Methodenartikel

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

DOI:

10.3791/53676

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28. November 2015

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Zusammenfassung

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Unser Labor hat kürzlich gezeigt, dass natürliche Killerzellen (NK) in der Lage, die Beseitigung orthotop implantierten Maus GL26 und Ratten-ZNS-1 malignen Gliomen bald nach intrakraniellen Transplantation, wenn die Krebszellen sind mangelhaft in ihrer Expression des β-Galactosid-bindenden Lektin Galectin erbrachten -1 (Gal-1). Neuere Arbeiten zeigt nun, dass eine Population von Gr-1 + / CD11b + myeloiden Zellen ist wichtig, diesen Effekt. Zum besseren Verständnis der Mechanismen, durch die NK und myeloide Zellen zusammenwirken, um Gal-1-defizienten Tumorabstoßung verleihen haben wir ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Analyse von Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen (PBMC) entwickelt. Das Verfahren wird hier durch den Vergleich PBMC Infiltration in das Tumormikroumgebung demonstriert gal-1-exprimierenden GL26 Gliome mit denen gemacht über shRNA Zuschlags gal-1-Mangel. Das Protokoll beginnt mit einer Beschreibung, wie Kultur und bereiten GL26 cells zur Impfung in den syngenen C57BL / 6J Maus Gehirn. Er erklärt dann die Schritte in der Isolation und durchflusszytometrische Analyse von Gliom-Infiltration PBMCs aus dem frühen Gehirn Tumor-Mikroumgebung beteiligt. Das Verfahren ist adaptierbar an einer Reihe von in vivo Versuchsanordnungen, in denen zeitliche Daten auf Immuninfiltration in das Gehirn erforderlich. Die Methode ist empfindlich und hoch reproduzierbare, als Gliom-Infiltration PBMCs aus intrakraniellen Tumoren so schnell wie 24 Stunden nach der Tumor-Transplantation mit vom Zeitpunkt abgestimmt Tumoren im gesamten unabhängigen Experimenten beobachtet ähnliche Zellzahlen isoliert werden. Eine einzelne Experimentator kann das Verfahren aus dem Gehirn der Ernte durchzuführen, um zytometrische Analyse von Gliom-infiltrierenden PBMCs fließen in etwa 4-6 Stunden, je nach der Anzahl der zu analysierenden Proben. Alternative Gliom-Modelle und / oder zellspezifischen Nachweis Antikörper können auch an der Experimentatoren Ermessen verwendet werden, um das Eindringen von mehreren anderen immun zu bewertene Zelltypen von Interesse ohne die Notwendigkeit für die Änderung des Gesamtverfahrens.

Einleitung

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Gliome sind eine Klasse von neuroepithelial Hirntumoren aus transformierten Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS). Von all den Gliomen, der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Grad IV Gliom oder Glioblastom (GBM), der häufigsten und tödlichen 1. GBM ist hochfeuerfesten dem aktuellen Standard-of-Care, die aus Tumorentfernung in dem Maße möglich, gefolgt von einer Strahlentherapie mit gleichzeitiger und adjuvanter Chemotherapie mit Temozolomid 2 besteht. Diese tödliche Krebserkrankungen führen einen düstere Prognose von nur 15-18 Monaten des Überlebens aus der Zeit der ersten Diagnose mit nur 5% der Patienten überleben die Krankheit nach 5 Jahren 3.

Das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke (BBB), haben Mangel an professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), und das zuvor nicht identifizierte Vorliegen bona fide lymphatischen Strukturen innerhalb des Gehirns 4 auf den Begriff der GBM als Immun privilegierten geführt. Doch jetzt zahlreiche Studien show dass diese Hirntumoren Tat erzeugen die Rekrutierung von peripheren Immunzellen, die vorwiegend myeloiden Ursprungs sind die Monozyten, Makrophagen und myeloische-Suppressorzellen (MDSC) 5 umfassen. GBM auch Einfluss auf die Aktivität der Gehirnansässigen Mikroglia zu pro-tumorigenen 6,7 geworden. Lymphoide Zellen, wie CD8 + T-Zellen 8 und CD56 + natürlichen Killerzellen 9 sind ebenfalls im Tumor-Mikroumgebung vorhanden, jedoch in viel geringerer Zahl, eine Tatsache angenommen, dass aufgrund immunsuppressive Funktion Gliom abstammenden Faktoren auf Tumor-assoziierte Makrophagen eingeleitet werden ( TAMs) 10. CD4 + T-Zellen sind auch in GBM, aber ein großer Teil dieser Bevölkerung drückt auch CD25 und FoxP3, Hersteller von immunsuppressiven regulatorischen T (T reg) Zellen 11. Die Gesamt immunsuppressiven Zustand der GBM gipfelt in der Förderung der immunologischen Flucht und Tumorprogression 12.

Ein besseres Verständnis der Mechanismen der GBM Immunsuppression ist kritisch für die Entwicklung einer wirksamen immun Strategien entwickelt, um das Immunsystem gegen den Tumor stimulieren. Im Laufe der letzten 15 Jahren unser Labor gearbeitet hat, um die Mechanismen der Gehirntumor immunosuppresson um wirksame neue Anti-GBM-Immuntherapeutika 13-19 Entwicklung zu überwinden. Der Höhepunkt dieser Arbeit wurde nun auf einer klinischen Studie konzipiert, um eine kombinierte zytotoxische und immunstimulatorischen Therapeutikum für Patienten mit neu diagnostiziertem GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov Identifier) ​​zu bewerten geführt.

Unsere jüngste Arbeit zeigt, dass Maus GL26 und Ratten CNS-1 GBM Zellen blockieren Anti-Tumor-NK-Zell-Immunüberwachung durch die Produktion großer Mengen des β-Galactosid-bindenden Lektin Galectin-1 (Gal-1) 20. Dies wurde durch die Unterdrückung der Expression von gal-1 in Gliomzellen mit shRNA-vermittelte Gen-Knockdown demonstriert. In vitro experiments zeigte, dass gal-1-defizienten Gliomzellen normalerweise in Kultur vermehrt, noch eine rasante Ablehnung bald nach intrakraniellen Verpflanzung in syngene C57BL / 6J oder RAG1 - / - Mäuse und schafft so die Unabhängigkeit der T- oder B-Zellen, die auf diese Form der Tumorabstoßung. NK-Zellen Immunodepletion mit anti-Asialo-GM 1-Antiserum oder monoklonalen Antikörpern NK1.1 führte zur vollständigen Wiederherstellung von intrakraniellen gal-1-defizienten Gliom Wachstum, zur Gründung der Rolle von NK-Zellen in gal-1-defizienten Gliom Ablehnung. Wir zeigen nun, dass die Immundepletion der Gr-1 + / CD11b + myeloiden Zellen ausreichend ist, um Gal-1-defizienten Gliom Ablehnung trotz der Anwesenheit von NK-Zellen zu verhindern, offenbart somit ein unverzichtbares Hilfsrolle für myeloide Zellen in den gleichsinnigen von NK-vermittelte gal -1-defizienten Tumor Lyse (unveröffentlichte Daten). Dieses unerwartete Ergebnis hat uns dazu geführt, eine umfassende Protokoll für die Isolierung und Analyse von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu entwickeln,infiltrieren das Gehirn Tumor-Mikroumgebung bald nach intrakraniellen engraftment damit wir bessere Charakterisierung der Immuninfiltration Ereignisse, die gal-1-defizienten Gliom Ablehnung Prädikat.

