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Methodenartikel

Hochempfindliches Verfahren zur Messung von Arenavirus-Zell-Anlage

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DOI:

10.3791/53682

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2. März 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der erste Schritt im Lebenszyklus des Arenavirus ist die Anheftung von Viruspartikeln an Wirtszellen. Wir berichten über einen quantitativen (q)RT-PCR-basierten Assay für den ultrasensitiven Nachweis und die Quantifizierung von Arenavirus-Attachment-Ereignissen.

Zusammenfassung

Arenaviren sind eine Familie von behüllten RNA-Viren, die beim Menschen schwere Krankheiten verursachen. Der erste Schritt im Lebenszyklus des Arenavirus ist die Anheftung von Viruspartikeln an die Wirtszellen. Während die Viruszellanhaftung durch die Verwendung von Virionen gemessen werden kann, die mit Biotin, radioaktiven Isotopen oder Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, erfordern diese Ansätze in der Regel eine hohe Infektionsvielfalt (MOI), um den Nachweis des gebundenen Virus zu ermöglichen. Wir beschreiben einen quantitativen (q)RT-PCR-basierten Assay, der die Bindung an den Junin-Virusstamm Candid 1 durch Quantifizierung von virionverpackter viraler genomischer RNA misst. Dieser Assay hat mehrere Vorteile, darunter seine extreme Empfindlichkeit und die Fähigkeit, die Bindung über einen großen dynamischen Bereich von MOIs zu messen, ohne dass das Eingangsvirus aufgereinigt oder markiert werden muss. Wichtig ist, dass dieser Ansatz durch die Verwendung von virusspezifischen qRT-PCR-Reagenzien leicht auf die Verwendung mit anderen Viren zugeschnitten werden kann. Darüber hinaus kann dieser Assay modifiziert werden, um die Messung der Partikelendozytose und die Enthüllung des Genoms zu ermöglichen. Zusammenfassend beschreiben wir einen einfachen, aber robusten Assay zur hochsensitiven Messung der Arenavirus-Zell-Adhäsion.

Einleitung

Arenaviren sind eine Familie von umhüllten, einzelsträngige RNA - Viren , die in erster Linie bei Nagern in der Natur 1-3 gehalten werden. Während diese Viren normalerweise asymptomatisch, persistierende Infektion in Nagetierreservoirs 1,2 etablieren, können sie schwere Krankheiten verursachen beim Menschen 3. Wichtige pathogene Arten gehören die Neue Welt Junin - Virus (JUNV) 4 und die Alte Welt Lassa - Virus 5, die die Erreger der argentinischen hämorrhagisches Fieber in Südamerika und Lassa - Fieber in Afrika sind, beziehungsweise. Lymphatische choriomeningitis Virus (LCMV), das prototypische Virus der Familie 6, hat eine weltweite Verbreitung und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheitszuständen einschließlich aseptischer Meningitis bei immunkompetenten Personen 6, schwere Geburtsschäden in den sich entwickelnden Fötus 7 oder hohe Letalität bei immunsupprimierten Einzelpersonen folgende Festorgantransplantation 8,9. Der Mangel an USAFood and Drug Administration (FDA) -genehmigte Impfstoffe oder wirksame Virostatika diese Viren unterstreicht die kritische Notwendigkeit zur Bekämpfung neuer Strategien zur Entwicklung therapeutisch diese neuen / wieder auftretender Krankheitserreger zu zielen.

