Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Abstract

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren, in situ quantitative Einzelzellexpressionsanalysen von Protein durchzuführen Abstammung Spezifikation zu studieren in Maus Präimplantationsembryonen. Die Verfahren, die für die Embryo-Entnahme, Immunfluoreszenz-Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop und Bildsegmentierung und Analyse beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung der Expression von mehreren Kernmarken und die räumliche (XYZ) Koordinaten aller Zellen im Embryo. Es nutzt MINS, einer Bildsegmentierung Software-Tool speziell für die Analyse von konfokalen Bildern von Präimplantationsembryonen entwickelt und embryonalen Stammzellen (ESC) Kolonien. MINS trägt über den X, Y unbeaufsichtigt Kernsegmentierung und Z Abmessungen und erzeugt Informationen über die Zellposition im dreidimensionalen Raum sowie Kernfluoreszenz Ebenen für alle Kanäle mit minimalem Benutzereingabe. Während dieses Protokoll wurde für die Analyse der Bilder optimiertein gutes Signal-Rausch-Verhältnis und bei denen eine hohe Keimdichte stellt eine Hürde für die Bildsegmentierung von Präimplantationsstadium Maus-Embryonen, kann es leicht auf die Analyse von allen anderen Proben angepasst werden ausstellenden (z. B. Expressionsanalyse von embryonalen Stammzellen (ESC ) Kolonien, Zellen in Kultur, Embryonen von anderen Arten oder Stadien, etc.) zu differenzieren.

Introduction

Die Maus preimplantation Embryo ist ein Paradigma die Entstehung und Aufrechterhaltung von Pluripotenz in vivo zu untersuchen, sowie ein Modell für die Untersuchung von Zellschicksal Spezifikation und de novo Epithelisierung in Säugetieren. Die preimplantation Stadien der Entwicklung von Säugetieren sind für die Errichtung der drei Zelllinien her, die zur Blastozyste ausmachen, nämlich die pluripotenten Epiblasten -, die zu den meisten somatischen Geweben und Keimzellen gibt - und zwei extraAbstammungsLinien, die Trophektoderm (TE) und der primitive Endoderm (PRE) (1A) ^1,2. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren (1) Ernte und Präimplantationsstadium Mausembryonen zu beheben, (2) durchführen Immunfluoreszenz-Proteine ​​von Interesse zu kennzeichnen, (3) durchzuführen ganze-mount-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop mit z-Schnittfunktionen verwenden und (4) Kern Segmentierung von konfokalen Bildern durchführen und die anschließende quantitative Bildanalysen. Diese Pipeline erlaubt ter unvoreingenommene Messung der Proteinspiegel für die Zuordnung von Zellidentitäten Subpopulationen von Zellen in situ zu charakterisieren. Für einen einzigen Wurf (in der Regel bis zu 10 Maus-Embryonen) vor 4 Tagen, von Embryo-Entnahme zur Datenanalyse (Abbildung 1B) - Dieses Protokoll kann in weniger als 3 durchgeführt werden. Die gleichzeitige Analyse mehrerer Würfe würde die Bildgebung und Datenanalysezeit Belastung erhöhen, wodurch die Gesamtlänge des Protokolls erstreckt.

Die Präimplantationsstadium Mausembryo ist ein experimentell handhabbar System, das aufgrund seiner geringen Größe und stereotypen Morphologie ^3, geeignet ist, auch für in toto Imaging von zellulären Prozessen mit Einzelzellauflösung. Um eine unvoreingenommene, Systemebene Analyse einer statistisch relevanten Anzahl von Embryonen durchgeführt werden, eine automatisierte, ist die quantitative Analyse Pipeline wünschenswert. Aufgrund der hohen Kerndichte von der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten ( 1A, 2A), versagen herkömmliche Bildsegmentierung Plattformen ausreichender Genauigkeit, um eine automatische oder halbautomatische Arbeitsablauf zu schaffen. Auf der anderen Seite, manuelle Segmentierung, während genau, erlaubt es nicht, die Verarbeitung großer Kohorten von Zellen und Embryonen, noch ist es geeignet für eine reproduzierbare, objektive Bestimmung von Zellidentitäten - was besonders wichtig ist, wenn Entwicklungsstadien studiert, wo Muster von Marker Ausdruck noch nicht vollständig gelöst (zB keine binäre Distribution über eine Bevölkerung aufweisen). Wir haben vor kurzem ein Bild Segmentierungsverfahren zugeschnitten für Maus Präimplantationsstadium Embryonen und embryonalen Stammzellen der Maus (ES-Zellen), die eine hohe Genauigkeit erreicht, während erfordert nur minimalen Benutzereingaben ^8.4 entwickelt und validiert.