Das Verfahren wird hier durch die Verwendung der Maus GL26 Gliom-Zellen, die konstitutiv exprimieren mCitrine fluoreszierendes Protein, genannt GL26-Cit, die direkte Tumorzellvisualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie 21 erlauben demonstriert. Diese Zellen werden stereotaktisch in das Gehirn eines syngenen C57BL / 6J-Mäusen eingeimpft und für 24, 48 oder 72 Stunden vor der Euthanasie Maus wachsen. Gliom-Infiltration PBMCs werden dann isoliert und immun mit Anti -CD45, -GR-1, -CD11b und -NK1.1 Zelloberflächenantikörper zusammen mit intrazelluläre Immunmarkierung für Granzym B (GzmB). Diese spezielle Kombination von Antikörpern erlaubt die Identifizierung von Tumor-infiltrierenden Gr-1 + / CD11b + myeloiden Zellen und NK1.1 +, NK-Zellen, Zelltypen wir been verwickelt in gal-1-defizienten Tumorabstoßung. Die Immuninfiltration Profil gal-1-defizienten GL26-Cit Gliom, hier bezeichnet als GL26-Cit-gal1i, wird dann zu der Gliome exprimieren ein normales Niveau von Gal-1 genannt GL26-Cit-NT, die ein nicht enthalten im Vergleich Targeting Steuer shRNA Haarnadel. Das Protokoll beginnt mit einer Beschreibung, wie man Kultur GL26-Cit-Gliomzellen in vitro, die durch eine Erklärung, wie orthotop engraft diese Zellen in das Striatum von syngenen C57BL / 6J Mäusen folgt. Es geht dann zu den Schritten bei der Isolierung und Immunmarkierung von Gliom-Infiltration PBMCs für durchflusszytometrische Analyse beteiligt aufzuzählen. Das Protokoll schließt mit einer Erläuterung von Standarddatenanalyse und grafische Darstellung.

Die Demonstration zeigt, dass sowohl Gr-1 + / CD11b + myeloischen Zellen und NK1.1 + NK-Zellen bevorzugt im gal-1-defizienten Gehirn Tumor-Mikroumgebung innerhalb von 48 akkumulierenhr der Tumorimplantation, ein Ergebnis, das zu erklären, warum diese Tumoren schnell komplette Tumorlyse ca. 1 Woche nach der Tumor-Transplantation unterziehen 20 hilft. Das Verfahren ist leicht an einer Reihe von in vivo verschiedenen experimentellen Designs, in welchem ​​zeitlichen Daten auf Immuninfiltration in das Gehirn erforderlich. Eine einzelne Experimentator kann das Protokoll von Gehirn Ernte durchzuführen, um zytometrische Analyse von Gliom-infiltrierenden PBMCs fließen in etwa 4-6 Stunden, je nach der Anzahl der zu analysierenden Proben. Das Verfahren kann auch mit Experimenten gerichtet, um das Profil des zirkulierenden PBMCs in tumortragenden Mäuse für einen Vergleich mit denen, die das Gehirn infiltrieren so Immunsuppression Phänotypen speziell von der Tumor-Mikroumgebung induziert identifizieren charakterisieren kombiniert werden. Anwendung dieser und ähnlicher Verfahren sollte ein besseres Verständnis der Faktoren, die in den Handel mit peripheren Immunzellen in das Gehirn Tumor-Mikroumgebung beteiligt sind, erleichtern.

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Protokoll

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Hinweis: Bitte lesen Sie das gesamte Protokoll vor der Durchführung von Experimenten. Genehmigung für den Einsatz von Wirbeltieren aus dem geeigneten institutionellen Ausschusses über die Verwendung und das Wohlergehen der Tiere müssen vor dem Verfahren erhalten werden.

1. Vorbereitung der Tumorzellen für intrakranielle Engraftment

  1. Die Arbeit in einem Klasse-II-biologischen Sicherheitswerkbank, beginnen Sie mit der Vorbereitung GL26-Cit-NT / gal1i Zellkulturmedien durch Ergänzung eine 500 ml Flasche Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% steril filtriert hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS ), 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 600 ug / ml G418-Sulfat (zur Selektion des mCitrine Expressionsvektor) und 3 & mgr; g / ml Puromycin dihydrochlorid (zur Selektion des nicht Targeting oder gal-1-spezifischen shRNAs).
  2. Kultur GL26-Cit-NT und / oder GL26-Cit-gal1i Zellen (1A und 1B ) In einem Gewebekulturkammersoll bis 37 ° C und 5% CO 2 für 1-2 Tage vor der Tumor-Transplantation Verfahren oder bis die Kolben 50-80% Konfluenz erreichen.
  3. Am Tag der Operation, entfernen Sie den Zellkulturmedien von den Gliomzellen unter Verwendung einer 10 ml serologische Pipette und eine Pipette Pistole und entsorgen Sie die Medien in einen Abfallbecher.
    1. Der Kolben invertieren Top-side-down und 10 ml DPBS auf der Oberseite der Kolben unter Verwendung einer 10 ml serologische Pipette. Der Kolben wird an die Zellen in DPBS decken langsam umzukehren, dann die Flasche vertikal kippen und entfernen und entsorgen Sie die DPBS in einen Abfallbecher.
  4. Fügen Sie 3-4 ml der Nicht Säugertrypsins Alternative in DPBS mit EDTA (siehe Materialliste für Details) in jede T75 Zellkulturflasche und setzen Sie zurück in die Zellkulturschrank für 2-5 min. Unter Verwendung einer Hellfeld-Mikroskop, überprüfen Sie, ob alle Zellen haben sich losgelöst von der Bodenfläche, bevor Sie fortfahren.
  5. Hemmen further die enzymatische Aktivität durch Verdünnen des Trypsin Alternative mit 6 ml DPBS. Pipette nach oben und unten unter Verwendung einer 10 ml Pipette serologischen an der Bodenfläche des Kolbens zu spülen und zu Zellaggregaten mechanisch dissoziiert. Saugen Sie die Zellen aufnehmen und in jeweils markierte 15 ml Zentrifugenröhrchen. Dreh die Zellen nach unten bei 550 xg (max RCF) für 5 min bei 4 ° C (Abbildung 1C).
  6. Entfernen Sie den Überstand und Erythrozyten vorsichtig resuspendieren mit 1 ml un-DMEM ergänzt. Stellen Sie sicher, um die Zellen mit einem P-1000-Mikropipette pipettiert nach oben und unten gründlich, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen.
  7. Einen 1:10 Verdünnung des in 1.6 erzeugte resultierende Zellsuspension, indem 18 ul un ergänztem DMEM in einen 0,6 ml fassenden konischen Polypropylen-Mikroröhrchen, gefolgt von der Zugabe von 2 ul der Tumorzellsuspension. Pipette nach oben und unten mit einem P-10-Mikropipette, um die Zellen gründlich zu homogenisieren.
  8. In 10 ul &# 160; der 1.10 Tumorzellverdünnung in 1,7 bis einem separaten 0,6 ml konischen Polypropylen-Mikroröhre erzeugt wird, dann fügen Sie 10 ul Trypanblau-Färbung mit dem Rohr. Gründlich mit einem P-10-Mikropipette mischen und fügen Sie 10 ul der resultierenden Tumorzelle / Trypanblau-Lösung unter einem Deckglas auf einem Hämozytometer darauf achtend, nicht Luftblasen (1D) einzuführen platziert.
    1. Zähle die Zellen mit einem Hellfeld-Mikroskop unter Verwendung eines 10X-Objektiv entsprechend dem bestimmten Protokoll der gegebenen Hämozytometer verbunden. Achten Sie darauf, in der 20-fachen Verdünnung des ursprünglichen Tumorzellsuspension während der Vorbereitung der Zellen für die genaue Zellschätzung in der ursprünglichen 1 ml aliquoten gemacht Faktor. Verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzahl der Zellen berechnet: Gesamt Zellen / ml = [((Σcells gezählt pro Quadratmeter) / # von Quadraten gezählt) x 20 (dh Verdünnungsfaktor) x 10.000 Zellen / ml].
  9. Nach determining die Gesamtzahl der Zellen, die für jede Zelllinie in der gegebenen Experiment verwendet, drehen sie unten bei 550 xg (max RCF) für 5 min bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes (e) und Resuspendieren der Zellen mit einem geeigneten Volumen von nicht-ergänztem DMEM, um eine Zielkonzentration von 3 x 10 4 Zellen pro 1 & mgr; l für jede Zelllinie gemäß der folgenden Formel zu erzielen: (Gesamtanzahl von Zellen / 30.000).
  10. Platzieren Sie eine gleichwertige Menge von jeder Zelllinie auf Eis (1E) in jeweils markierten 0,6 ml konischen Polypropylen-Röhrchen und Ort. Achten Sie darauf, einige Zellen zu speichern, auch weiterhin ausbreitet jede Zelllinie, wenn getrennte T75s waren zuvor nicht geimpft.

