Magnetisches Wechselfeld-Responsive Hybrid Gelatine Mikrogele der gezielten Medikamentenapplikation

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine einfache Methode, um eine biologisch abbaubare Gelatine-basierte Wirkstofffreisetzung Plattform herzustellen, die magneto-thermisch anspricht. Dies wurde durch den Einbau von superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel und Poly (N-isopropylacrylamide- co -acrylamid) innerhalb eines kugelförmigen Gelatinemikro Netzwerk von Genipin, System in Verbindung mit einem magnetischen Wechselfeld Anwendung vernetzt erreicht.

Zusammenfassung

Magnetisch reagierende Nano / Mikro-engineered Biomaterialien, die eine streng kontrolliert, On-Demand-Arzneimittelabgabe ermöglichen wurden als neue Arten von Smart Soft Geräte für biomedizinische Anwendungen entwickelt. Obwohl eine Reihe von magnetisch ansprechenden Arzneimittelabgabesysteme Wirksamkeiten entweder durch in vitro Nachweis der Konzeptstudien oder in vivo präklinischen Anwendungen gezeigt haben, im klinischen Umfeld ihre Verwendung ist durch ihre unzureichende biologische Abbaubarkeit oder Biokompatibilität noch begrenzt. Darüber hinaus verlassen sich viele der bestehenden Plattformen, auf ausgeklügelte Techniken für ihre Erfindungen. Wir haben kürzlich gezeigt, die Herstellung von biologisch abbaubaren, auf Gelatinebasis thermo-responsive Mikrogel durch physikalisches Poly (N-isopropylacrylamide- co -acrylamid) -Ketten als Nebenkomponente in einem dreidimensionalen Netzwerk Gelatine Einschließen. In dieser Studie stellen wir ein einfaches Verfahren ein biologisch abbaubares Wirkstofffreisetzung Plattform herzustellen, die eine magneto-T ermöglichthermally ausgelöst Wirkstofffreisetzung. Dies wurde durch den Einbau von superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel und thermo-responsive Polymere innerhalb Gelatine basierenden kolloidalen Mikrogele, in Verbindung mit einem magnetischen Wechselfeld Applikationssystem erreicht.

Einleitung

Stimuliresponsive Drug-Delivery-Systeme, die eine streng kontrollierte Medikamentenabgabe als Reaktion auf entweder endogener oder exogener Reize (z. B. Temperatur oder pH-Wert) ermöglicht wurden als neue Arten von Smart Soft Geräte zur Arzneimittelabgabe umfassend untersucht. Microscale Hydrogele sind als Drug-Delivery-Plattform in sehr beschäftigt, dass sie verleihen steuerbar und nachhaltige Arzneimittelfreisetzungsprofile sowie abstimmbaren chemischen und mechanischen Eigenschaften ^1-3. Insbesondere zeigen die kolloidalen Mikrogele viele Vorteile als Vehikel zur Arzneimittelabgabe aufgrund ihrer schnellen Reaktionsfähigkeit auf äußere Reize und geeignet Injizierbarkeit zu lokalen Gewebe in einem minimal-invasive Art und Weise ^4. Die Poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAM) oder deren Copolymere sind durch Pfropfen pNIPAM mit biologisch abbaubaren / biologisch verträglichen Polymeren, einschließlich Gelatine, Chitosan, Alginat Säure oder Hyaluronsäure bei der Synthese thermo-responsive Mikrogele weithin angenommen wurde ^5,6Bei dem eine Phasenübergangscharakteristik pNIPAM an seinem unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) als Auslöser der Arzneimittelfreisetzung ⁷ verwendet werden. Wir haben kürzlich gezeigt, eine Herstellung von biologisch abbaubaren, auf Gelatinebasis thermo-responsive Mikrogel durch Poly (N-isopropylacrylamide- co -acrylamid) [p (NIPAM- co -AAm)] Ketten als eine Nebenkomponente in dreidimensionale Netzwerke Gelatine ⁸ enthält. Die Gelatine / p (NIPAM- co -AAm) Mikrogel einen abstimmbaren Entquellung zu Temperaturanstieg zeigten, die zur Freisetzung von Rinderserumalbumin (BSA) positiv korreliert.

