Bemerkenswert ist, dass wir festgestellt haben, dass die Isolierung dieser Subpopulationen eine nachgelagerte Analyse der resistentesten PD-Population ermöglicht, um potenzielle Resistenzmodi zu bestimmen, die diesen Zellen aufgrund ihrer Interaktion mit der Mikroumgebung des Knochenmarks, Stromazellen oder Osteoblasten übertragen werden. Zu den Techniken, die wir diesem Co-Kultur- und Isolationsmodell nachgeschaltet haben, gehören die durchflusszytometrische Bewertung, die proteomische Analyse und die gezielte Bewertung der Proteinexpression sowie die in jüngerer Zeit entwickelte Laserablations-Elektrospray-Ionisation (LAESI) und die Seahorse-Analyse zur Bewertung von Stoffwechselprofilen. Durch die Verwendung dieses Modells in Kombination mit den oben genannten Techniken haben wir festgestellt, dass die Parkinson-Population leukämischer Zellen einen chemotherapieresistenten Phänotyp aufweist, der im Vergleich zu leukämischen Zellen, die allein in Medien kultiviert wurden, oder solchen, die aus den anderen Subpopulationen in derselben Co-Kultur gewonnen wurden, einzigartig ist. Als solches eignet sich dieses Modell für eine strengere Evaluierung, um Strategien zu testen, die auf die chemotherapieresistentesten Leukämiezellen abzielen, die ihren resistenten Phänotyp durch Interaktion mit der Mikroumgebung des Knochenmarks erhalten.

Protokoll

1. Advanced Vorbereitung

1. Vorbereiten Dextran G10 Partikel.
   1. Bereiten G10 Aufschlämmung durch Zugabe von 50 ml 1x PBS zu 10 g G10 Teilchen. Mischen durch Umdrehen und lassen G10 aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° CO / N zu regeln.
   2. Der Tag des G10-Säule Trennung absaugen PBS aus der ständigen G10-Partikel und 50 ml frischem PBS hinzufügen. Mischen durch Umdrehen. Zweimal wiederholen, Zugabe von 50 ml frischem PBS ständiger G10 Teilchen und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
2. Kultivieren BMSC und OB.
   1. Halten beide BMSC oder OB bei 37 ° C in 6% _{CO 2} und 10 cm-Gewebekulturplatten gezüchtet, bis 90% Konfluenz erreicht wird.
   2. Trypsinize BMSC oder OB-Zellen und spalten 1: 2 auf neue 10 cm-Platten. Die Zellen werden auf diese Normen herangezogen, bis für leukämische Co-Kultivierung benötigt wird.

2. Aufbau und Pflege einer Co-Kultur

1. In 5-20 x 10 ⁶ Leukämiezellen in 10 ml tumorspezifischen Kulturmedien auf einem 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte.
   HINWEIS: Unser Labor hält Co-Kulturen bei 37 ° C in 5% _{O 2,} um besser die Knochenmark-Mikroumgebung rekapitulieren, die von 1% bis 7% auf einen Bereich ^16-18 gezeigt ist. Doch bei diesem Sauerstoffspannung Kokulturen Aufrechterhaltung ist nicht kritisch für die Festlegung der drei Leukämie Subpopulationen und liegt im Ermessen des Labors.
2. Jeden ^{4. Tag} alle, aber 1 ml Medium (einschließlich leukämischen Zellen in Suspension) entfernen und mit 9 ml frisch Leukämiekulturmedien ersetzen. Beim Entfernen von 9 ml Medium von der Platte, sein nicht vorsichtig die BMSC oder OB haftende Schicht zu stören.
   1. Entfernen Sie das Medium durch Platte zur Seite und absaugen Medien in der Ecke der Platte zu kippen. Außerdem, wenn frisches Medium hinzufügen, achten Sie darauf, tropfenweise in die Ecke der Platte gegen die Seitenwand hinzuzufügen minimaler Unterbrechung des BMSC oder OB haftende Schicht zu gewährleisten.
3. Nach dem ^12. Tag der Co-Kultur, spülen Leukämiezellen von BMSC oder OB Schicht durch Pipettieren von Kulturmedien von Schale nach oben und unten leicht über der Schale etwa 5 bis 10 mal und dann in 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Reseed auf neu 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte als 2,1 in Schritt beschrieben.
   HINWEIS: Die schonende Spülung der Co-Kultur wie in Schritt 2.3 wird S und PB leukämischen Zellen ohne Störung des BMSC oder OB-Monoschicht zu entfernen. Dies ermöglicht nur Tumorzellen auf die nächste Co-Kulturplatte überführt werden. Diese 12-Tage-Zyklus kann so oft wie erforderlich auf Bedürfnisse der Nutzer wiederholt werden.

3. Vorbereitung G10 Bead Columns

HINWEIS: Wenn sterile Downstream-Analyse oder die Kultivierung folgenden G10-Säule Trennung erforderlich ist, die folgenden Schritte steriler Technik zunutze machen sollten, und G10 Spalten sollte in einem sterilen biologischen Haube sein Setup durchgeführt.