Die Arenavirus - Genom besteht aus zwei einzelsträngigen RNA - Segmente, die große (L) (~ 7,2 kb) und klein (S) (~ 3,6 kb) Segmente 10. Das S-Segment codiert, das virale Nukleoprotein (NP) und Hüll-Glycoprotein (GP) während der L-Segment die virale Polymerase (L) und Matrixprotein (Z) kodiert. Die L- und S - genomischen RNA - Segmente (vRNAs) in Virionen verpackt 10-12. Der erste Schritt der Arenavirus - Infektion ist Anlagerung von viralen Partikeln Zellen durch eine Wechselwirkung zwischen dem viralen GP und der entsprechenden Wirtszellrezeptoren für JUNV, die Host, den menschlichen Transferrin - Rezeptor 1 (hTfR1) 13,14 enthält. Nach Befestigung werden JUNV Partikel in die Zelle über Endozytose 15 Clathrin-vermittelte genommen.Partikel dann Verkehr zu den späten Endosomen , wo der niedrige pH - Wert dieses Fach die Aktivierung von GP 16,17 auslöst. Einmal aktiviert, die GP-kodierte Fusionspeptid Einsätze in die endosomale Membran, die Einleitung Fusion zwischen den viralen und endosomalen Membranen. Erfolgreiche Fusion führt zur Freisetzung der Virionen verpackten vRNAs in das Zytoplasma, wo sie als Vorlagen für die genomischen Replikation und Transkription dienen. Wenn ausreichende Mengen an viralen Strukturproteine ​​und vRNAs erzeugt werden, neue Teilchen zusammenstellen und Knospe aus der infizierten Zelle 18 , um den Lebenszyklus zu vollenden .

Um die Entdeckung neuer Strategien erleichtern, um therapeutisch die pathogenen Arenaviren Ziel hat sich unsere Gruppe auf die Identifizierung von Wirtsfaktoren konzentriert, die für die Virusvermehrung von entscheidender Bedeutung sind, aber entbehrlich für den Host. In diesem Zusammenhang die genaue Stadium der Definition (en) des Zyklus viralen Lebens durch solche Wirtsfaktoren gesteuert ist notwendig, die FührungEntwicklung von antivirale Strategien. Hier beschreiben wir eine quantitative (q) RT-PCR-basierten Assays , die verwendet werden können , Arenavirus-Zellanheftung zur Messung zur Identifizierung , ob ausgewählte Wirtsproteinen und / oder antivirale Moleküle beeinflussen diese Anfangsphase der Viruseintritt 19. Alternative Ansätze Arenavirus-Zell - Bindung zu messen , haben Virionen mit Biotin 20, fluoreszierende Farbstoffe 21, oder radioaktive Isotope 22 markiert gekennzeichnet. Nachteile dieser Verfahren kann das Erfordernis für große Mengen von Eingangs Virus (zB hohe Multiplizität der Infektion (MOI)) umfassen, die Verwendung von Radioaktivität, und / oder zusätzliche Handhabungsschritte Eingangs Virus (zB Konzentration und / oder die Kennzeichnung Virus) vorzubereiten . Insbesondere ermöglicht die Verwendung von hohen MOI es schwierig 15,23 produktiv im Vergleich zu unproduktiven Befestigung Ereignisse zu unterscheiden. Die qRT-PCR-basierte Test hier beschriebene Befestigungs Ereignisse mit so wenig wie 20 Plaque erkennen fürming Einheiten (PFU) des Virus, die für eine 48-Well-Platte in einer MOI von 0,0004 übersetzt. Daher überwindet die starke Empfindlichkeit des Tests die Forderung nach hoher MOI sowie alle Viren Kennzeichnung oder Konzentrationsschritte. Weiterhin kann die Assay sein i) Virion Endozytose sowie Freisetzung des Virusgenoms in das Cytoplasma nach Fusion und ii) angepasst für die Verwendung mit anderen Viren durch die Entwicklung von virusspezifischen qRT-PCR-Reagenzien (Beispiele zu messen angepasst, siehe 24-27).