Die Analyse Pipeline hier vorgestellten dreht sich um die MATLAB-basierte Bildsegmentierung Werkzeug Modular Interactive Kernsegmentierung (MIN) ^4. MINS performs unbeaufsichtigt Kernsegmentierung auf große Chargen von konfokalen Z-Stapel, nachdem der Benutzer eine minimale Anzahl von Bildeigenschaften hergestellt ist, eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) (Tabelle ^{1) 4} verwendet wird. Diese Pipeline effizient zur Erzeugung von Hochdurchsatz-Daten auf die Proteinexpression und Zellortung sowohl in Wildtyp erwiesen hat, experimentell behandelt und genetisch Embryonen und WSR ^7.5 geändert. Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Minuten, um die Segmentierung von preimplantation stufigen Embryo Bilder. Beispiele für MINS Leistung auf WSR verweisen wir auf ^4,7. Die automatisierte Kernsegmentierungsschritt reduziert die zeitliche Belastung der Zelle Identifikationsprozess, während die räumlichen und Fluoreszenzintensitätsmessungen eine unvoreingenommene Bestimmung von Zellidentitäten und die Erzeugung von dreidimensionalen Karten der Genexpression Domänen und Zellenposition in dem Embryo (Abbildung ermöglichen 1C ). Darüber hinaus ermöglicht die Skalierbarkeit dieses Workflows anwendbar es um die Analyse der einzelnen Würfe durch die großen Kohorten von experimentell behandelten Embryonen oder Embryonen von unterschiedlichen genetischen Hintergründe ^5,6. MIN ist bei http://katlab-tools.org (die Software erfordert eine MATLAB Lizenz) frei verfügbar.

Kein Ansatz bis heute entwickelt erlaubt die Erzeugung solche eingehende Daten auf die Proteinexpression und Zellortung in Maus Präimplantationsembryonen. Alle Versuche, die bisher in dieser Art von Daten zu quantifizieren sind für verschiedene Bevölkerungsgruppen in den Embryo (entweder völlig manuell oder softwaregestützt) ^9-19 auf die manuelle Ermittlung und Quantifizierung von Zellzahlen beschränkt. Dieser Ansatz (unter Einbeziehung der MIN-Software) wurde auf Maus Präimplantationsembryonen und WSR zugeschnitten für und getestet; trotzdem seine Leistung auf anderen Systemen mit hoher Atomdichte, obwohl noch nicht erprobt, wird voraussichtlich gleichwertig zu sein.

Protocol

Ethik Aussage: Alle Tier Arbeit, einschließlich Haltung, Zucht und Opfer wurde vom Memorial Sloan Kettering Cancer Center der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt, Protokoll # 03-12-017.

1. Embryo-Entnahme

Hinweis: Alle Tier Arbeit von institutionellen und lokalen Behörden genehmigt worden sein und entsprechen den lokalen und institutionellen Regeln.