Während der letzten Jahre gab es Bemühungen zugenommen eine magnetisch reagierende Drug-Delivery-Plattform zu entwickeln, die die Freisetzung des Arzneimittels in einem On-Demand-Mode ^9,10 auslösen können. Das Grundprinzip für die Synthese von magnetisch ansprechenden Arzneimittelabgabeplattform nutzt die Eigenschaft von superparamagnetischen Nanopartikel (MNP) Wärme zu erzeugen, wenn sie eine Hochfrequenz-Wechselmagnetfeld (AMF) erhalten, die eine temperaturempfindliche Wirkstofffreisetzung auslöst. Dies hält Versprechen für zukünftige klinische Anwendungen, da dieses System tief in das Zielgewebe kann, ermöglicht eine nicht-invasive und fernWirkstoffFreisetzung gesteuert und kann mit Hyperthermiebehandlung und Magnetresonanz-Bildgebungssystem ^10-12 kombiniert werden. Solche Plattformen sind: (1) MNPs / pNIPAM Hybrid Mikrogelteilchen ^13-15 und (2) makroskopischen Hydrogel Gerüste immobilisiert MNPs ^16-18 enthält. Die pNIPAM basierte Mikrogel Plattformen zeigte eine fein abstimmbaren Volumenphasenübergangsreaktionsfähigkeit auf magneto-thermische Reize. Allerdings setzen sie noch auf komplexe und anspruchsvolle Techniken bei der Herstellung und der Verwendung von pNIPAM Polymere mit einem hohen Gehalt kann potentiell an Zellen ¹⁹ zytotoxisch werden, die ihre in vivo-Anwendungen einschränken. Die makroskopischen Gerüste weisen eine relativlangsame Reaktion ly auf äußere Reize und erfordern eine invasive chirurgische Transplantation im Vergleich zu kolloidalen Mikrogele.

Die Wasser-in-Öl-Emulsion ist die Standardmethode gewesen Submillimeter oder mikrometergroße Gel zu produzieren ²⁰ Teilchen. An der Wasser-Öl-Grenzfläche der Emulsion bildet Mikrogel Teilchen eine Kugelform aufgrund der Minimierung der Oberflächenenergie des Wassertropfens unter mechanischer Scherkraft. Dieses Verfahren erlaubt die Herstellung einer großen Menge an wässriger kugelförmige Gel-Tröpfchen in einem einfachen Herstellungsverfahren und wurde für die Herstellung von Gelatinebasis Mikrogele zur Arzneimittelabgabe-Anwendungen ^21-23 erfolgreich angenommen.

Hier präsentieren wir eine einfache Methode, um eine magnetothermally reagiert auf Gelatinebasis Mikrogele für Drug-Delivery-Anwendung zu synthetisieren, indem das Wasser-in-Öl-Emulsionsverfahren verwendet. Dies wurde durch physisch enthalten Eisenoxid MNPs und p (NIPAM- Co erreicht -AAm) -Ketten als Nebenkomponente in einem kugelförmigen Mikro Gelatine Netzwerk, das kovalent durch eine natürlich abgeleitete Vernetzungsmittel Genipin vernetzt ist, in Verbindung mit einem Hochfrequenz-Wechselmagnetfeld (AMF) Anwendungssystem.

Protokoll

Hinweis: Der Gesamtprozess der Magnetfeld-responsive Gelatine Mikrogele Herstellung ist in 1A dargestellt.