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Protokoll

Hinweis: Es ist wichtig, dass das beschriebene Protokoll streng Prä-PCR - Technik durchgeführt werden (siehe 28 für einen guten Überblick darüber , wie ein Prä-PCR - Labor einzurichten und wie Experimente durchzuführen gute Pre-PCR - Technik verwendet wird ). Es ist zwingend notwendig, dass alle Reagenzien und Ausrüstung von amplifizierte DNA-frei sind die qPCR Zielsequenz und entsprechende Kontrollen an Ort und Stelle, die solche Kontamination zu erkennen. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Bereiten Sie Medien und Seed-Zellen in 48-Well-Platten

  1. Bereiten 500 ml komplettem Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure) Pufferlösung durch Zugabe von 50 ml Wärme inaktiviertes fötales Rinderserum und jeweils 5 ml eines 100x Penicillin-Streptomycin und 100x HEPES-Pufferlösung auf eine 500 ml Flasche DMEM. Dieses Reagenz kann bei 4 gelagert werden76; C für Monate.
  2. Seed 2,5 x 10 4 Vero E6 - Zellen pro Well in einer 48-Well - Gewebekulturplatte in einem Endvolumen von 500 ul vollständigem DMEM. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 10 bis 18 Stunden.
    1. Samen, die Platte am Ende des Arbeitstages. Testen Sie jede Virusprobe in entweder doppelte oder dreifache Brunnen.
      Anmerkung: Während einer 48-well-basierte Plattform für diesen Test beschrieben wird, sollte es möglich sein, den Test nach unten zur Verwendung in 96- oder 384-Well-Platten zu skalieren.

2. Führen Sie die Virus-Zell-Anlage

Hinweis: das Virus in diesem Protokoll verwendet, Candid JUNV Stamm # 1 (C # 1), wurde als lebende , abgeschwächte Impfstoff zur Prävention von Krankheits JUNV 29 erfolgreich eingesetzt. JUNV C # 1 wurde aus dem virulenten Stamm JUNV XJ durch serielle Passage abgeleitet sowohl in vivo und in vitro und unterscheidet sich von der Eltern XJ - Stamm von 12 Aminosäuren 30. because JUNV C 1 # a Biosicherheitsstufe (BSL) -2-rated Erreger ist, werden die Arbeiten für diesen Abschnitt beschrieben sind, müssen 31 geeignete BSL-2 Praktiken durchgeführt. Dies schließt die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (zB Augenschutz, Laborkittel, doppelte Handschuhe), eine Klasse II Biosicherheitswerkbank, und dafür zu sorgen , dass alle Mitarbeiter der institutionellen Ausbildung und Zulassungen erhalten haben , erforderlich , um sicher zu diesen Organismus behandeln.