1. Mate-Jungfrau weiblichen Maus mit einem fruchtbaren Deckkater der gewünschten Genotypen.
   Hinweis: Wenn natürliche Paarungen einrichten, Frauen in der Brunst Phase des Estral Fahrrads erhöht die Chancen der Kopulation auf das gewünschte Datum. Wenn Superovulation induziert, verweisen wir auf die ^{in 20} beschriebenen Protokollen.
2. Schauen Sie sich die Anwesenheit eines Vaginalpfropfens am Morgen mit einem stumpfen Sonde. Im Idealfall muss dies vor Mittag (12.00 Uhr), wie Kopulationsplugs den ganzen Tag verloren gehen. betrachten noon der Detektion des Vaginalpfropfens embryonalen Tag (E) 0,5.
3. Auf den gewünschten Tag und Zeit der embryonalen Entwicklung, Aufwärmen M2 oder Spülung Haltemedium (FHM) auf RT oder vorzugsweise 37 ºC. Hinweis: Entweder M2 oder FHM kann zum Spülen und Umgang mit Embryonen verwendet werden. Wenn nicht in Gebrauch ist, bewahren Sie diese Medien bei 4 ºC. Schätzen Sie die Verwendung von ~ 2 ml Medium für jede Gebärmutter.
4. Eingefrorene 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder eine frische Lösung vorzubereiten. Schätz 500 ul 4% PFA-Lösung pro Vertiefung einer 4-Well-Platte. Fix einen Wurf auf jede Vertiefung einer 4-Well-Platte. Hinweis: Alternativ kann eine 96-Well-Platte verwendet werden können, zu reparieren und zu speichern Embryonen. Bei Verwendung einer 96-Well-Platte, benutzen Sie 100 ul von PFA-Lösung pro Vertiefung.
5. Ziehen Sie ein Glas Pasteurpipette mit einer offenen Flamme eine Kapillare Ende an der Spitze zu ziehen.
6. Opfern Weibchen durch Genickbruch oder _{CO 2} Inhalation oder als von den lokalen und institutionellen Regelungen erforderlich. Es ist oft desirable Euthanasie des Tieres durch Genickbruch zu bestätigen.
7. Spray Bauch des Tieres mit 70% Ethanol Haarausfall zu minimieren und führen einen Bauchschnitt, zuerst durch die Haut und in der Folge durch die Körperwand (Bauchfell), um die Eingeweide freizulegen.
   Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben den Vorgang zu sammeln Blastozysten aus der Gebärmutter einer schwangeren weiblichen Maus in jeder Phase zwischen E3.25 und E4.5 (1A). Für Protokolle auf Sammlung von Präimplantationsembryonen früher als E3.25, siehe ^20.
8. Suchen Sie die Gebärmutter und entfernen Sie aus dem Tier. zervikalen Ende der Gebärmutter mit einer Pinzette hält, schneiden durch den Gebärmutterhals und ziehen Sie vorsichtig beide Uterushörner zu strecken.
9. Trim Fett aus der Gebärmutter, kümmert sich nicht um die Gebärmutterwand zu durchbohren. Dies kann leicht zum Zeitpunkt der Entfernung durchgeführt werden, während immer noch mit dem Körper des Tieres befestigt sind, wie der Uterus heraus gestreckt werden kann. Alternativ ist esspäter durchgeführt werden, unter einem Präpariermikroskop, in RT PBS kann. Für eine detailliertere Protokoll auf Dissektion der Gebärmutter, siehe Protokolle 5 und 8 ²⁰
10. Schnitt über die Eileiter, unter den Eierstöcken, die gesamte Gebärmutter zu lösen, statt auf einer Petrischale geben und mit PBS.
    Anmerkung: Dieser Schritt ermöglicht auch die Reinigung von überschüssigem Blut oder andere Verunreinigungen aus der Gebärmutter, die Ernte nachfolgenden Blastozyste erleichtert.
11. Separate beide Uterushörner von durch das proximale Ende Schneiden auf beiden Seiten des Gebärmutterhalses und die Zervix verwerfen. Trennen Sie die Eileiter von der Gebärmutter von unterhalb des Isthmus Schneiden, die sie (1A) verbindet. Bringen Sie die beiden Hörner zu einem Rückgang der Manipulation Medium (entweder M2 oder FHM) für Embryo-Entnahme und Manipulation.
12. Unter einem Präpariermikroskop, bündig Blastozysten aus der Gebärmutter und in das Medium durch zwingen 0,5-1 ml M2 oder FHM durch jedes Uterushorn von der Halsöffnung. Verwenden Sie ein 1ml Spritze mit einer Nadel hypodermales. Hinweis: Die Nadel abgestumpft werden, um eine Ablage Stein mit zu vermeiden, dass die Uteri reißen, obwohl dies nicht kritisch ist. Eine detaillierte Darstellung für Uterusspülung kann ^{in 21} gefunden werden.
13. Mit dem Präpariermikroskop, suchen Sie die Blastozysten, die in der ganzen Tropfen Medium verstreut werden. Es kann bis zu 1-2 min für Blastozysten nach dem Spülen auf dem Boden der Schale zu versenken. Mit dem Mund-kontrollierte, Glas Pasteurpipette mit einer Kapillare Ende, sammeln alle Blastozysten und Transfer zu einem frischen Tropfen Medien.
14. Spülen Blastozysten, indem sie durch zwei sich bewegenden - 3 Tropfen frisch M2 oder FHM. Bewegen Embryonen in Gruppen von 5-10 Blastozysten zu einem Zeitpunkt.
    Hinweis: Verschieben von größeren Gruppen zu einem beliebigen Zeitpunkt den Prozess beschleunigt, aber es erhöht auch die Chancen der versehentlich viele Embryonen zu verlieren. Wenn bei der Verwendung von Mund-gesteuerten Pipetten untrainierten, Embryomanipulation und Transfer üben sollten, bevor b betrachtet werdeneginning das Experiment.
15. Entfernen Sie die Zona pellucida (ZP) von nicht geschlüpften Blastozysten (in der Regel
16. Vorsicht beim entblößt Blastozysten Handhabung, da sie sehr leicht auf Glas und Kunststoffoberflächen haften. Manipulation Medium enthält 4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) Befestigung zu verhindern, aber Säure Tyrode-oder PBS tun daher nicht die Gefahr einer Beschädigung oder Verlust der Embryonen zu reduzieren nicht abholen mehr als 2-5 entblößt Blastozysten zu einer Zeit, wenn sie in BSA freien oder serumfreien PBS oder saure Tyrode-Manipulation.
    Hinweis: Alternativ Beschichtung der Glaspipette mit 1% BSA vor der Verwendung zu reduzieren Einhaltung der Embryonen auf die Glasoberfläche.

Mantel der Boden jeder Vertiefungeiner 4-Well-Gewebekulturschale mit einer dünnen Schicht von 1% Agar, mit dem Kunststoff 0,9% NaCl Anhaften von Embryonen zu verhindern. Alternativ hinzuzufügen 4 mg / ml BSA zu dem PBS (PBS-BSA).

Füllen einer Vertiefung der beschichteten 4-Loch-Gewebekulturschale mit 500 ul RT PBS (oder PBS-BSA) und weitere gut mit 500 ul 4% PFA in PBS.