1. Pre-warm Zellkulturmedien auf 37 ° C in einem Wasserbad (~ 30 ml pro Säule). Mit einem 10-ml-Einwegspritze, zu entfernen und Kolben verwerfen. In Glaswolle Spritze.
2. Mit einer Pinzette auseinanderziehen Glaswolle in dünne lose Stränge. In mehreren Schichten aus leicht verpackt Glaswolle an der Spritze, bis 2/3 der Spritze mit Glaswolle gefüllt ist.
   HINWEIS: Die Glaswolle ist entscheidend Verunreinigungen der Leukämiezell Sammlung lose G10 Partikel zu verhindern. Stellen Sie sicher, Glaswolle gepackt genug, um die G-10-Partikel zu unterstützen, aber nicht zu dicht gepackten Medienstrom durch die Säule zu blockieren.
3. Bringen 1-Wege-Hahn auf die Spitze der Spritze in die geschlossene Position.
4. Clamp Spritze Spalte Ring stehen hoch genug, so eine 50 ml konischen Röhrchen (Sammelrohr) kann unter Absperrhahn platziert werden. Zeigen Sammelröhrchen unter Spritze Spalte.
5. Mit einem 10 ml-Pipette hinzufügen, tropfenweise, Partikel G10 in PBS auf die Säule oben aufdie Glaswolle. Fügen Sie weitere G10 Partikel bis zu einem ~ 2 ml Pellet aus G10-Teilchen bildet sich auf der Oberseite des Glaswolle (wie von Abstufungen auf die Spritze gemessen).
6. Gleichgewicht kommen die G-10-Säule, die mit vorgewärmten Medien.
   1. 2 ml vorgewärmten Medien Spalte. Offene Absperrventil langsam, so dass Medien fließt aus der Spalte tropft.
   2. Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis insgesamt 10 ml vorgewärmtes Medium wurden über die Säule lief.
      HINWEIS: Wenn G10 Partikel in der Strömung durch die Sammelrohr gesehen werden, entweder 1) mehr G10-Partikel in den halten ~ 2 ml Pellet dafür, dass keine zusätzlichen G10 Partikel aus der Kolonne entweichen oder 2) ersetzen Säule mit einem unbenutzten ein und wiederholen Schritte 3.4-3.6.1.
   3. Nach den vorgewärmten Medien Abflüsse aus der Säule, den Wasserhahn schließen und Sammelrohr mit Fluss durch verwerfen. Hinzufügen neuer Sammelröhrchen unter Spalte. Spalte ist bereit, mit Medien + Zellgemisch geladen werden.
      HINWEIS: Spaltensofort und nicht erlaubt sollten zum Trocknen verwendet werden.

4. Die Trennung 3 Subpopulationen in Co-Kultur

1. Sammlung von Suspension (S) Tumor Subpopulation.
   1. Absaugen Medien von Co-Kulturplatte mit Pipette und sanft wieder gelten die gleichen Medien, um die Platte zu spülen und Medien, die Leukämiezellen in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Die Leukämiezellen gesammelt sind die S-Subpopulation.
2. Sammlung von Phase Bright (PB) Tumor Subpopulation.
   1. 10 ml frisches Medium wieder auf Co-Kulturplatte. Spülen Sie kräftig durch hinzugefügte Medien Auf- und Abpipettieren etwa 5 mal haftLeukämieZellen zu entfernen, aber nicht hart genug haft BMSC / OB Komponente zu entfernen.
   2. Saugen Sie mit Pipette und sammeln Medien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Die gesammelten Zellen sind die PB Subpopulation.
3. Sammlung von Phase-Dim (PD) Tumor Subpopulation.
   1. Rinse-Platte mit 1 ml PBS zu remove Stoffreste. Trypsinize Co-Kulturplatte mit 3 ml Trypsin und Ort in 37 ° C Inkubator für 5 min.
   2. Entfernen Platte von Inkubator und sanft tippen Seiten der Platte haft BMSC / OB zu entfernen.
   3. 1 ml fötales Rinderserum (FBS) und Pipette auf und ab 3-5 mal abgesehen große Zellaggregate zu brechen.
   4. Sammeln Medien mit Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Diese Zellen sind das ungereinigte PD Subpopulation mit BMSC / OB als auch.
4. Zentrifuge 3 Subpopulationen bei 400 g für 7 min isoliert. Saugen und Überstand verwerfen dann individuell resuspendieren Pellets in 1 ml vorgewärmten Medien. Zellen sind bereit, auf einer G10-Säule geladen werden.

5. Laden Co-Kulturzellen auf G10-Säule

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Hahn wird vor der Zugabe von Medien, die Zellen zu G10-Säule vollständig geschlossen. Außerdem muss jede Unterpopulation über einen separaten G10-Säule lief, so nicht zu introducE keine Vorspannung zwischen Populationen in Downstream-Analyse.