  1. Verdünnen Sie die JUNV C # 1 Probe (n) auf die gewünschte PFU getestet werden oder konzentrieren sich bildende Einheiten in eiskaltem komplettem DMEM und lagern auf Eis, bis sie bereit zu jeder Vertiefung hinzuzufügen.
    Anmerkung: Als Alternative können die Bindungsstudien mit Virus Durchführung in komplettem DMEM verdünnt, ein Minimalmedium PBS mit einer reduzierten Serumkonzentration (2%) und einem geeigneten Puffer enthält, verwenden, um festzustellen, ob Serum Interferenz mit Virusanheftung verursachen. Ähnliche Befestigungs Protokolle für alternative Viren haben die Verwendung von RPMI 1640-Medium ohne bicarbo berichtetnate 0,2% Rinderserumalbumin, 10 mM (2- (Morpholino) ethansulfonsäure) enthält, und 10 mM HEPES, pH 6,8 , 32. Diese Bindung Medien kann überlegen sein pH - Änderungen zu verhindern , die auftreten könnten , wenn Medien aus dem CO 2 -Umgebung des Inkubators entfernt wird.
    1. Impfen Brunnen mit PFU von 200 bis 2000 reichen unproduktiven Befestigungs Ereignisse zu begrenzen. Wie in 2 gezeigt, ist dieser Assay zum Nachweis von Befestigungs Lage , so wenig wie 20 PFU (oder so viele wie 2 x 10 & sup6 ; PFU) verwendet wird .
    2. Erstellen Sie einen Master-Mix von Virus zur Impfung auf Zellen. Jede Virusprobe wird auf zwei Vertiefungen in einem Volumen von 50 & mgr; l pro Vertiefung beimpft werden. Deshalb, wenn die Zugabe von 2000 PFU des Virus pro Vertiefung gewünscht wird, verdünnen 4.800 PFU in einem Gesamtvolumen von 120 ul eiskaltem DMEM vervollständigen.
      1. Um zu steuern, für die Spezifität des Assays, verwenden Sie ein passendes Paar von Eizellen des chinesischen Hamsters Zelllinien, die entweder gar nicht ausdrücken TfR1 (TRVb) oder express hTfR1 (TRVb-1) als JUNV Bindung an diese Zellen entweder reduziert werden sollte oder nicht, bzw. 13,33. Alternativ behandeln Zellen mit einer Protease wie Proteinase K 35 Arenavirus Befestigung 34 oder Eintrag zu verhindern. Soluble hTfR1 oder monocolonal Antikörper ch128.1, die für hTfR1 spezifisch ist, auch in Betracht gezogen werden könnten , da sie bekannt sind 13,36 Eintritt von JUNV in Zellen zu blockieren. Zusätzlich Vorbehandlung von Zellen mit freiem Mannose 14 oder Inkubation von Partikeln mit JUNV spezifische neutralisierende Antikörper 37 kann das Eindringen von Viren hemmen.
      2. Bitte beachten Sie jedoch, dass diese letzteren Reagenzien und Ansätze, trotz JUNV Eintrag zu blockieren, nicht zu blockieren Befestigung bestätigt worden, obwohl dies eine wahrscheinliche Erklärung ist. Das hier beschriebene Protokoll könnte formal verwendet werden, ob diese verschiedenen Ansätze Auswirkungen Virion Befestigung bestimmen.
  2. Entfernen Platten aus dem 37 ° C Inkubator undentweder in einem 4 ° C Kühlschrank oder auf Eis für 15 min, um die Fähigkeit der plattierten Zellen zu hemmen Endocytose durchzuführen.
  3. Als nächstes wird die komplette DMEM aus jeder Vertiefung absaugen und jeder schnell gut waschen zweimal mit 100 ul eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) pH-Wert 7,4. Anschließend werden 50 & mgr; l der vorverdünnten Virusproben (hergestellt in Schritt 2.1) in die entsprechenden Vertiefungen.
  4. Wickeln Sie die Platte in der Plastikverpackung und sofort entweder wieder auf Eis oder in einem 4 ° C Kühlschrank für 1 bis 1,5 Stunden zu ermöglichen Virusanheftung auftreten. Halten Sie die Platte, Waschpuffer und Virusproben kalt bei 4 ° C in diesem Schritt.
  5. Nach dem Abschluss der C Inkubation 4 °, die Virusinokulum aspirieren und jede Vertiefung 3 mal mit 200 ul eiskaltem PBS waschen.