2. Verfahren für die stereotaktische Verpflanzung von Gliom-Zellen in das Striatum von C57BL / 6J Mäuse

  1. Bereiten Sie Arbeitslösungen von chirurgischen Anästhesie, Analgesie, Anästhesie und Umkehr vor der Operation, wie folgt:
    1. Für Ketamin / Dexmedetomidin surgical Anästhesie: Entfernen Sie 1,4 ml von einem 10 ml Fläschchen mit steriler 0,9% NaCl Einspritzung und ersetzen mit 600 ul einer 100 mg / ml Stammlösung von Ketamin-Hydrochlorid und 800 ul einer 0,5 mg / ml Stammlösung von Dexmedetomidinhydrochlorid einer Ausbeute gemischte Arbeitslösung Ketaminhydrochlorid (6 mg / ml) und Dexmedetomidinhydrochlorid (0,04 mg / ml).
    2. Für Buprenorphin Analgesie: entfernen 1 ml aus einem 10 ml Fläschchen mit steriler 0,9% NaCl Einspritzung und ersetzen Sie sie durch die gesamte 1 ml Volumen einer einzelnen 0,3 mg / ml Stamm Buprenorphinhydrochlorid Ampulle, eine 0,03 mg / ml Arbeitslösung zu erhalten.
    3. Für Atipamezol chirurgische Anästhesie Umkehr: entfernen 1 ml aus einem 10 ml Fläschchen mit steriler 0,9% NaCl Einspritzung und ersetzen mit 1 ml einer 5 mg / ml Stammlösung von Atipamezol Hydrochlorid, um eine 0,5 mg / ml Arbeitslösung zu erhalten.
  2. Arbeiten in einem zugelassenen Standort für das Überleben der Mäuse surgery, beginnen durch die Einrichtung autoklavierten bzw. Sicke sterilisierten chirurgischen Instrumenten und anderen Reagenzien, wie sie in (2A) gezeigt, dann ausreichend mit 8-10 Wochen alten weiblichen C57BL / 6J-Mäusen (mit syngenen GL26 Gliom) für die Untersuchung erforderlich ist; sicherzustellen, dass ihre kontinuierlichen Zugang zu Nahrung und Wasser.
  3. Betäuben die erste Maus mit einer einzigen intraperitonealen (ip) Injektion des Arbeits Anästhetikum durch die Bereitstellung einer Dosis von 75 mg / kg Ketamin und 0,5 mg / kg Dexmedetomidin (ungefähr 250 & mgr; l einer 20 g Maus). Als nächstes geben ein 5 mg / kg subkutan (sc) Injektion von Carprofen (ungefähr 100 & mgr; l einer 20 g Maus). Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht mehr reagiert bis Fuß und Schwanz drückt, bevor Sie fortfahren.
  4. Verwendung von chirurgischen Knipser, rasieren, das Fell von der Schädeldecke. Bewerben Povidonjod antiseptischen Lösung auf die rasierte Fläche, schrubben mit einem 70% igem Isopropylalkohol prep Pad, dann erneut bewerben Povidonjod antiseptischen Lösung. Anschließend eine kleine Menge von Sterile Petrolatum Augensalbe für jedes Auge, um ein Austrocknen zu verhindern.
  5. Sichern Sie die Schädel in der stereotaktischen Rahmen nach dem folgenden Protokoll:
    1. Den Mund öffnen Sie vorsichtig durch das Erreichen in mit einem Paar gekrümmter Sezieren einer Pinzette vorsichtig herausziehen Zunge und zu bewegen, um eine Seite der Mund Würgen zu verhindern. Lassen Sie die Pinzette, während in den Mund zurückziehen, um den Kiefer in das Schlüsselloch des Zahnleiste auf der stereotaktischen Rahmen gespreizt und führen die beiden oberen Schneidezähne. Sichern Sie die Zahnstange von horizontal oder vertikal schwenkbaren durch Einstellung der entsprechenden Schrauben. Stellen Sie sicher, dass die Maus Schädel auf gleicher Höhe mit der Tischplatte.
    2. Setzen Sie die Ohr Bars sicher gegen den retroorbitalen Knochen des Schädels darauf achten, nicht zu viel Druck nach innen auf den Schädel, um Brechen zu verhindern, gelten.
    3. Legen Sie die Druckbalken über der Schnauze und festschrauben bis sie fest sitzt. Überprüfen Sie, dass es keine vertikale / seitliche Bewegung in den Kopf mit leichtem Druckmit Daumen und Zeigefinger. Eine Maus richtig in einen stereotaktischen Rahmen plaziert ist in (2B) dargestellt.
    4. Unter Verwendung einer Skalpellklinge, machen Sie einen 1 cm Mittellinienschnitt über dem Schädel aus dem Stirnbein auf dem Hinterhauptbein. Ziehen Sie die Haut an der Einschnitt mit Colibri Wundhaken.
    5. Senken die Mikroliter-Spritze mit einer 33 G-Nadel in die vertikale Arm des stereotaktischen Rahmens direkt oberhalb der Position des Bregma (2C) befestigt sind, versehen. Von dort aus, stellen Sie die Position der Nadel 0,5 mm AP, 2,5 mm ML an den Zielort für die Tumorimplantation zu erreichen. Verwenden Sie eine 1 ml Tuberkulin-Spritze mit einer 26 G-Nadel ausgestattet, um diesen Ort, indem Sie leicht wund das Periost zu markieren.
    6. Bohren Sie ein Loch in den Schädel an der Zielstelle bis zum Erreichen der zugrunde liegenden Dura mater mit einem schnurlosen Präzision Bohrmaschine mit einem 1/32 "(0,8 mm) Bit ausgestattet. Beim Bohren, gelten intermittierenden Druck, gefolgt von Entfernen des drill Bit von der Oberfläche des Schädels, um übermäßige Wärme und Kraft, die andernfalls auf den Bohrmeißel Stechen der darunterliegenden Hirngewebes führen können, zu vermeiden.
  6. Spülen Sie das Mikroliterspritze mit 0,9% NaCl in einem 1,7 ml fassenden konischen Polypropylen-Mikroröhrchen, um sicherzustellen, daß die Nadel verstopft ist. Flick vorsichtig die 0,6 ml konischen Polypropylen-Mikroröhrchen mehrmals mit den Tumorzellen, um die Zellen zu resuspendieren.
  7. Erstellen Sie 2 ul der Zellen in den Mikroliterspritze sicherzustellen, dass keine Luftblasen in die Spritze eingeführt. Können 1 & mgr; l der Zellen auf eine 70% Isopropylalkohol Tupfer Verlassen genau 1 ul von Tumorzellen in der Spritze verbleiben.
  8. Bringen Sie die Nadel nach unten, bis sie die Dura mater berührt, dann führen die Nadel in das Gehirn -3,5 mm ventral und Einfahren von 0,5 mm. Langsam und gleichmäßig liefern die Zellen durch Niederdrücken der Spritzenkolben im Verlauf von 1-2 min.
  9. Lassen Sie die Zellen Settle an der Injektionsstelle für 5 min vor langsames Herausziehen der Nadel. Wischen Sie geronnenem Blut oder Hirnsubstanz aus der Spitze der Nadel mit einem sauberen 70% Isopropylalkohol prep Pad. Spülen der Nadel und Spritze gründlich mit 0,9% NaCl aus Schritt 2.6, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht für die nächste Injektion verstopft.
  10. Entfernen Sie die Colibri Retraktoren und Naht der Kopfhaut mit drei 3-0 Nylonmonofilament Nähten. Entfernen Sie die Maus von der stereotaktischen Rahmen und zu verwalten, 0,1 mg / kg Buprenorphinhydrochlorid subkutan (sc) (ungefähr 67 & mgr; l der 0,03 mg / ml Arbeitslösung für eine 20 g-Maus), gefolgt von 2,5 mg / kg Atipamezol Hydrochlorid intramuskulär (im) (etwa 100 ul der 0,5 mg / ml Arbeitslösung für eine 20 g Maus) für die postoperative Schmerzlinderung und Anästhesie Umkehr. Zeigen postoperativen Mäuse wieder in ihren Käfigen unter einer Wärmelampe zu erholen.