Spülen Blastozysten in RT PBS und fixieren in 4% PFA in PBS für 10 min bei RT. Transfer zum PBS (oder PBS-BSA) nach der Aufzeichnung.

Wenn Embryonen nicht sofort verarbeitet gehen werden, decken die PBS die Embryonen mit einer Schicht aus Mineralöl enthält, um Verdunstung zu verhindern (was zu Austrocknungs der Probe) und speichern die Platte bei 4 ºC.
Hinweis: Verschiedene Befestigungsverfahren und -zeiten können verwendet werden, je nach Experiment, die Epitope von Interesse und die Antikörper verwendet werden. Je nachdem, was die Methode der Wahl, sein konsequent über Äquivalent Experimente anschließenden Vergleich der Färbungsergebnisse zu erleichtern.
Hinweis: PausePunkt: Die Embryonen können bis zu mehreren Wochen bei 4 ° C in PBS gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. Stellen Sie sicher, PBS ist steril und / oder mit 100 U / ml Penicillin + 100 ug / ml Streptomycin (Pen-Strep) bakterielle Kontamination zu vermeiden (vor allem bei der Verwendung von PBS-BSA), wenn die Lagerung verlängert vorweg.

2. Immunfluoreszenz

1. Führen Immunfluoreszenz mit beliebigen Protokollen, die zuvor getestet und bewiesen, für ganze-mount Immunfluoreszenz robust. Hinweis: Wir empfehlen die in ^{22 und 11} beschrieben. Im vorliegenden Artikel wird der ehemalige beschrieben. Je nachdem, was die Methode der Wahl, sein konsequent über Äquivalent Experimente Vergleich der Färbungsergebnisse zu erleichtern.
2. Verwenden Sie eine flexible, Polyvinylchlorid, klar, U-Boden-96-Well-Platte die aufeinanderfolgenden Schritte der Immunfluoreszenz-Protokoll durchzuführen. Füllen Sie jede Vertiefung mit 50 bis 100 ul Lösung und bewegen Embryonen aus einer Lösungzum anderen einen L-förmigen Mund Pipette. Hinweis Diese Vorgehensweise die Verwendung von Reagenzien minimiert und erleichtert Schritte sowie die parallel Färbung von mehreren experimentellen Gruppen zu verfolgen.
   1. Optional: Mantel der Boden der Vertiefungen mit einer dünnen Schicht von 1% Agar, 0,9% NaCl, die Haftung von Embryonen auf den Kunststoff zu verhindern. Fügen BSA nicht zu Immunfluoreszenz-Lösungen.
3. Bereiten PBX (0,1% Triton X-100 in PBS). Wenn die Leistung von mehreren Immunfluoreszenz-Experimente erwarten, bereiten 50 ml PBX und lagern bei 4 ° C zwischen den Experimenten.
4. Bereiten Permeabilisierung Lösung (0,5% Triton X-100, 100 mM Glycin in PBS). Machen Sie 1 ml (oder je nachdem, welcher Betrag erforderlich) an frischem Permeabilisierung Lösung für jedes Experiment.
5. Bereiten Blockierlösung (2% Pferdeserum (HS) oder 20% fötalem Rinderserum (FBS) mit Pen-Strep in PBS). Bereiten Sie 10 ml und bei 4 ° C zwischen den Experimenten.
   1. Keine Unterschiede wurden beobachtet zwischen entwederArt von Serum ist jedoch konsistent in der Wahl der Lösung für äquivalente Experimenten verwendet blockieren.
6. Spülen Sie fixierte Embryonen für 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBX (~ 100 ul).
7. Permeabilisieren Embryonen für 5 min bei RT in Permeabilisierung Lösung (~ 100 & mgr; l).
8. Spülen Embryonen für 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBX (~ 100 ul).
9. Block Embryonen für 30 min bis 1 h bei RT in ~ 100 & mgr; l Blockierungslösung. Decken die Lösung mit einer Schicht aus Mineralöl Verdampfung zu verhindern oder in einer befeuchteten Kammer halten.
   Anmerkung: Die Embryonen können für bis zu O / N Perioden bei 4 ºC ohne merkliche Verbesserung oder Beeinträchtigung blockiert werden im Vergleich zu 30 min blockiert Schritte.
10. Inkubieren Embryonen O / N bei 4 ºC in primären Antikörper / verwässert Antikörper in Blocking-Lösung (~ 100 ul). Decken die Lösung mit einer Schicht aus Mineralöl Verdampfung zu verhindern oder in einer befeuchteten Kammer halten.
    1. Bestimmen Sie optimale Verdünnung für jeden primären Antikörper vorher. siehe dISKUSSION und Werkstoffbereich für getestet Verdünnungen einer Anzahl von Antikörpern.
11. Nach O / N Inkubation spülen Embryonen für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBX (~ 100 ul) 3x.
12. Block Embryonen für 30 min bis 1 h bei RT in ~ 100 & mgr; l Blockierungslösung. Decken die Lösung mit einer Schicht aus Mineralöl Verdampfung zu verhindern oder in einer befeuchteten Kammer halten.
13. Inkubieren Embryonen für 1 bis 2 Stunden bei 4 ºC in sekundärem Antikörper / Antikörper bei 4 & mgr; g / ml in ~ 100 & mgr; l verdünnt der Blockierungslösung. Decken die Lösung mit einer Schicht aus Mineralöl Verdampfung zu verhindern oder in einer befeuchteten Kammer halten.
14. Spülen Embryonen 2x für jeweils 5 min bei RT in TK-Anlage.
15. Bewegen Embryonen auf bevorzugte DNA Fleck. Bei Verwendung von Hoechst 33342, verdünnt auf 5 ug / ml in PBS. Decken die Lösung mit einer Schicht aus Mineralöl Verdampfung zu verhindern oder in einer befeuchteten Kammer halten.
    Hinweis: Punkt Pause: Wenn Embryonen werden nicht sofort abgebildet werden, können sie für u gehalten werdenp bis zu mehreren Wochen in Kernfärbung Lösung. In diesem Fall sicher, PBS steril ist und / oder fügen Sie Pen-Strep oder Natriumazid Bakterienwachstum und eine Verunreinigung zu verhindern.