3. Viral RNA-Extraktion

  1. Reinige viraler RNA aus JUNV C # 1 - Partikeln zu den Monoschichten angebracht , indem der kommerziellen Kits (zB RNeasy Mini Kit) according dem Protokoll des Herstellers. Genauer gesagt, um die "Reinigung von Gesamt - RNA aus tierischen Zellen unter Verwendung von Spin - Technologie - Protokoll" auf den Seiten 23 bis 28 in der RNeasy Mini Handbuch (4. Auflage, April 2006) mit den Änderungen , die nachstehend aufgeführt sind .
    1. Lysieren die Zellen, wie in Schritt ausgerichtet 1B durch Zugabe von 350 & mgr; l Lyse-Puffer RLT direkt in jede Vertiefung. Mischen Sie den Puffer mehrmals Zell-Lyse zu gewährleisten. Beachten Sie, dass Zellen leicht in diesem Puffer lysieren und vollständige Lyse kann durch Anzeigen Brunnen unter einem inversen Mikroskop überprüft werden.
    2. Übertragen Sie die resultierende Zelllysat zu dem Kit-Säule (Schritt 3a) und folgen Sie den Rest des Protokolls, wie beschrieben. An diesem Punkt hat sich das Virus durch den Lysepuffer neutralisiert worden, so dass die übrigen Schritte des Protokolls kann außerhalb der Klasse II Biosicherheit Schrank durchgeführt werden, sofern die kit Rohre nicht mit infektiösen Virus kontaminiert wurden.
    3. Fügen Sie den optionalen Schritt 9 aus dem Protokoll des Herstellers, der ein addit istional Zentrifugation der Spin-Säule eine mögliche Verschleppung von Buffer RPE zu beseitigen.
    4. Im letzten Schritt eluieren Protokoll des Herstellers (Schritt 10), um die gereinigte RNA von der Spin - Säule unter Verwendung von 30 & mgr; l Nuklease-freies ddH 2 O. Shop-RNA bei -80 ° C an dieser Stelle oder direkt in der qRT-PCR-Assays verwendet werden. Um den Abbau von gereinigten viralen RNA-Proben durch Nukleasen zu verhindern, Nuklease-freies Reagenzien und Geräte verwenden und aufgetauten RNA-Proben auf Eis halten.
      Hinweis: Puffer RLT und RW1 Guanidinsalzlösung enthalten und nicht mit Bleichmittel gemischt werden sollte. Buffer RW1 Ethanol enthält.