3. Maus transkardialer PerfusIon und Ernten des Gehirns

  1. Vorbereitung heparinisierten Tyrode-Lösung nach dem folgenden Protokoll:
    1. Setzen Sie ein Magnetrührstäbchen in einen 1-l-Glas Schraubverschluss Vorratsflasche und füllen Sie die Lautstärke mit hochreinem deionisiertem Wasser. Stellen Sie die Flasche auf einer Rührplatte.
    2. Wiegen und fügen die folgenden Chemikalien zu der Glasflasche unter Rühren 8 g Natriumchlorid (NaCl), 0,264 g Calciumchlorid (CaCl 2 • 2H 2 O), 0,05 g Mononatriumphosphat (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1,0 g D-Glucose (C 6 H 12 O 6), 1,0 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3), 0,2 g Kaliumchlorid (KCl). Lassen Sie die Salze zu lösen, dann fügen Sie 100 ul einer 1,000U / ml Stammlösung von Heparin-Natrium, um die Tyrodelösung.
    3. Entfernen Sie den Behälter von der Rührplatte und extrahieren Sie die Rührstab mit einem Magnetstab. Speichern heparinisierten Tyrode-Lösung bei 4° C.
  2. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung für Terminalanästhesie wie folgt:
    1. Für Ketamin / Xylazin Terminalanästhesie: Entfernen 1.360 & mgr; l von einem 10 ml Fläschchen mit steriler 0,9% NaCl Einspritzung und ersetzen mit 1200 ul einer 100 mg / ml Stammlösung von Ketamin-Hydrochlorid und 160 ul einer 100 mg / ml Stammlösung von Xylazin Hydrochlorid, um ein gemischtes Arbeitslösung von Ketaminhydrochlorid (12 mg / ml) und Xylazinhydrochlorid (1,6 mg / ml) zu ergeben.
  3. Vorbereitung Dichtezentrifugation Medienmischlösung, indem 90 ml des 10x PBS in 264 ml ultrareinem deionisiertem Wasser (3.93x) in einem sterilen Kunststoffbehälter. PH auf 7,0-7,2 mit HCl und Filter sterilisieren durch ein 0,22 um-Filter. Lagerung bei 4 ° C.
  4. Bereiten Sie 70% Dichtezentrifugation Medien durch die Kombination von 18 ml Dichtezentrifugation Media-Mix-Lösung mit 30 ml Dichtezentrifugation Medien (siehe Materiallistefür Details) in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Lagerung bei 4 ° C, aber bringen RT vor dem Gebrauch.
  5. Vorbereitung 37% Dichtezentrifugation Medien produzierten 9,6 ml DPBS mit 10,4 ml 70% Dichtezentrifugation Medium in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Lagerung bei 4 ° C, aber bringen RT vor dem Gebrauch.
  6. Vorbereitung Flusspuffer, indem 500 ul FBS in 50 ml DPBS (~ 1% FBS) in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Bei der Lagerung ist bei 4 ° C
  7. Füllen Sie eine 4,5 L Polyurethan Eiskübel, um die Kapazität mit Eis-Chips.
  8. Stellen eine kombinierte Lösung von 1 mg / ml Kollagenase und 1 mg / ml DNase-I in ausreichender Menge für 1 ml pro Gehirnprobe in der Studie durch Verdünnen einer 10 mg / ml DNase-I-Stammlösung 1:10 und 50 mg / ml Kollagenase-Stammlösung 1:50 mit sterilem DPBS in einem 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig mischen Sie die Lösung durch Auf- und Abpipettieren mit einer P-1000-Mikropipette. Lagerung auf Eis in der POLYURETHane Eimer aus Schritt 3.7.
  9. Erhalten Sie zwei 7-ml-Glasgewebe Dounce Schleifmaschinen. Beschriften Sie eine "NT" und die andere "gal1i". Legen Sie die Gewebemühlen in der Eiskübel und 1 ml DPBS zu jedem.
  10. Erhalten Sie genug 15 ml Zentrifugenröhrchen, um Hirnsubstanz aus jeder Maus in der Studie und in den Eiskübel zu sammeln.
  11. Platz ~ 150 ml DPBS zwischen drei 50 ml-Zentrifugenröhrchen in den Eiskübel.
  12. Erhalten genug Polystyrol hexagonalen Wägeschalen (oben Innendurchmesser (ID) 115 mm, Basis ID 85 mm, 203 ml Volumen) für jede Maus in der Studie. Das komplette Set up für die Präparation und Verreiben von Mäusegehirnen ist in (3A)
  13. Bei ausgewählten Zeitpunkten, zu betäuben die erste Tumor-tragenden Mäusen in der Studie unter Verwendung einer einzigen IP-Injektion von 150 mg / kg Ketamin Hydrochlorid und 20 mg / kg Xylazin-Hydrochlorid (etwa 250 & mgr; l der kombinierten 12 mg / ml Ketamin / 1,6 mg / ml Xylazin Arbeitslösung für eine 20 g Maus), um tiefer Anästhesie zu induzieren. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht als Reaktion auf Spitze und Schwanz drückt, bevor Sie fortfahren.
  14. Abrufen des zuvor hergestellten Tyrodelösung und in einen Steril an Klemme Tier chirurgischen Verfahren gewidmet. Zeigen gasundurchlässigen Polymerrohrleitung zu einem Carbogen Tank in den Tyrodelösung angebracht. Öffnen des Flaschenventils auf 95% O 2/5% CO 2 Carbogen kontinuierlich Blase in die Lösung ermöglichen.
  15. Befestigen Sie eine 20 G Aluminiumnabe stumpfen Nadel bis zum Ende der zusätzlichen gasundurchlässigen Polymerrohrleitung, um eine Schlauchpumpe angeschlossen. Platzieren Sie den Schlauch am anderen Ende der Schlauchpumpe in die Tyrodelösung und schalten Sie die Pumpe ein, damit der Schlauch mit Sauerstoff angereichertem und heparinisiertem Tyrodelösung zu füllen. Die für Maus transkardialer Perfusion einzurichten ist in (3B) gezeigt.
  16. Mit vier 26 G Nadeln, festzunagelndie narkotisierten Maus Bauchseite von der vorderen und hinteren Pfoten auf einem mit einem Entsorgungs saugfähigen Tuch in der Laminar-Flow-Haube abgedeckt extrudiertem Polystyrolschaum-Block.
  17. Fassen Sie die Haut über der Bauchhöhle mit einem Paar stumpf Pinzetten, und mit einem großen Paar Dissektion Schere machen ein "Y" Einschnitt durch Eindringen in die Bauchwand, Schneiden kranial, um die Membran zu durchstechen, dann gabelt auf dem Brustbein zu kündigen, die linken und rechten Achselhöhlen.
  18. Verwenden Sie eine Gefäßklemme, um das Brustbein zu klemmen und beziehen sich auf den Brustkorb über der linken Schulter die Maus. Entfernen Sie den Herzbeutel mit dem Paar von stumpf Pinzette.
  19. Schalten Sie die Schlauchpumpe, um einen stetigen Tropf von oxygeniertem und heparinisiertem Tyrodelösung (etwa 2,3 bis 2,5 ml / min) zu beginnen.
  20. Legen Sie die stumpfe Nadel in die linke Herzkammer. Verwenden Sie einen kleinen Paar Dissektion Schere, um den rechten Vorhof schnippeln, um Ausbluten zu ermöglichen (Abbildung3C).
  21. Lassen Sie den Tyrodelösung gründlich zu durchströmen die Maus Kreislauf-System, bis die Leber und Lunge vollständig durch das Fehlen von Blut blanchiert. Stellen Sie sicher, dass keine grobe Mengen Blut weiterhin den rechten Vorhof vor dem Entfernen der 20 G Aluminiumnabe stumpfen Nadel aus dem linken Ventrikel zu verlassen.
  22. Unpin die Maus vom extrudiertem Polystyrolschaum-Block und biegen Sie die Maus Bauchseite nach unten. Mit einem großen Paar Dissektion Schere, trennen den Kopf vom Rest des Körpers auf der Ebene des Halses.
  23. Mit einem kleinen Paar Dissektion Schere, schnitt die Kopfhaut an der Mittellinie, beginnend an der Hinterhauptbein arbeitet nach vorn in Richtung der Schnauze, um den Schädel freizulegen.
  24. Ziehen Sie die Haut auf beiden Seiten des Schädels mit einem Daumen und Zeigefinger und halten den Schädel sicher. Verwenden Sie ein Paar Knochen Rongeurs, um durch die Schädeldecke, beginnend an der Hinterhauptbein zu brechen und arbeiten uns auf die dorsale und laterale vollständig auszusetzenOberflächen des Gehirns. Seien Sie vorsichtig, um Schäden am Gehirn zu minimieren.
  25. Sobald die Schädelknochen entfernt worden sind, drehen Sie den Kopf der Maus Bauchseite nach oben und mit einem kleinen Paar Dissektion Schere, um die Hirnnerven an der Basis des Gehirns, um sie aus dem Schädel zu befreien geschnitten.