3. Die konfokale Imaging

Hinweis: Einzelne Konfokalmikroskop Konfigurationen werden spezifische Erfassungsparameter erfordern für das System und Software im Einsatz angepasst werden. Allerdings sieht der folgende Abschnitt eine Reihe von allgemeinen Regeln zu beachten, dass für jede gegebene Installation sein sollte.

1. Mit einem feinen Mund Pipette, stellen Mikrotropfen von PBS oder Kernfärbung Lösung auf der Glasoberfläche eines 35-mm-Glasbodenschale und Deckel mit Mineralöl. Als Alternative, eine regelmäßige Deckglas mit Silikontrenn verwenden, um zu vermeiden, die Embryonen zu beschädigen und decken mit einem Glasobjektträger. Hinweis: Wenn Sie eine regelmäßige Deckglas verwenden, Embryonen nicht nachträglich neu positioniert oder für die Genotypisierung zurückgewonnen werden kann, daher empfehlen wir Ihnen die Verwendung von Glasboden empfehlenGeschirr.
2. Platz Embryonen in den Mikrotropfen und arrangieren in einer konsistenten Art und Weise, vorzugsweise mit dem ICM-Hohlraum Achse parallel zur Glasoberfläche. Richten Sie Schüssel auf dem Mikroskophalters. Hinweis: erhalten Bilder auf Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopen leiden an einer Z-Achse-assoziierten Verlust der Fluoreszenzintensität. Daher Konsistenz in der Anordnung ist wichtig für Intensitäten zwischen gleichwertigen Regionen auf verschiedenen Embryonen zu vergleichen.
3. Richten Sie Referenzparameter mit Wildtyp-Embryonen, die nicht unterzogen wurden, auf jede Art von Behandlung, die Genexpression verändern können.
   1. Erwerben Sie Bilder mit einer hohen Vergrößerung Ziel verwenden (dh 40X oder höher), um Daten zu erhalten, die eine genaue Segmentierung mit der MIN-Tool ⁴ erleichtert.
      Hinweis: Die Verwendung digitaler Zoom auf einem 20x-Objektiv wird nicht Bilder von adäquater Auflösung liefern für die Segmentierung mit MIN. Man sollte auch den Arbeitsabstand (WD) der Objektiv beachten, wie es sein sollteausreichend Erwerb einer Z-Stapel zu ermöglichen, die eine ganze Blastozyste, wodurch eine lange WD (~ 130 bis 150 um) überspannt ist Ziel der Regel notwendig. Die Abbildungen in den Figuren 2 bis 4 wurden unter Verwendung eines 40X / NA 1,30 Ölimmersionsobjektiv mit einem Arbeitsabstand von 210 & mgr; m erfasst.
   2. Verwenden Sie die niedrigste Laserausgangsleistung, die ohne Bleichen der Fluorophore ein starkes Signal-zu-Rausch-Verhältnis bietet.
   3. Stellen Sie den Gain und Offset die breiteste Dynamikbereich ohne Überbelichtung der Probe zu erhalten. Freilegen der Bilder decken die meisten, oder überspannen die gesamte, Graustufenbereich zwischen den Bildern, die Erkennung von kleinen Unterschiede in der Intensität erleichtert.
   4. Mit einem kleinen (1 & mgr; m) Z-Stufe, da der Z-Achse Auflösung für eine genaue Segmentierung mit MINS kritisch ist.
      Hinweis: XY Dimensionen haben keinen Einfluss auf das Kernsegmentierungsprozess, nur die Größe der Bilddatei. Im Allgemeinen 512 x 512 Pixel ist eine ausreichende XY Auflösung zur Veröffentlichung hochwertige Bilder ohne compromiFestplattenspeicher singen.
   5. Critical Schritt: Halten Parameter konsistent innerhalb und zwischen den Imaging-Sitzungen desselben Experiments Abbilden so in der Lage zu sein, Proben zu vergleichen.
4. Imaging Chargen von Embryonen:
   1. Bild zusammenhängende Gruppen (Würfe, Experimente) in einer einzigen Sitzung, wann immer möglich.
   2. Halten Parameter konsistent innerhalb und zwischen den Bildgebungssitzungen für Wiederholungen desselben Experiments.
   3. Bild Embryonen im gesamten (ganze Z-Achse) jede Zelle zu erfassen.
      Hinweis: Falls gewünscht, Embryo Genotypisierung kann nach der Bilderzeugung durchgeführt werden, wie in ²³ beschrieben. Die Notwendigkeit für verschachtelte PCR muss empirisch bestimmt werden und hängt von der Ortskurve ab, um zu verwende analysiert und die Primer.
5. Stellen Sie sicher, der Lage sein, Embryonen rückwirkend auf die Bilder ein.