4. qRT-PCR-Messung des viralen Genoms

  1. JUNV C # 1 S-Segment RNA in cDNA für die nachfolgende qPCR, unterziehen die virale RNA (erzeugt in Schritt 3.1.4) bis RT in einem Gesamtvolumen von 50 ul zu konvertieren.
    1. So stellen Sie die RT-Reaktion auf, erstellen Sie zuerst einen Master-Mix für jede der folgenden Reagenzien pro Reaktion enthält: 6,75 ul Nuklease-freie ddH 2 O, 5 & mgr; l einer 2 & mgr; M Lager des RT - Primers S 2098- bis 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), die mit dem NP - Region des S - Segment genomischer RNA komplementär ist, 5 ul 10X PCR - Puffer II, 11 ul einer 25 mM MgCl 2 -Lösung, 1,25 ul (62,5 Einheiten) RT - Enzym, 1 ul (0,4 Einheiten) RNase - Inhibitor und 10 ul einer 500 uM dNTPs Vorrat an.
      Hinweis: Im Verlauf der Arenavirus-Replikation, 4 viralen S Segment RNA-Spezies erzeugt werden: ein in voller Länge genomische RNA (vRNA), ein in voller Länge antigenomische RNA (vcRNA) (dh das reverse Komplement des vRNA) und zwei subgenomischen mRNAs kodieren der NP und GP-Gene, respectively. Der RT-Primer aufgelistet ist spezifisch nur für die S-Segment vRNA, aber nicht die vcRNA, NP mRNA oder mRNA GP.
    2. Vorsichtig mischen die RT-Master-Mix und dann Aliquotierung 40 ul in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen. Zugabe von 10 ul der viralen RNA zu jedem Röhrchen. Fügen i) eine keine Vorlage Steuerrohr (zB. 10 ul Nuklease-freiem ddH 2 O zu 40 ul des Master - Mix) und ii) eine ohne RT Enzymkontrolle (zB werden 10 & mgr; l eines bekannten positiven viralen RNA - Probe auf 40 & mgr; l , die Master hinzufügen Mix nicht erhalten haben jede RT-Enzym) für die Kontamination der RT-Reagenzien mit amplifizierten DNA enthält, die das virale Ziel-Sequenz zu screenen. Umfassen RNA aus nicht-infizierten Zellen mit dem vollständigen RT Mastermix extrahiert für den Assay Spezifitätskontrolle in Anwesenheit von zellulären RNA.
    3. Darüber hinaus sind eine bekannte positive virale RNA-Probe auf den vollen Master-Mix, die Qualität der RT-Reagenzien zu überprüfen. Beachten Sie, dass das Volumen der RT-Reaktion kann auf 25 & mgr; l reduziert werden, wenn notwendig.
  2. Gegenstand Die RT Rohre zu folgenden Zyklusbedingungen: 25 ° C für 10 min, 48 ° C für 30 min, und 95 ° C für 5 min. Beachten Sie, dass die Proben durch Zugabe einer 4 ° C Schritt an dieser Stelle oder über Nacht in den Thermocycler bei -20 ° C gelagert werden.
  3. Perform qPCR in einem Gesamtvolumen von 25 ul.
    1. Machen Sie einen Master-Mix qPCR durch die Kombination der folgenden: 2,5 ul (einer 9 uM Lager) von jedem der Vorwärts-PCR-Primer S1937 + bis 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') und Rückwärts-PCR-Primer S 2001- bis 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 ul (eines 2 uM Lager) der qPCR Sonde S 1960+ bis 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 ') und 12,5 ul des 2X universal-qPCR Master mischen. Beachten Sie, dass die hier berichtet Vorwärts - Primer, die für JUNV C # 1 spezifisch ist, um 1 38 nt von der ursprünglich gemeldeten Primersequenz unterscheidet, die den virulenten Stamm JUNV Romero zum Ziel hat .
    2. Sie vorsichtig die Lösung mischen und dann 20 & mgr; l zu jeder Vertiefung qPCR hinzufügen. In 5 ul jeder RT-Reaktion auf die entsprechenden qPCR Brunnen. Führen Sie qPCR in dreifacher Ausfertigung für jede getestete Probe. Man beachte, dass das PCR-Reaktionsvolumen auf weniger als 12,5 & mgr; l reduziert werden kann, wenn nötig.
      Hinweis: Die Software, die mitdie qPCR Maschine absolute Kopienzahl von # 1 S Segment genomischer RNA JUNV C erzeugen, indem sie den Wert jeder unbekannten Probe zu einer Reihe von Standardverdünnungen von Plasmid Vergleichen des JUNV C # 1 NP-Gen kodiert, welches das Ziel der qPCR Primer ist und Sonde eingestellt. Der qPCR-Assay kann nur Quantifizierung für Werte liefern, die im Bereich der Standardkurve fallen. Aus diesem Grund enthalten die folgenden Mengen an Plasmid (in dreifachen Vertiefungen): 5, 50, 5 x 10 3 5 x 10 5 und 5 x 10 7 Kopien pro Vertiefung.
  4. Laden Sie die qPCR Platte in den Thermocycler und führen Sie die folgenden Reaktionsbedingungen: 95 ° C für 10 min und 40 Zyklen von 95 ° C für 15 Sekunden und 60 ° C für 1 min.
    1. Sammeln und Analysieren der Daten der Menge der viralen RNA in jeder Probe zu bestimmen, gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  5. Um eine Standardkurve unter Verwendung einer neu gereinigt Probe von Plasmid herzustellen, die qPCR teerhaltigeerhalten Sequenz bestimmen zuerst die Plasmid-Kopienzahl in dieser Lösung.
    1. Berechnen, das Molekulargewicht des Plasmids. Wenn die Sequenz des gesamten Plasmid bekannt ist, berechnen diese nach der folgenden Formel: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303.2] - 61.13). Denken Sie daran, die Gesamtzahl von einem bestimmten Nukleotid an jeden Strang des doppelsträngigen Plasmids gefunden aufzunehmen.
    2. Wenn die Größe des Plasmids bekannt ist, aber seine genaue Sequenz nicht, berechnen die MW unter der Annahme, dass jede dsDNA Basenpaar mit einem MW von 600 hat.
      Hinweis: Die pCAGGS-JUNV C # 1 NP - Plasmid verwendet , hier hat ein MW von 4,2 x 10 6.
    3. Sobald das MW des Plasmid bestimmt worden ist, zu berechnen, wie viele Kopien pro ul vorhanden sind, in der Lager-Plasmid-Lösung.
    4. Zuerst berechnen die Gesamt ug Plasmid in der Lösung, dann ist dieses Plasmid zu Molen wandeln (zB wenn 69 ug Plasmid werden in 300 & mgr; l Wasser enthielt, dann 6,9 x 10 -5 g des Plasmids * 1 Mol / 4,2 x 10 & sup6 ; g des Plasmids = 1,6 x 10 -11 mol Plasmid), die Anzahl zu kopierüberführt werden können (beispielsweise 1,6 x 10 -11 mol Plasmid * 6,022 x 10 23 Moleküle / Mol = 9,8 x 10 12 Moleküle (oder Kopien)).
    5. Teilen Sie die Gesamt Kopien von Plasmid in der Plasmid - Lösung durch das Volumen dieser Lösung zu erhalten Kopien pro ul (zB 9,8 x 10 12 Kopien / 300 & mgr; l = 3,28 x 10 10 Kopien).
    6. Man verdünnt diese Lösung so ein, dass 5 ul-Volumina auf die PCR-Platte geladen werden kann, den Bereich der Kopienzahlen zu liefern, benötigt die Standardkurve zu etablieren.