4. Isolierung von Gliom-Infiltration PBMCs

  1. Mit einem sauberen einzigen Rasierklinge, isolieren den Bereich des Gehirns, die den Tumor, indem Sie einen sagittalen Schnitt in der Mitte des Gehirns, die beiden Hemisphären halbieren. Drehen Sie den ipsilateralen Hemisphäre medialen Seite nach unten und machen zwei koronale Schnitte auf der Ebene des Kleinhirns und des Riechkolbens, um die mit dem Tumorimplantat (4A) Zielgewebe zu isolieren. Ein äquivalenter Abschnitt des kontralateralen Hemisphäre kann auch isoliert und als Negativkontrolle verwendet werden.
  2. Legen Sie das Zielgewebe in die jeweils markierte Glas Dounce Gewebemühle mit 1 ml; DPBS, drücken Sie den Kolben ganz nach unten und drehen Sie 7-mal, um das Gewebe zunächst zu unterbrechen. Heben Sie den Kolben, damit die Flüssigkeit wieder auf den Boden der Gewebemühle begleichen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal; aber erst während der letzten Wiederholung drehen Sie den Kolben 4 mal während der nächsten zwei Wiederholungen und 3-mal, um zu vermeiden, über Verreiben des Gewebes.
  3. Unter Verwendung eines P-1000-Mikropipette, sequentiell gelten drei 1 ml Volumina eiskaltem DPBS (in 3.11 vorbereitet) entlang der Seiten des Kolbens in die Gewebemühle ausspülen.
  4. Resuspendieren verrieben Hirnsubstanz durch Auf- und Abpipettieren und in einen markierten 15 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis. Mit 1 Zusatz ml eiskaltem DPBS Spülen Sie die Seiten des Dounce Gewebemühle und in den selben 15 ml Zentrifugenröhrchen. Bis alle Proben bearbeitet wurden Bewahren Sie alle Röhrchen, die verrieben Gehirnmasse auf Eis.
  5. Wiederholen Sie die Schritte von 3,13 bis 3,25 und 4,1 bis 4,4 für jede Maus in der Studie.
  6. Nachdem alle Proben have verarbeitet worden sind, drehen Sie die verrieben Hirnsubstanz in der 15 ml-Zentrifugenröhrchen bei 740 · g (max RCF) für 20 min bei 4 ° C.
  7. Entfernen Sie den Überstand mit einer 10 ml serologische Pipette und Pipettenpistole und resuspendieren pelletiert Hirnsubstanz in 1 ml der zuvor hergestellten Kollagenase / DNase-I Verdauungsenzyme mit einem P-1000. Legen Sie die 15 ml Zentrifugenröhrchen in ein Reagenzglas Rack und in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min.
  8. Gently zweimal schütteln Sie die Proben während der gesamten Inkubationsdauer durch Schwenken der Röhrchen zur Gewebe Disaggregation erleichtern.
  9. In 6 ml eiskaltem DPBS mit einem 10 ml serologische Pipette in jedes Röhrchen, die Verdauungsenzyme zu verdünnen. Pipette nach oben und unten zu resuspendieren, und filtern Sie die Gesamtvolumina durch sterile 70 & mgr; m Nylon-Mesh-Filter in neue markierte 15 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis.
  10. Spin der Hirnzellsuspension nach unten bei 740 xg (max RCF) für 20 min bei 4 ° C auf eine ErreichungEinzelzellpellet (4B). Nach den 15-ml-Röhrchen aus der Zentrifuge entfernen legen sie auf Eis und erhöhen die Temperatureinstellung an der Zentrifuge bis etwa 21 ° C in Vorbereitung für den nächsten Schritt.
  11. Vollständig den Überstand aus jedem Röhrchen enthaltend Gehirnzellen und zunächst Resuspendieren der Pellets in 1 ml 70% Dichtezentrifugation Medien unter Verwendung eines P-1000-Mikropipette. Dann fügen Sie 4 zusätzliche Milliliter 70% Dichtezentrifugation Medien in jedes Röhrchen mit einem 10 ml serologische Pipette. Schrauben Sie die Kappen auf sicheren und homogenisieren die Zellsuspension durch vorsichtiges Umdrehen mehrmals Rohren.
  12. Die 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die Gehirnzellen in 70% Dichtezentrifugation Medien aus Eis, und in einem Reagenzglas Rack bei RT suspendiert entfernen. Eine zu einem Zeitpunkt, sorgfältig überlagern 2 ml 37% ige Dichte Zentrifugationsmedien Lösung auf die 5 ml 70% Dichtezentrifugation Medien mit einer P-1000-Mikropipette zu bilden acmageren Schnittstelle zwischen den beiden Dichtezentrifugation Medienschichten (4C).
    1. Verwenden Sie einen spitzen Marker, um die Position der Schnittstelle anzuzeigen, so kann es leicht nach der Zentrifugation identifiziert werden, wenn der Unterschied weniger deutlich.
  13. Spin down die 15 ml Zentrifugenröhrchen bei 740 · g (max RCF) für 20 min bei RT ohne Pause, um nicht zu stören die Schnittstelle.
  14. Nach Zentrifugation sammelt die PBMCs an der Schnittstelle zwischen den beiden Dichtezentrifugation Medienschichten (4D) durch die Einführung eines P-200-Mikropipette in das Rohr entlang seiner Seite vorsichtig unter Umgehung der Lipidschicht angesammelt haben.
    1. Einmal auf der Ebene der PBMC Band langsam extrahieren 200 ul von der Oberfläche des 70% Dichtezentrifugation Medienschicht und in einen entsprechend markierten Polypropylen FACS-Röhrchen auf Eis. Einmal wiederholt für ein Gesamtvolumen von 400 ul pro Probe.
  15. 3 ml der Flusspuffer in jede FACS-Röhrchen, enthaltend 400 ul der PBMCs, die Dichte Zentrifugationsmedien ausreichend verdünnt ist, dann drehen die Zellen nach unten bei 660 xg (max RCF) für 20 min bei 4 ° C.