4. Bildanalyse und Datenvorverarbeitung

1. Downloaden und installieren Sie MINS ⁴ von http: // katlab-tools.org (MATLAB-Lizenz erforderlich).
2. Führen Sie die Bildsegmentierung:
   1. Folgen Sie der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) von MIN ein konfokales Bild zu laden oder von der Festplatte stapeln, erkennen die Kerne und das Segment das Bild. Legen Sie das gesamte Z-Stapel von Rohdaten durch das Mikroskop erzeugt (.lsm, .lif, .OIF, etc.). Siehe Tabelle 2 für Details zu jedem Schritt und fand Hinweise auf http://katlab-tools.org ^{und 4.} Einmal vollendet, sehen die Ergebnisse der einzelnen Schritte durch die entsprechende "Ansicht" klicken. Ein gelber Tag über der Taste zeigt den Betrieb in Verfahren, ein grüner Tag gibt abgeschlossen Betrieb.
      Hinweis: MIN derzeit nicht unterstützt .czi Dateien, TIFF-Sequenzen oder Multi-Positions-Dateien - jedes Z-Stapel eine unabhängige Datei sein muss.
   2. Nach zufriedenstellenden Segmentierung, speichern Sie die Pipeline erstellt, so dass es direkt für andere Embryonen oder Würfe eingesetzt werden können.
3. Batch-Modus Segmentierung:
   Anmerkung: Single Dateien können individuell segmentiert werden. Angesichts der Tatsache, dass Embryonen in einem Wurf oder Experiment allgemein vergleichbarer Stufe sind, können MINS die Segmentierung Pipeline für ein einzelnes Bild an eine Gruppe von ihnen ohne Aufsicht erstellt anzuwenden.
   1. Von der Batch-Modus Menü Ausführen klicken Sie auf "Dateien hinzufügen", und laden Sie alle Dateien auf einmal verarbeitet werden. Hinweis: Dateien aus unterschiedlichen Quellen können zur Segmentierung Warteschlange hinzugefügt werden.
   2. Klicken Sie auf "Start Batch-Modus Run 'und genügend Zeit für die Software, um die Dateien zu verarbeiten. Hinweis: Die Segmentierung Ausgabe wird im gleichen Verzeichnis gespeichert werden, in dem die ursprünglichen Dateien, in denen sich.
4. Segmentierung Beurteilung und manuelle Korrektur
   Anmerkung: MINS Segmente Bilder mit sehr hoher Genauigkeit (> 85%), jedoch ist die Qualität der Färbung und Bildverarbeitung, sowie die Phase des Embryos kann beeinflussen MINS Leistung. Im allgemeinen je höher die Kerndichte im Embryo, werden die eher Segmentierungsfehler nehmen place (Figuren 2D, 3). Somit sollte Segmentierung Genauigkeit für jede Probe werden ausgewertet und manuell bei Bedarf korrigiert. Zwei Arten von Fehlern typischerweise auftreten: Übersegmentierung und Unter Segmentierung.
   1. Beheben von Übersegmentierung:
      1. Identifizieren Fehlalarme - apoptotischen Vesikeln (3A a, b, d, Sternchen) oder andere Elemente, die nicht intakt Kerne sind, die aber als solche von MIN identifiziert worden sein.
         Hinweis: Im Allgemeinen sind solche falschen Positiven haben eine kleinere Größe als echte Kerne und kann in den meisten Fällen werden leicht identifiziert und auf die Tabelle sortiert. Jedoch ist die visuelle Untersuchung stark empfohlen, da oftmals Kerne können nur teilweise segmentiert werden, was zu einer kleineren, aber gültig segmentierten Volumen (3A b, Pfeilspitze).
      2. Löschen Sie die entsprechenden Einträge für Fehlalarme aus der * statistics.csv Datei. Bewahren Sie die Original * StatistikenCSV-Datei zum Nachschlagen und bearbeiten nur eine Kopie davon.
      3. Wenn ein Kern war über segmentiert und als zwei oder mehr Kernen (3A c, Pfeil und Pfeilspitzen) vorgestellt, entweder die Datensätze zusammenführen, indem ihr Intensitätsniveau von durchschnittlich oder, wenn ähnliche, für diese Zelle eine der Aufzeichnungen und verwerfen die sich ausruhen.
   2. Auflösen unter Segmentierung:
      1. Identifizieren Veranstaltungen, bei denen MINS ausgefallen ist die Grenze zwischen zwei oder mehr Kerne zu erkennen und somit segmentiert sie als einen einzigen Kern (3A d, Pfeil und 3B). Anmerkung: Dies stellt ein Problem für eine genaue Zellzahl, aber noch wichtiger ist, für Protein-Ebene zu quantifizieren, da die gemessenen Werte wird der Mittelwert der Zellen sein, die irrtümlich zusammengeführt worden sind, und die zu unterschiedlichen Linien gehören.
      2. Identifizieren Veranstaltungen, bei denen MINS einen Kern zu erkennen, ganz ausgefallen ist.
      3. In diesen Fällen (4.4.2.1 und 4.4.2.2), messen die durchschnittliche Graustufen foder jeder Kanal in der Unter- oder un-segmentierten Zelle (n) ein alternatives Werkzeug, wie ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), und ersetzen Sie den fehlerhaften Datensatz mit den richtigen Ebenen. Bewahren Sie die Original * statistics.csv Datei zum Nachschlagen und bearbeiten nur eine Kopie davon. Um dies zu tun ImageJ, gehen Sie folgendermaßen vor:
         1. Öffnen Sie das entsprechende Multi-Channel-Stack auf ImageJ und importieren Sie die entsprechenden * overlaid.tiff Datei erzeugt durch MIN als virtuelle Stapel ( "Datei"> "Importieren"> "TIFF virtuellen Stack ... ').
         2. Suchen Sie ein Mittelabschnitt des Unter- oder un-segmentierten Kern.