1. Vorbereiten Lösungen und Suspensionen

1. Vorbereiten eines Vernetzers Genipin (1% w / v) Lösung von 20 mg von Genipin Auflösen in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS; pH 7,4). Vortex die Lösung und in eine ^{50 °} C-Wasserbad für 2 h bis die Lösung vollständig auflösen.
2. Bereiten einer Tensidlösung um 20 mg Poly (ethylenglykol) Auflösen -Poly (propylenglykol) -Poly (ethylenglykol) (M _{w =} 2900 Da; bezeichnet als L64) in 200 ml PBS bei einer Konzentration von 100 bis sein ppm.
3. Vorbereiten eines 15% (w / v) Gelatine-Lösung von 64,5 mg Gelatine in 0,43 ml PBS gelöst wird. Vortex die Lösung und legen Sie es auf Wasserbad bei 37 ^{° C,} bis sie einen Sol-Phase erreicht, wo die Lösung wird fluidischen. Dann, Strudel der Gelatinelösung 2 - 3 mal ten, um sicherzustellen,e Homogenität der Probe.
4. Herstellung von p (NIPAM- Co -AAm) / MNP-Lösung mit einem Modellarzneistoff (BSA):
   1. Disperse 10,75 mg hydrophiler MNPs in 0,43 ml PBS und dann lösen sich 12,9 mg von p (NIPAM- zusammen -AAm) in dem MNP-Suspension, um die Konzentration von 3% machen (w / v). Die erhöhte Konzentration von p (NIPAM- -AAm CO) kann eine erhöhte Entquellung Verhalten von Mikrogelen zu erreichen verwendet werden.
   2. Verwenden Sie Texas-Rot konjugierten Rinderserumalbumin (TR-BSA; _{M w} ~ 66 kDa) als Modell Droge. Man löst 0,5 mg des TR-BSA in der Mischung von P (NIPAM- zusammen -AAm) / MNPs.
5. Bereiten Mischungen von Gelatine / p (NIPAM- co -AAm) / MNPs / BSA-Lösung (0,86 ml) durch Zugabe von Gemisch aus p (NIPAM- co -AAm) / MNPs (0,43 ml) in die Gelatine-Lösung (0,43 ml) und dann gründlich sie vortexen eine homogene Mischung zu bilden. Somit werden die Konzentrationen von Polymeren und MNP Hälfte der Anfangskonzentration in der Endmischung.

2. Emulgieren

1. Gießen Sie 15 ml Silikonöl [Polydimethylsiloxan (Viskosität 350 cSt)] in einen sauberen und sterilen Becher.
2. Schnell in die vorbereitete wässrige Mischungen von Gelatine / p (NIPAM- co -AAm) / MNPs / BSA-Lösung (0,86 ml) in das Silikonöl und Emulgieren der wässrigen Mischung in der Ölphase um 900 mit einem magnetischen Rührstab gerührt rpm bei 30 ^o C für 30 min.

3. Gelieren und Transfer von Mikrotröpfchen zu einer wässrigen Lösung

1. Übertragen der Emulsion (~ 16 ml) von Becherglas in ein 50 ml Röhrchen.
2. Abkühlen der Röhrchen 10 min bei 4 ° C zum Gelieren der Mikrotröpfchen in der Öl.
3. Das Rohr wird mit der vorbereiteten L64-Lösung (bei ​​4 ^{° C)} bis zu 50 ml und kräftig schütteln, um das Rohr. Es kann möglich sein, dass ein Teil L64 Tenside innerhalb der Mikrogele wäre.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 20 Minuten bei 2300 × g bei ^{4 °} C
5. Regularly überprüfen auf die Anwesenheit des Pellets von Gelteilchen auf der Seite des Rohres. Wenn die Teilchen nicht zu sehen sind, zentrifugieren für weitere 20 min bei der gleichen Geschwindigkeit und Temperatur. Verfahren sorgfältig Überstand zu entfernen, ohne das Pellet an der Innenwand des Rohres gebildet stören.
6. Wiederholen Sie die Schritte (3.3) bis (3.5) noch einmal. Jedes Mal, übertragen Sie die Probe in ein neues Röhrchen die Aufnahme eines Öltröpfchen in der Mikrogel-Suspension zu vermeiden. Nach diesem Schritt zu gewährleisten, daß Tenside oder Öltröpfchen in der Probensuspension nicht vorhanden. Jedoch können die wiederholte Trennungsschritte zum Verlust der Ausgangsmaterialien führen.