5. Immunmarkierung von Gliom-Infiltration PBMCs

  1. Vor der Analyse keine experimentellen PBMC-Proben, führen Sie einen einzelnen, unabhängigen, Zelloberflächen Isotypkontrolle Experiment zum Ausgangstore zu etablieren, um mit einer Reihe von festen PMT-Spannungen innerhalb einer durchflusszytometrischen Datenanalyse Vorlage für die Beurteilung der Gliom-Infiltration PBMCs gewidmet entsprechend zugeordnet werden dem folgenden Protokoll:
    1. Engraft einer C57BL / 6J-Maus mit GL26-Cit-gal1i und ein weiteres mit GL26-Cit-NT nach dem Verfahren in Abschnitt 2 beschrieben nach 72 h von Tumorwachstum, euthanize Mäusen und Isolieren der tumorinfiltrierenden PBMCs nach den Verfahren gesamten Abschnitte 3 und 4 skizziert.
    2. Kombinieren Sie die zwei PBMC-Proben (NT einnd gal1i) in einem Band (dh 100 ul), dann weiter Probe gleichmäßig aufzuteilen zwischen drei FACS-Röhrchen (dh 33,3 ul pro Röhrchen) mit "CD45 Isotyp", "Gr-1 / CD11b Isotyp" und "NK1. 1 Isotyp ". Fügen Sie folgende Antikörper (jeweils in einer 1: 100 Verdünnung und verdünnt, um ein Gesamtvolumen von 200 ul in Fließpuffer) zu den jeweils markierten FACS-Röhrchen: "CD45 Isotyp": Alexa Fluor 700-konjugiertes Ratte-IgG2b, κ (Klon: RTK4530 ); "Gr-1 / CD11b Isotyp": Alexa Fluor 700-konjugiertes Ratte-anti-Maus-CD45 (Klon: 30-F11), PE-konjugiertem Ratten-IgG2b, κ (Klon: eB149 / 10H5) und PerCP / Cy5.5 -konjugierten Ratten IgG2b, κ (Klon: RTK4530); "NK1.1 Isotyp": Alexa Fluor 700-konjugiertes Ratte-anti-Maus-CD45 (Klon: 30-F11), PE-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-Gr-1 (Klon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD11b (Klon M1 / ​​70) und APC-conjugated Maus-IgG2a, κ (Klon: eBM2a).
    3. Ermöglichen PBMCs auf Eis im Dunkeln für 20 min immunolabel. Flick die Schläuche einmal der Hälfte der Inkubationszeit zu vorsichtig mischen. Mit 1 ml Fließpuffer waschen, Spin-down bei 660 · g (max RCF) für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren jedes FACS Röhrchen mit PBMCs mit 200 ul Fließpuffer.
    4. Mit einem Durchflusszytometer mit einer 85 um integrierte Düse ausgestattet ist, analysieren den "CD45 Isotyp" tube ersten um eine Grundlinie CD45 Intervall Gate herzustellen. Als nächstes führen Sie die "Gr-1 / CD11b Isotyp" Rohr um eine Grundlinie Gr-1 / CD11b Quadranten Gate mit nur wahre CD45 + Zellen als Eingang zu schaffen. Schließlich führen Sie den "NK1.1 Isotyp" Rohr um eine Grundlinie NK1.1 Intervall Gate zu schaffen mit nur wahre CD45 + / Gr-1 low / CD11b +/- Zellen als Eingabe.
  2. Mit dem folgenden Verfahren für alle zukünftigen experimentellen einalysis:
    1. Stellen eine ausreichende Menge eines 1: 100-Verdünnung von Zelloberflächenantikörper in Fließpuffer zu einer 200 ul-Volumen pro Probe (plus 1 für die GzmB Isotyp) erzielen: Alexa Fluor 700-konjugiertes Ratte-anti-Maus-CD45 (Klon: 30-F11 ), PE-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-Gr-1 (Klon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD11b (Klon M1 / ​​70), APC-konjugiertem Maus-anti-Maus-NK1.1 (Klon: PK136).
    2. Der Überstand der abzentrifugiert PBMCs vorsichtig aus 4.15 bis der Meniskus ist knapp über dem Boden jeder FACS-Röhrchen (~ 50 & mgr; l), um Zellverluste zu vermeiden. Resuspendieren der PBMCs in jedem FACS-Röhrchen unter Verwendung der Restwassermenge Puffer mit einem P-200-Mikropipette und entfernen (1 / Anzahl der Proben) im Wert des Volumens von jeder FACS Rohr und verbinden sich zu einem neuen FACS-Röhrchen mit der Aufschrift "gepoolt Isotyp".
    3. Fügen Sie 200 ul der Zelloberfläche Antikörper-Cocktail in 5.2.1 zu jedem PBMC Probe hergestellt. Ermöglichen PBMCs auf Eis im Dunkeln für 20 min immunolabel. Flick ter Rohren einmal der Hälfte der Inkubationszeit zu vorsichtig mischen.
    4. Waschen mit 1 ml Flow-Puffer; Spindown bei 660 · g (max RCF) x 10 min bei 4 ° C.
    5. Resuspendieren alle FACS Röhrchen, die PBMCs in 200 & mgr; l eines handelsüblichen Formalin-basierte Fixiermittel (siehe Materialliste für Details) für 15 Minuten auf Eis im Dunkeln. Flick die Schläuche einmal der Hälfte der Inkubationszeit zu vorsichtig mischen.
    6. Waschen mit 1 ml eines handelsüblichen 1x Permeabilisierung / Waschpuffer (siehe Materialliste für Details) und Spin-down bei 660 · g (max RCF) für 10 min bei 4 ° C.
    7. Während PBMCs sind zum Stillstand kommen, bereiten eine ausreichende Menge einer 1: 100 Verdünnung von Pacific Blue-konjugierten Maus-anti-Maus-GzmB (Klon: GB11) intrazelluläre Antikörper in 1x Permeabilisierung / Waschpuffer zu einer 200 & mgr; l Volumen je Probe zu erzielen.
    8. In einem separaten Röhrchen, bereiten ein einziges 200 ul Volumen einer 1: 100 Verdünnung von Pacific Blue-conkonjugierten Maus-IgG1, κ (Klon: MOPC-21) Isotypkontrollantikörper.
    9. Resuspendieren jeder der experimentellen PBMC-Proben mit 200 ul der 1: 100-Verdünnung von Anti-Maus-Antikörper und GzmB resuspendieren einzigen FACS-Röhrchen mit 200 ul Volumen der 1 mit der Bezeichnung "gepoolt Isotyp": 100 Verdünnung Isotyp Antikörpern.
    10. Lassen Sie alle PBMC-Proben auf Eis im Dunkeln für 20 min immunolabel. Flick die Schläuche einmal der Hälfte der Inkubationszeit zu vorsichtig mischen.