         3. Mit dem Freihandauswahlwerkzeug skizzieren den Umfang der Unter- oder un-segmentierten Kern auf dem DNA-Fleck-Kanal.
         4. Drücken Crl + M (Befehlstaste + M auf einem Macintosh) oder wählen Sie das Menü Analysieren und wählen Sie "Maßnahme". Durch diese Aktion wird der mittlere Grauwert für den Bereich skizziert aufnehmen und wird es auf einem neuen Fenster angezeigt. Zum "Analysieren">9; Set Messungen ... "und stellen Sie sicher," Grauwert bedeuten "ausgewählt wird. Wählen Sie alle anderen Parameter zu messen.
         5. Mit dem gleichen Bereich in Schritt skizziert 4.4.2.3.3, wiederholen Sie die Messung für jede der Fluoreszenzkanäle von Interesse. Die Ergebnisse werden auf der Messungen "Ergebnisse" Fenster zum anderen angehängt werden.
         6. Mit den erhaltenen Messungen die fehlerhaften Datensätzen in der * statistics.csv Datei zu ersetzen. Wenn der Kern segmentiert worden waren, legen Sie eine neue Zeile, weisen Sie einen neuen Cell-ID und führen die in ImageJ erhaltenen Werte unter der entsprechenden Spalte für jeden Kanal. Diese Zelle wird nicht über Raumkoordinaten (X, Y und Z-Werte). Wenn der Kern undersegmented worden war, zu vervielfältigen seiner Reihe, weisen unterschiedliche Handy-IDs auf jede neue Zelle und stellen die erhaltenen Werte in ImageJ unter der entsprechenden Spalte. In diesem Fall teilen sich beide Zellen Raumkoordinaten.
            Hinweis: Wenn räumliche Verteilung analysiert werden soll, we recommend die XYZ-Koordinaten ohne dieser Zellen, da sie überlappen. Zu diesem Zweck wird, wenn neue Aufzeichnungen zu schaffen, Cell-IDs zuweisen, die von den ursprünglichen leicht zu unterscheiden sind (zum Beispiel, nicht-Integer-Zahlen).
   3. Ergebnis teilende Zellen. Anmerkung: MINS mitotische als auch Interphasezellkernen detektiert, aber nicht zwischen ihnen unterscheiden kann.
      1. Wenn mitotischen Kerne separat in der Analyse berücksichtigt werden sollen, manuell diese Partitur und diese Informationen an die Datendatei hinzuzufügen. Um mitotischen Zellen aufnehmen, fügen Sie eine neue Variable (Spalte) mit dem * statistics.csv Datendatei und verschiedene Werte zuweisen mitotischen und Interphase-Kernen.
5. Datenvorverarbeitung.
   Hinweis: Sobald die Tabellen für Über- und Unter Segmentierung korrigiert wurden sie bereit sind, analysiert werden. Der Analyseprozess und Datenpräsentation werden von der besonderen Experiment abhängen. Allerdings sind unten einige allgemeine DatentransformationenWir empfehlen, vor der Analyse aus:
   1. Transformieren der Fluoreszenzintensitätswerte in ihre Logarithmus oder Quadratwurzel die Streuung der Daten zu reduzieren. Dies hilft auch, Visualisierung, wie die Rohdaten sind in der Regel in der Nähe der Achsen des Grundstücks (siehe 4B, C) ​​zu konzentrieren.
   2. Korrigieren Sie die Z-assoziierten Dämpfung der Fluoreszenz:
      Anmerkung: Die Fluoreszenzintensität in Laser Scanning Konfokalmikroskopie Bilder verringert die tiefer auf der Z-Achse eine Scheibe befindet (4E, F).
      1. Wenn einer der in den Proben nachgewiesen Epitope ein allgegenwärtiges und homogen ist Housekeeping Kernmarker ausgedrückt, normalisieren die Fluoreszenzintensitäten der anderen Epitope durch ihre Werte in jeder Zelle mit dem entsprechenden Wert des Haushaltsmarker unterteilen.
      2. In Abwesenheit eines solchen Referenzmarker, kompensieren Z-assoziierten Fluoreszenzverlust in der folgenden Weise:
         1. Zeichnen Sie die Werte der einzelnen Marker (YGrundstück gemeinsam die Werte für alle Steuer, Wildtyp-Embryonen (4F) - Achse der Grafik) über den Z-Position (X-Achse der Grafik), um die Abnahme der Intensität über Z zu visualisieren.
         2. Fit ein lineares Modell (Regressionskurve) auf dem Grundstück in der vorhergehenden Stufe (Intensitätswerte über Z) für jeden Marker (4F).
         3. Korrigieren Sie alle Werte für jeden Marker mit folgender Formel:
            log (Originalwert) + Z * Steigung des Modells (4D, G).
            Hinweis: Die einzelnen Schritte dieser Korrektur durchführen werden auf der Analyse-Software abhängen verwendet (R, MATLAB, etc.). Wenn R verwenden, führen Sie die folgende Formel ein lineares Modell an den Daten zu passen:
            > Lm (log (Kanal) ~ Z, data = Datenrahmen)
            wo der Kanal ist die Fluoreszenzkanal korrigiert werden, Z ist die Z-Koordinate und Datenrahmen ist die Tabelle, die alle Werte für die gewünschte Embryo (s) (der * stat enthältistics.csv Datei erzeugt von Minuten oder einer Modifikation davon).
            Hinweis: Das Ausgangssignal der obigen Formel wird die folgende Format haben:
            (Intercept) Z
            4,76373 -,01947
            wo ist der Wert Z die Steigung der Regressionsgeraden für die Datenmenge, die Absolutwert verwendet werden sollte, um den ursprünglichen Wert mit der Formel in 4.5.2.2.3 (siehe Abbildung 4G für ein Beispiel) gegeben zu ändern.

