Methodenartikel

Geschlechtsunterschiede in Mäuse Hippocampus Astrozyten nach

DOI:

10.3791/53695

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25. Oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Astrozyten sind eine der wichtigsten Schlüsselspieler im zentralen Nervensystem (ZNS). Hier berichten wir eine praktische Methode der sexed Hippokampus - Astrozyten Kulturprotokoll , um die zugrunde liegenden Mechanismen der Astrozytenfunktion bei männlichen und weiblichen Neugeborenen Welpen nach In-vitro - Ischämie zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrogliose nach Hypoxie / Ischämie (HALLO) -related Hirnverletzung spielt eine Rolle bei einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei Neugeborenen. Neuere klinische Studien zeigen , dass die Schwere der Hirnverletzung erscheinen Geschlecht abhängig zu sein, und dass die männlichen Neugeborenen sind anfälliger für die Auswirkungen von HALLO bezogenen Hirnverletzung, was zu mehr schweren neurologischen Ergebnisse als zu Frauen mit vergleichbaren Hirnverletzungen verglichen. Die Entwicklung zuverlässiger Methoden zur Isolierung und hochangereichertes Populationen von sexed Hippokampus-Astrozyten halten ist wichtig, die zellulären Grundlagen der Geschlechtsunterschiede in den pathologischen Folgen der Neugeborenen-HALLO zu verstehen. In dieser Studie beschreiben wir ein Verfahren zur geschlechtsspezifischen hippocampal Astrozytenkulturen schaffen , die in vitro zu einem Modell der Ischämie unterzogen werden, Sauerstoff-glucose deprivation, gefolgt von Reoxygenierung. Nachfolgende reaktive Astrogliose wurde von immunostai geprüftning für den sauren Gliafaserproteins (GFAP) und S100B. Dieses Verfahren stellt ein nützliches Werkzeug, um die Rolle der männlichen und weiblichen hippocampalen Astrozyten folgenden neonatal HALLO, separat zu untersuchen.

Einleitung

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Astrozyten sind eine der wichtigsten Schlüsselspieler im zentralen Nervensystem (ZNS). Immer deutlicher abzeichnet, zeigt an, dass die Rollen von Astrozyten sind mehr als neuronale Unterstützung. In der Tat können die Rollen der Astrocyten unter physiologischen Bedingungen sehr komplex, wie die Wanderung der Entwicklungs Axone 1 Führung Regulieren CNS Blutfluß 2, um den pH - Homöostase des synaptischen Interstitialflüssigkeit 3 und in der Blut - Hirn - Schranke beteiligt 4 und 5 der synaptischen Übertragung. Unter pathologischen Bedingungen reagieren Astrozyten zu Verletzungen im Zusammenhang mit einem Prozess reaktiven Astrogliose genannt , in dem die Morphologie, Anzahl, Lage, Topographie (in Bezug auf Abstand von Insult) und Funktion der Astrozyten in einer heterogenen Weise 6,7 geändert. Astrogliose folgende neonatalen hypoxischen ischämischen Enzephalopathie gesehen vielleicht auf die Morbidität und Mortalität von Neugeborenen beitragen 8.

Neuere klinische und experimentelle Studien zeigen, dass die Schwere der Hirnverletzung wird geschlechtsabhängig zu sein und dass die männlichen Neugeborenen anfälliger für die Wirkungen von Hypoxie / Ischämie (HALLO) -bezogene Hirnverletzung, was zu schweren neurologischen Ergebnisse im Vergleich zu Frauen mit vergleichbaren Hirnverletzungen 11.09. Obwohl die Lokalisation der Verletzung auf dem Schwangerschaftsalter und der Dauer und der Schwere der Insult abhängt, ist hippocampus eine der am häufigsten durchgeführt Regionen im ZNS nach der Begriff neonatal HALLO und erhöhte hippocampal Astrogliose durch Hochregulierung von bestätigt die sauren Gliafaserproteins (GFAP) 3 d nach der Neugeborenen HALLO 7,10,12,13. Geschlechtsunterschiede in Astrozytenfunktion wurden in beiden Neugeborenen und erwachsenen Nagetieren nach zerebraler Ischämie 14,15 gezeigt. Zusätzlich wurde männlichen astrozytären Anfälligkeit für in-vitro Ischämie durch erhöhte cel gezeigtenl Tod im Vergleich zu weiblichen kortikalen Astrozyten in Kultur 16.