    11. Waschen mit 1 ml Flow-Puffer; Spin-down bei 660 xg (max RCF) für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren PBMCs mit 200 ul Fließpuffer für die Analyse.
    12. Durchflusszytometrisch analysiert Gliom-Infiltration PBMCs unter Verwendung eines 85 um integrierte Düse und die Tore und PMT-Spannungen zuvor in Abschnitt 5.1 22 etabliert. Achten Sie darauf, das gesamte Volumen jeder Probe auf die Strömung laufen Zytometer um einen fairen Vergleich der Gesamtzahl der Gliom-infilt sicherzustellen,Bewertung PBMCs in jeder Probe.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die folgende Gating-Strategie für ein typisches Experiment verwendet: FSC-A vs. SSC-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. Zahl → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. Count. Tore mit auf Gr-1 + / CD11b + myeloiden Zellen und NK1.1 + NK-Zellen werden dann auf schichtet GzmB Ausdruck (5A) beruht. Backgating diese Zellen als NK1.1 + NK-Zellen und Gr-1 + / CD11b + myeloischen Zellen in unseren Experimenten auf FSC-A vs. SSC-A den kleineren ly...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse PBMCs, die die frühe Mausgehirn-Tumor-Mikroumgebung infiltriert haben. Gliom Zellsuspensionen werden in einem vom Experimentator, die stereotaktisch in das Striatum des Gehirns der Maus eingepflanzt werden festgelegte Wert generiert. Mäuse werden dann in vorgegebenen von der Versuchsplanung festgelegten Zeitpunkten getötet und ihre Gehirne werden geerntet und verarbeitet, um Gliom-Infiltration PBMCs, die m...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health / Nationale Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NIH / NINDS) gewährt R01-NS074387, R01-NS057711 und R21-NS091555 zu MGC unterstützt; NIH / NINDS gewährt R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 und R21-NS084275 zu PRL; Zuschüsse aus Leas Happy Hearts, University of Michigan Comprehensive Cancer Center an MGC und PRL vergeben; die Klinik für Neurochirurgie, Universität von Michigan School of Medicine; der Michigan-Institut für klinische und Gesundheitsforschung, die von NIH Zuschusses 2UL1-TR000433 unterstützt; die Universität von Michigan Cancer Biology Ausbildungsbeihilfe von NIH / NCI (National Cancer Institute) Zuschuss T32-CA009676 unterstützt; die Universität von Michigan Ausbildung in klinischer und Grundneuroscience von NIH / NINDS unterstützt gewähren T32-NS007222; und der University of Michigan Medical Scientist Training Program von NIH / NIGMS (Nationales Institut für Allgemeinmedizin Wissenschaften) unterstützt gewähren T32-GM007863. Die Autoren einre dankbar für die akademische Führung und Unterstützung von Dr. Karin Muraszko und der Klinik für Neurochirurgie erhalten; M. Dahlgren, D. TOMFORD und S. neapolitanischen für hervorragende administrative Unterstützung; M. Dzaman für herausragende technische Hilfe; und Phil F. Jenkins für die großzügige Unterstützung für den Kauf eines Zeiss 3D Scanning Electron Microscope. Wir erkennen auch die Kuchroo Labor an der Harvard Medical School, von dem eine modifizierte Version des Dichtezentrifugation Medien vermittelte Strategie für die Isolierung von Gehirnmononuklearen Zellen gezogen wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco' s Modifikation von Eagles MediumGibco12430-054mit 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin, 25 mM HEPES und Phenolrot
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Gibco14190-144 ohne Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid
Fötales RinderserumOmega Scientific Inc.FB-11
Penicillin Streptomycin Gibco15140-12210.000 U/ml Penicillin; 10.000 μm; g/ml Streptomycin 
L-GlutaminGibco25030-081200 mM
G418 Sulfat Omega Scientific Inc.GN-04
Puromycin-Dihydrochlorid  Sigma-AldrichP8833aus Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase nicht-säugetierfreie Trypsin-Alternative Thermo ScientificSV30030.01in DPBS mit EDTA 
Phasenkontrast-HämozytometerSigma-AldrichZ3596290,1 mm tiefe
Trypanblau-FärbungGibco15250-061
Sterile 0,9 % NaCl-Injektion, USPHospiraNDC: 0409-488810 ml Fläschchen
0,6 ml konische Polypropylenämie-MikroröhrchenGenesee Scientific22-272
Atipamezolhydrochlorid-InjektionOrion PharmaNDC: 52483-62985 mg/ml Lösung
Ketaminhydrochlorid InjektionFort DodgeNDC: 0409-2051100 mg/ml Lösung
Dexmedetomidin Hydrochlorid InjektionZoetisNDC: 54771-28050,5 mg/ml Lösung
Xylazinhydrochlorid InjektionLloydNDC: 61311-481100 mg/ml Lösung
Carprofen InjektionPfizerNDC: 61106-850150 mg/ml Lösung
Buprenorphin Hydrochlorid InjektionReckitt BenckiserNDC: 12496-07570,3 mg/ml Ampullen
1 ml TuberkulinspritzenCovidien8881501400
26G x ½ (0,45 mm x 13 mm) Spritzennadeln BD305111
Chirurgische Schermaschine3M9661
Providon-Jod-LösungAplicare82-217NDC: 52380-1905
Sterile Vaseline Augensalbe DechraNDC: 17033-211
70% Isopropylalkohol VorbereitungspadsKendall6818
SterileGaze Covidien8044Vlies, 4" x 4", 4-lagig 
1,7 ml konische Mikroröhrchen aus PolypropylenGenesee Scientific22-281
Maus stereotaktischer RahmenStoelting51730