4. Die kovalente Vernetzung der Mikrogele

1. 2 ml Genipin Lösung (hergestellt in Abschnitt 1) ​​zu dem Pellet von Gelteilchen und mischen sie gut durch die Lösung verwirbelt.
2. Schnell überweisen Sie den Schlauch der Suspension im Wasserbad bei 23 ^{° C} eine kovalente Vernetzungsreaktion während einer des zu initiieren(. B. 5 bis 120 min) IRED Vernetzungszeit.
3. Nach der Vernetzung unverzüglich entfernen übermäßige Vernetzer durch die Genipin Lösung verwerfen, Resuspendieren der Mikrogele in PBS und Zentrifugieren der Röhrchen für 20 Minuten bei 2300 × g (4 ^{° C).} Wenn nötig, vorsichtig auseinander brechen Pellet mit einer Pipettenspitze gebildet. Dieser Waschschritt kann bis zu 3-mal wiederholt werden, wenn die Genipin noch in der Lösung verbleibt.
4. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Mikrogele in PBS in einer gewünschten Dichte (z. B. 5 × 10 ⁶ Mikrogele / ml) durch die Anzahl mit einem Hämocytometer gezählt.
5. Zur mikroskopischen Beobachtungen, legen Sie das Mikrogel-Suspension in den Raum zwischen einem Objektträger und einem Deckglas und Dichtung die Grenze des Deckglases mit Epoxidharz.

5. Anwendung der magnetischen Wechselfeld für die Auslösung der Arzneimittelfreisetzung

1. Das Röhrchen mit der gewünschten Konzentration der Mikrogele in wässrigen Mediendie Kammer von Magnetspulen. Falls erforderlich, legen Sie eine faseroptische Temperatursonde in das Rohr Temperaturänderung der Medien während der Anwendung von AMF zu überwachen.
2. Anwenden hoher Frequenz (> 100 kHz) AMF an einer definierten Feldstärke (> 5 kA / m) und für eine bestimmte Dauer. Nach dem Aufbringen der AMF, Zentrifuge das Probenröhrchen 20 min bei 2.273 × g (4 ^{° C)} und sammle den Überstand die Menge der TR-BSA aus Mikrogel zu den umgebenden Medien freigesetzt zu quantifizieren Spektrophotometrie verwendet wird. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen für Texas Rot sind 584 nm und 612 nm.

Ergebnisse

Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollten die hergestellten Mikrogele zeigen eine gut charakterisierten sphärischen Morphologie und kolloidalen Dispergierbarkeit mit Durchmessern im Bereich zwischen 5 um bis 20 um (1B und C). Entweder fluoreszierenden MNPs oder fluoreszierende BSA kann verwendet werden, um zu bestätigen, ob MNP oder Drogen (BSA in dieser Studie) innerhalb des Mikrogels richtig verkapselt (1D). Die hergestellten Mikrogele kann...

Diskussion

Die hier beschriebene Technik veranschaulicht ein Proof of Concept für die Verwendung von Nanopartikel-Mikrogel Hybriden für magneto-thermisch ausgelöste Medikamentenfreisetzung. Dies wurde durch physikalisches Einschließen MNPs und p (NIPAM- co -AAm) Ketten innerhalb einer Mikro dreidimensionalen Netzwerk vernetzt Gelatine durch Genipin erreicht. Das Magnetfeld ansprechenden Plattform war ausreichend Wärme innerhalb des Mikrogels in Antwort auf ein fern angewendet AMF zu erzeugen, was wiederum die Freigabe ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gelatine	Sigma-Aldrich, MO, USA	G2500	Gelatine Typ A,
Poly(N-isopropylacrylamid-co-acrylamid)	Sigma-Aldrich, MO, USA	738727	MW = 20.000, LCST = 34 - 38 ° C
Silikonöl	Sigma-Aldrich, MO, USA	378372	Viskosität 350 cSt
Pluoronic L64	Sigma-Aldrich, MO, USA	435449	Poly(ethylenglykol)-block-poly(propylenglykol)-block-poly(ethylenglykol)
genipin	TimTec LLC, DE, USA		ST080860 MW = 226,23
Magnetische Nanopartikel (MNPs)	Micromod Inc, Deutschland	79-00-102	nanomag-D-spio, 100 nm
TR-BSA	Life Technologies, NY USA	A23017	Albumin aus Rinderserum (BSA), Texas Rotes Konjugat