1. Mit einem 1000 ul Pipette, 1 ml von jeder Zell-Subpopulation in vorgewärmten Medien zu einem separaten G10-Säule tropft. Stellen Sie sicher, dass die Medien die Zellen bleibt an der Spitze oder innerhalb G10 Pellet enthält. Erlauben Zellen für 20 min bei RT auf G10 Pellet inkubiert.
   HINWEIS: Absperrhahn geschlossen bleibt für die Dauer der Inkubation.

6. Sammeln Leukämiezellen von G10-Säule

1. In 1-3 ml vorgewärmt Medien zu den G-10-Säule. Offene Absperrventil und erlauben Medien die Spalte tropfenweise langsam zu beenden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine langsame Fließgeschwindigkeit aus der Säule oder der G10-Pellet, das BMSC / OB zu pflegen können aus der Säule zu waschen und die isolierten Leukämiezellen kontaminieren.
2. Weiter hinzuzufügen vorgewärmten Medien in kleinen Schritten (1-2 ml) auf G10-Säule, bis insgesamt 15 bis 20 ml hat durch die Säule laufen und gesammelt wurde. Absperrhahn schließen vaSammelröhrchen lve und Kappe.
   HINWEIS: Wenn ein G10 Partikel-Pellet am Boden des Sammelrohrs gesehen wird, sanft entfernen Medien aus dem Rohr verlassen G10 Partikel-Pellet ungestört und Übertragung auf neue Röhre.
3. Zentrifuge gesammelt Medien bei 400 × g für 7 min bei RT. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in Puffer geeignet für Folgeanwendungen.
4. Die Zellen sind nun eine reine Population von Leukämiezellen frei von BMSC oder OB Kontamination und sind bereit, bei der Benutzer Ermessen zu Downstream-Anwendungen angewendet werden.
   HINWEIS: Leukämiezelllebensfähigkeit sollten unverändert bleiben, wenn die Zellen durch G10 Säulen vorbei.

Ergebnisse

Erfolgreichen Aufbau und die Kultur dieser Co-Kultur-Modell wird bei der Errichtung von drei Subpopulationen von Leukämiezellen gegenüber dem haft BMSC oder OB-Monoschicht führen. Abbildung 1 zeigt, wie alle in einem BMSC Monoschicht ausgesät Zellen zunächst als nur eine einzige Population von suspendierten erscheinen Leukämiezellen. Im Laufe von 4 Tagen mit dem BMSC Leukämiezellen interagieren 3 Raum Subpopulationen von Leukämiezellen zu bilden (gesperrt (S), Phase hell...

Diskussion

Minimaler Resterkrankung (MRD), das mit Rückfall der Krankheit beiträgt wie vor eine große klinische Herausforderung bei der Behandlung von aggressiven refraktärer ALL, sowie eine Vielzahl von anderen hämatologischen Malignitäten zu sein. Das Knochenmark-Mikroumgebung ist die häufigste Lokalisation eines Rückfalls in ALLEN ^3,8. Als solche Modelle, die das Knochenmark-Mikroumgebung sind wichtige Werkzeuge zu testen Hypothesen während der Chemotherapie Exposition gegenüber leukämischen Überleben von Tumorzellen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
G10 Sephadex Kügelchen	Sigma	G10120	Im Manuskript bezeichnet als Geltyp 10 vernetzte Dextranpartikel
10 ml sterile Spritze	BD	309604
Glaswolle	Pyrex	3950
1-Wege-Absperrhähne	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml konische Zentrifugenröhrchen	World Wide Medical Products	41021039	Wird als Sammelröhrchen
15 ml konische Zentrifugenröhrchen	World Wide Medical Products	41021037	Wird für die Zellentnahme
Fötales Rinderserum	Sigma	F6178
0,05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Zellkulturschalen	Greiner Bio-One	664160
Nährmedien
	PromoCell	C-27001	Für humane Osteoblasten
RPMI 1640 Medien	Mediatech, Inc.	15-040	Für die Vorbereitung von Tumormedien
Zelllinien
Adhärente Zellen:
Menschliche Osteoblasten	PromoCell	C-12720	Humane Osteoblasten wurden gemäß dem Lieferanten kultiviert" Empfehlungen.
Humane Knochen-Morrow-Stromazellen	WVU-Biospecimen-Kern		anonymisierten primären menschlichen Leukämie- und Knochenmark-Stromazellen (BMSC) wurden vom Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core und der West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank zur Verfügung gestellt. BMSC-Kulturen wurden wie zuvor beschrieben etabliert (*)
Leukämische Zellen:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH-Zellen wurden gemäß dem Lieferanten kultiviert." Empfehlungen und empfohlene Medien.
SD-1	DSMZ	ACC 366	und SD-1 wurden gemäß den Anforderungen des Lieferanten kultiviert. Empfehlungen und empfohlene Medien.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Störung der Funktion der Stromazellen des Knochenmarks durch Etoposid. Biol Blutmarktransplantation J Am Soc Blutmarktransplantation. 1997 Aug; 3(3):122–32.