OP-LampePhilips BurtonCS316WCoolspot II Variabler Scheinwerfer
Gebogene PräparierzangeTed Pella Inc.5431
Colibri Retraktoren FST17000-03
Akku-Präzisions-BohrmaschineDremel 1100-01Stylus-Modell; 7,2 Volt Lithium-Ionen mit Dockingstation
GravierschneiderDremel1051/32" oder 0,8 mm
Bitdurchmesser MikroliterspritzeHamilton75Hamilton Mikroliterspritzen 700 Serie; 5 μ l Volumen
Mikroliter SpritzennadelnHamilton7762-0633 G, kleine Nabe RN NDL, 1,5 Zoll, Point Style 3, 6/PK
Ethilon 3-0 schwarz monofile Nylon-Nähte Ethicon1663
MagnetrührstäbchenVWR74950-2967,9 mm Durchmesser x 50 mm Länge (5/16" Durchmesser x 2" Länge)
1 L Vorratsflasche aus Glas mit SchraubverschlussCorning1395Typ 1, Klasse A Borosilikatglas
Heparin Natrium AgentNDC: 25021-4001.000 U/ml Lösung
Schlauchpumpe Cole Parmer Instruments Group77200-60Master Flex Easy Load II Konsolenantrieb
komprimierter Carbogen (95% O2 / 5% CO2)erhältlich vom lokalen AnbieterN/AA-Typ, großer Zylinder
20 G x 1 & frac12; " Aluminiumnabe stumpfe NadelnKendall88812023630,9 mm x 38,1 mm
Polyurethan EiskübelFisherbrand02-591-45Kapazität: 0,152 oz. (4,5 l)
Kollagenase (Typ I-S)Sigma AldrichC1639aus Clostridium histolyticum 
Desoxyribonuklease IWorthington Biochemical Corp.LS002007>2.000 Kunitz-Einheiten pro mg Trockengewicht
Antistatische sechseckige Wägeschalen aus PolystyrolTed Pella Inc.20157-3obere ID 115 mm, Basis-ID 85 mm, 203 ml Volumen 
Einschneidige Rasierklingen aus rostfreiem StahlGarvey40475
KnochenrongeursFST16001-15
HämostatFST13014-14
Große PräparierschereTed Pella Inc.1316
Kleine PräparierschereFST14094-11
Zange mit stumpfem EndeTed Pella Inc.13250
7 ml Glas Dounce GewebeschleiferKontesKT885300-0007
Percoll Dichte-Zentrifugationsmedien GE HealthcareGE17-0891-01
10 ml serologische PipettenGenesee Scientific12-104zum Einmalgebrauch; steril
70 μ M sterile Zellsiebe aus Nylonnetz Fisherbrand22363548
Alexa Fluor 700-konjugierte Anti-Maus CD45 (Klon: 30-F11)Biolegend103128
APC-konjugierte Maus Anti-Maus NK1.1 (Klon: PK136)eBiosciences 17-5941-82
PE-konjugierte Ratten-Anti-Maus Gr-1 (Klon: RB6-8C5)BD Pharmigen553128
PerCP/Cy5.5-konjugierte Ratten-Anti-Maus-CD11b (Klon: M1/70)Biolegend101228
Alexa Fluor 700-konjugierte Ratte IgG2b, κ (Klon: RTK4530) Isotyp-Steuerung Biolegend400628
APC-konjugierte Maus IgG2a, κ (Klon: eBM2a) Isotyp-Kontrolle eBioscience17-4724
PE-konjugierte Ratte IgG2b, κ (Klon: eB149/10H5) Isotyp-Kontrolle eBioscience12-4031-82
PerCP/Cy5.5-konjugiertes Ratten-IgG2b, κ (Klon: RTK4530) IsotypkontrolleBiolegend400632
Pacific Blue-konjugiertes Maus-Anti-Maus-Granzym B (Klon: GB11) Biolegende515403
Pacific Blue-konjugierte Maus IgG1, κ (Klon: MOPC-21) Isotyp-Kontrolle Biolegend400151
Cytofix/CytopermBD554714
15 ml Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenGenesee Scientific21-103mit konischem Boden
50 ml Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenGenesee Scientific21-108konischem Boden
12 mm x 75 mm mit rundem Boden FACS Röhrchen aus Polypropylen  Fisherbrand14-956-1B
FACSAria Sonderauftrag Forschung Produkt Durchflusszytometer/ZellsortiererBD 
Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse IISG603von The Baker Company: SterilGARD III Advance
mit 650033 Modell

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
  3. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
  4. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  5. Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912(2013).
  6. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
  7. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
  8. Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
  9. Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
  10. Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
  11. El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
  12. Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
  13. Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10(2009).
  14. Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
  15. Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
  16. Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
  17. Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983(2008).
  18. Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
  19. Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
  20. Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
  21. Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
  22. Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
  23. Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
  24. Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528(2013).
  25. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
  26. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
  27. Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
  28. Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
  29. de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
  30. Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
  31. Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
  32. Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).

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