Results

Zur Interpretation der Daten und Präsentation zu erleichtern, sollte darauf geachtet werden, nicht die Embryonen während der Entnahme und Manipulation zu beschädigen, so dass alle Zellen und ihre relative Position analysiert werden 2A -. D zeigt Beispiele von intakten Blastozysten in unterschiedlichen Stadien mit einem erweiterten Hohlraum. Sollten Schäden auftreten, sollte besonders darauf geachtet werden, bei der Analyse und Interpretation der Ergebnisse.

Discussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um eine quantitative Analyse von Vollmontage Immunfluoreszenz auf Präimplantationsstadium Mausembryonen durchzuführen. Eine robuste Immunfluoreszenz-Protokoll ²² durch hochauflösende folgt, ganze-mount konfokaler Bildgebung und durch Bildsegmentierung ein maßgeschneidertes Stück Software ⁴ verwenden. Während die Wahl von Immunfluoreszenz-Protokoll nicht kritisch ist, finden wir das hier ²² präsentiert eine schnelle, zuverlässige, und wir...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embryo Collection
stumpfe Sonde zur Steckerprüfung	Roboz	RS-9580
Pinzette	Roboz	RS-4978
Chirurgieschere	Roboz	RS-5910
Glass Pasteur Pipetten	Fisher	13-678-20C
Vormontiertes Aspiratorrohr & Mundstück	Sigma	A5177
Längerer Gummischlauch	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Saure Tyrodenlösung	Millipore	MR-004-D
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Rinderserumalbumin	Sigma	A9647
4-Well-Platten	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Immunfluoreszenz
96-Well-U-Bodenplatten	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycin	Sigma	G7403
Pferdeserum	Sigma	H0146<
stark>Primäre Antikörper			Concentration
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, 10 min Fixierung
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, O/N Fixierung
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 min to O/N Fixation
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Sekundärantikörper	Life Technologies	Various	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imaging
35 mm Glasbodenschalen	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer mit 64-Bit-Windows-Betriebssystem		n/a	Überprüfen der minimalen Systemanforderungen bei http://katlab-tools.org und in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (Software)	Mathworks	n/a
MINS (Software)	Kostenlos	n/a	http://katlab-tools.org