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Ergebnisse

Um die Empfindlichkeit und Dynamikbereich des qPCR - Assay bekannt Mengen eines Plasmid , das das NP - Gen von JUNV C # 1 (Bereich 5-5 x 10 7 Kopien) zeigen , wurden auf qPCR unterzogen , wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben. Der Test ist empfindlich und zuverlässig so wenige wie 5 Kopien der Zielnukleinsäure (Figur 2) zu erkennen. Ferner ist der dynamische Bereich des Assays groß und kann wie in 2 gezeigt ist , mindestens 7 logs der ...

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Diskussion

Das Protokoll, das wir beschreiben, ist einfach und robust, sofern die folgenden kritischen Überlegungen beachtet werden. Zunächst strenge pre-PCR - Technik muss (siehe 28 für eine ausgezeichnete Bewertung) eingesetzt werden. Es ist zwingend notwendig, dass alle Reagenzien und Ausrüstung von amplifizierte DNA-frei sind die qPCR Zielsequenz und entsprechende Kontrollen an Ort und Stelle, die solche Kontamination zu erkennen. Zweitens, für das Virus-Zell-Befestigungsabschnitt des Protokolls, dem Virus, Zellen u...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce und Benjamin König für hilfreiche Diskussionen und die National Institutes of Health für die Unterstützung dieser Studien durch Zuschüsse T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) und P20RR021905 (JB) .

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMLife Technologies11965-118
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-163100x
HEPES PufferlösungLife Technologies15630-130100x
PBS pH 7,4Life Technologies10010-0231x
Vero E6 ZellenAmerican Type Culture CollectionCRL-1586
Costar 48-Well-PlatteCorning3548
RNeasy Mini-KitQiagen74106mischt keine Puffer RLT oder   RW1 mit Bleichmittel
, QIAshredder-HomogenisatorQiagen79654
Taqman Universal PCR, Master Mix, Life Technologies4326614
Multiscribe, Reverse Transkriptase (50U/µ l)Life Technologies4311235 dNTP-Mischung
(10 mM; je 2,5 mM dNTP)Life TechnologiesN808-0260
GeneAmp 10X PCR-Puffer II und 25 mM MgCl2-LösungLife TechnologiesN808-0010
RNase-Inhibitor (5000U/100 & Mikro; l)Life TechnologiesN808-0119
RT Grundierung 5'-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3'		Integrated DNA Technologies250 nmol DNA-Oligo-Standard-Entsalzung
Vorwärts qPCR-Primer  5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'Life Technologies4304971Standard-Entsalzung
Reverse qPCR Primer 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'Life Technologies4304971Standard-Entsalzungssonde
TaqMan 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'Life Technologies4316033HPLC-gereinigte
MicroAmp Fast Optical 96-Well-Reaktionsplatte (0,1 mL)Life Technologies4346906
StepOnePlus Real-Time PCR SystemLifeTechnologies 4376598oder ein anderes qPCR-Gerät
, ,

Referenzen

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