Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen, die in Richtung der endgültigen Endoderm zur Verbesserung der Downstream-Anwendungen und weitere Differenzierungen begangen werden.

Abstract

Die Differenzierung Fähigkeiten von pluripotenten Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) ermöglichen eine mögliche therapeutische Anwendung für Zell-Ersatz-Therapien. Ausdifferenzierten Zelltypen könnten für die Behandlung von verschiedenen degenerativen Krankheiten verwendet werden. In vitro Differenzierung dieser Zellen gegenüber Geweben der Lunge, der Leber und der Bauchspeicheldrüse erfordert als ersten Schritt die Erzeugung von endgültigen endodermalen Zellen. Dieser Schritt ist geschwindigkeitsbestimmend für die weitere Differenzierung zu endständig gereiften Zelltypen, wie beispielsweise Insulin-produzierenden Beta-Zellen, Hepatozyten oder anderen Endoderm-abgeleiteten Zelltypen. Die Zellen, die in Richtung der endoderm Linie verpflichtet sind ausdrücken sehr eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren wie FOXA2, SOX17, HNF1B, die Mitglieder der GATA-Familie, und der Oberflächenrezeptor CXCR4. Allerdings Differenzierungsprotokolle sind selten 100% effizient. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung eines CXCR4 + Zellpopulation nach der Differenzierungin der DE durch magnetische Mikrokugeln verwendet. Diese Reinigung entfernt zusätzlich Zellen von unerwünschten Linien. Die sanfte Reinigungsverfahren ist schnell und zuverlässig und kann verwendet werden, Downstream-Anwendungen und Differenzierungen zu verbessern.

Introduction

Pluripotente Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) haben die Fähigkeit, in nahezu jedem Zelltyp des menschlichen Körpers zu unterscheiden. Somit können in vitro Differenzierungsprotokollen verwendet werden , um zahlreiche adulten Zelltypen wie Kardiomyozyten ^1, Hepatozyten ^2, beta - Zellen ^{3, 4} oder Lungenepithelzellen neuronalen Zellen ⁵ erzeugen. Dies macht WSR ein wertvolles Werkzeug für die mögliche Behandlung von verschiedenen degenerativen Erkrankungen ^3.

Die in vitro Differenzierung von ES- Zellen gegenüber adulten Geweben der Lunge, de....

Protocol

1. Differenzierung humaner ESC in Richtung Definitive Endoderm

1. Kultivieren humaner embryonaler Stammzellen ( ES- Zellen) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Mantel ein neues 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml einer Basalmembranmatrix und brüten die Kultur-ware für mindestens 30 min bei RT. Für spezielle Informationen wenden Sie sich an die Anweisungen des jeweiligen Herstellers.
3. Bestätigen Sie, dass die kultivierten menschlichen WSR 80% -90% Konfluenz unter dem Mikroskop erreicht haben eine geringe Vergrößerung (zB, 4X). Anzusaugen, das Medium aus den Hohlräumen durch das Medium mit einer sterilen Pasteur-Glaspi....

Results

Bei der Differenzierung WSR laufen drastischen Veränderungen in der Gen und Proteinexpression. Figur 1 typische Markergene darstellt , die verwendet werden können , eine erfolgreiche Endoderm Differenzierung zu verifizieren. Prime Ziele für eine Genexpressionsanalyse sind GSC, FOXA2 und SOX17. In einer relativen Analyse der Genexpression insbesondere FOXA2 und SOX17 erhöht von> 2.000 - fache , wenn sie un.......

Discussion

Derzeit verwendete Differenzierungsprotokolle ergeben sich selten 100% differenzierte Zellen. Aus Gründen, die noch einige Zellen angesprochen werden müssen widerstehen, den Differenzierungsprozess. Abhängig von der Effizienz der verwendeten Differenzierungsprotokoll und die Neigung des ESC Zeile eine bestimmte Anzahl von Rest pluripotenten Zellen häufig beobachtet werden, selbst nach der Differenzierung in die definitive Entoderm. Diese Restzellen können nachgeschaltete Differenzierungen beeinträchtigen oder weitere An.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 humane embryonale Stammzelllinie	Harvard Department of stem cell & regenerative		Geeignete Zelllinie für die Endodermgenerierung
Hes3 humane embryonale Stammzelllinie	ES Cell International		Geeignete und robuste Zelllinie für die Endodermgenerierung
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC Kulturmedium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
Anti-APC	MicroBeads Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	Magnetfeld
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK-Inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Reagenz für sanfte Zelldissoziation	Stemcell Technologies	7174	Enzymfrei Passaging-Lösung, alternativ: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	Basalmembranmatrix * lösen und in Aliquoten bei -80 &° lagern; C wie im Lieferantenhandbuch beschrieben. Nach Gebrauch auf Eis auftauen, in 25 ml eiskaltem Knockout-Knockout DMEM/F-12 verdünnen. 1 ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte geben und 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Das Matrigel entfernen und sofort verwenden.
MS Säulen	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Mensch FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Mensch FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Leben Technologien
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan Assay	Angewandte Biosysteme	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgggtgtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnologie	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R& D Systems	AF1924