Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.
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Methodenartikel
Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll stellt ein Verfahren, in situ quantitative Einzelzellexpressionsanalysen von Protein durchzuführen Abstammung Spezifikation zu studieren in Maus Präimplantationsembryonen. Die Verfahren, die für die Embryo-Entnahme, Immunfluoreszenz-Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop und Bildsegmentierung und Analyse beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung der Expression von mehreren Kernmarken und die räumliche (XYZ) Koordinaten aller Zellen im Embryo. Es nutzt MINS, einer Bildsegmentierung Software-Tool speziell für die Analyse von konfokalen Bildern von Präimplantationsembryonen entwickelt und embryonalen Stammzellen (ESC) Kolonien. MINS trägt über den X, Y unbeaufsichtigt Kernsegmentierung und Z Abmessungen und erzeugt Informationen über die Zellposition im dreidimensionalen Raum sowie Kernfluoreszenz Ebenen für alle Kanäle mit minimalem Benutzereingabe. Während dieses Protokoll wurde für die Analyse der Bilder optimiertein gutes Signal-Rausch-Verhältnis und bei denen eine hohe Keimdichte stellt eine Hürde für die Bildsegmentierung von Präimplantationsstadium Maus-Embryonen, kann es leicht auf die Analyse von allen anderen Proben angepasst werden ausstellenden (z. B. Expressionsanalyse von embryonalen Stammzellen (ESC ) Kolonien, Zellen in Kultur, Embryonen von anderen Arten oder Stadien, etc.) zu differenzieren.
Einleitung
Die Maus preimplantation Embryo ist ein Paradigma die Entstehung und Aufrechterhaltung von Pluripotenz in vivo zu untersuchen, sowie ein Modell für die Untersuchung von Zellschicksal Spezifikation und de novo Epithelisierung in Säugetieren. Die preimplantation Stadien der Entwicklung von Säugetieren sind für die Errichtung der drei Zelllinien her, die zur Blastozyste ausmachen, nämlich die pluripotenten Epiblasten -, die zu den meisten somatischen Geweben und Keimzellen gibt - und zwei extraAbstammungsLinien, die Trophektoderm (TE) und der primitive Endoderm (PRE) (1A) 1,2. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren (1) Er....
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Protokoll
Ethik Aussage: Alle Tier Arbeit, einschließlich Haltung, Zucht und Opfer wurde vom Memorial Sloan Kettering Cancer Center der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt, Protokoll # 03-12-017.
1. Embryo-Entnahme
Hinweis: Alle Tier Arbeit von institutionellen und lokalen Behörden genehmigt worden sein und entsprechen den lokalen und institutionellen Regeln.
- Mate-Jungfrau weiblichen Maus mit einem fruchtbaren Deckkater der gewünschten Genotypen.
Hinweis: Wenn natürliche Paarungen einrichten, Frauen in der Brunst Phase des Estral Fahrrads erhö....
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Ergebnisse
Zur Interpretation der Daten und Präsentation zu erleichtern, sollte darauf geachtet werden, nicht die Embryonen während der Entnahme und Manipulation zu beschädigen, so dass alle Zellen und ihre relative Position analysiert werden 2A -. D zeigt Beispiele von intakten Blastozysten in unterschiedlichen Stadien mit einem erweiterten Hohlraum. Sollten Schäden auftreten, sollte besonders darauf geachtet werden, bei der Analyse und Interpretation der Ergebnisse.
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Diskussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um eine quantitative Analyse von Vollmontage Immunfluoreszenz auf Präimplantationsstadium Mausembryonen durchzuführen. Eine robuste Immunfluoreszenz-Protokoll 22 durch hochauflösende folgt, ganze-mount konfokaler Bildgebung und durch Bildsegmentierung ein maßgeschneidertes Stück Software 4 verwenden. Während die Wahl von Immunfluoreszenz-Protokoll nicht kritisch ist, finden wir das hier 22 präsentiert eine schnelle, zuverlässige, und wir.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Die Autoren danken Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan und Panagiotis Xenopoulos für ihren Input zur Datenverarbeitung, -analyse und -darstellung, Berenika Plusa für die Unterstützung bei der Entwicklung des Immunfluoreszenzprotokolls und der Antikörpertests sowie den Mitgliedern des Hadjantonakis-Labors für ihre Kommentare zum Manuskript und zur Entwicklung dieses Protokolls. Die Arbeit in unserem Labor wird von den National Institutes of Health R01-HD052115 und R01-DK084391 sowie von NYSTEM N13G-236 unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Embryo Collection | |||
| stumpfe Sonde zur Steckerprüfung | Roboz | RS-9580 | |
| Pinzette | Roboz | RS-4978 | |
| Chirurgieschere | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur Pipetten | Fisher | 13-678-20C | |
| Vormontiertes Aspiratorrohr & Mundstück | Sigma | A5177 | |
| Längerer Gummischlauch | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Saure Tyrodenlösung | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma | A9647 | |
| 4-Well-Platten | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunfluoreszenz | |||
| 96-Well-U-Bodenplatten | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycin | Sigma | G7403 | |
| Pferdeserum | Sigma | H0146< | |
| stark>Primäre Antikörper | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R& D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min Fixierung |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N Fixierung |
| SOX17 | R& D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N Fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Sekundärantikörper | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm Glasbodenschalen | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer mit 64-Bit-Windows-Betriebssystem | n/a | Überprüfen der minimalen Systemanforderungen bei http://katlab-tools.org und in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (Software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (Software) | Kostenlos | n/a | http://katlab-tools.org |
Referenzen
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and....
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Nachdrucke und Genehmigungen