Geschlechtsunterschiede beginnen in-utero und weiter bis zum Tod 17. Im Laufe der letzten zehn Jahre von der Bedeutung , die Geschlechter in der experimentellen Bedingungen in Zellkultur mit und in-vivo - Studien haben die Schwerpunkte des Instituts für Medizin und NIH gewesen grundlegende Kenntnisse in den geschlechtsspezifische Unterschiede in der physiologischen und pathologischen Zuständen gesehen zu suchen 17,18 . Entwicklung zuverlässiger Methoden Populationen von sexed Hippokampus-Astrozyten zu isolieren und zu pflegen ist wichtig, die zellulären Grundlagen der Geschlechtsunterschiede in den pathologischen Folgen der Neugeborenen-HALLO zu verstehen. Die vorliegende Studie wurde entworfen, um die Techniken zu bieten angereichertem geschlechtsspezifische hippokampale Astrozytenkulturen von neugeborenen Mäusen vorzubereiten, um die Rollen von GFAP-immunoreaktive Astrozyten zu bewerten folgenden Sauerstoff / Glukose-Deprivation (OGD) und Reoxygenierung (Reox), induzierenHALLO in Zellkulturumgebung. Diese Technik kann verwendet werden, um eine Hypothese zu testen, in Bezug auf Hippokampus-Astrocyten in neonatal Männchen und Weibchen unter normoxischen und ischämischen Zuständen.

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Protokoll

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HINWEIS: Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Empfehlung des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health durchgeführt. Das Tier Protokoll wurde von der University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. Primäre Astrocyte Kultur Protokoll , das hier vorgestellt wird , wird aus den von Zhang Y 19 et al Protokolle angenommen. Und Cengiz P 20 et al. Mit einigen Modifikationen.

1. Hippocampale Dissection und Astrocyte Kultur

  1. Bereiten Sie alle notwendigen Reagenzien und Materialien einschließlich chirurgische Scheren, glatt feinen Pinzette, flache Spitze Pinzette, Papiertücher, Abfallbeutel, 70% Ethanol und 2 Sezieren Gerichte (3,5 cm Durchmesser) auf Eis gefüllt mit 2 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) jeder . Stellen Sie sicher, dass die chirurgische Ausrüstung sind steril (Autoklav) vor dem Verfahren lassen und alle anderen Materialien (Astrocyte Plating Medium: DMEM + 5% Pferdeserum +1% Penicillin-Streptomycin, Pferdeserum, HBSS, 0,25% Trypsin, Glasplättchen, Petrischalen, 15/50 ml - Röhrchen, T25 Flaschen, etc.) als vorge steril.
  2. Mit scharfen sterilen Schere [1 (1)] vorsichtig halten und den Kopf und den Hals der Maus pup mit 70% Ethanol besprühen und enthaupten.
  3. Führen Sie einen Mittelschnitt von hinten nach vorn Schädel mit einer kleinen Schere entlang der Kopfhaut , das Gehirn zu entlarven [1 (2-3)].
  4. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig vom Hals bis zur Nase mit einer kleinen Schere. Dann schneiden Sie Schädel anterior der Riechkolben und schlechter als das Cerebellum den Schädel von der Schädelbasis zu trennen.
  5. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Basis des Schädels und entlang der Mittellinie geschnitten. Verwenden Sie sterile Flach Spitze Zange den Schädel abzulösen. Entfernen Sie den Hirnstamm mit Hilfe einer gebogenen Pinzette. Entfernen Sie Gehirn aus dem Schädel und legen Sie in die erste Sezieren Gericht [1 (4-9)] 21.
  6. Unter Verwendung einer gebogenen Pinzette, drehen das Gehirn , so dass die ventrale Oberfläche des Gehirns nach oben und trennen sich dann die beiden Hemisphären mit einem scharfen sterilen chirurgischen Klinge [1 (10,11)]
  7. Ziehen Sie die zerebralen Hemisphären und sorgfältig die prall Mittelhirns und Thalamus Gewebe mit einer sterilen flach gebogenen Pinzette entfernen Sie den Hippocampus zu offenbaren, eine kleine, Seepferdchen förmige Struktur im medialen Temporallappen [1 (12-14)].
  8. Entfernen Sie sowohl die Hippokampus - Lappen [1 (15,16)] und sorgfältig die Meningen von den Lappen sezieren , indem sie mit den feinen Pinzette ziehen. Dieser Schritt vermeidet eine Verunreinigung der endgültigen Astrozyten Kultur von meningealen Zellen und Fibroblasten.
  9. Übertragen Sie die vorbereiteten Hippokampus - Lappen in die zweite Schale mit HBSS gefüllt und schicken Sie es auf Eis [1 (17,18)]. Pool sowohl Hippocampus-Lappen aus einer einzigen Maus (P0 - P2) zur Herstellung von hippoCampal Astrozytenkulturen. Dies gibt die Astrozyten richtige Dichte. Mince Hippokampus-Lappen einen scharfen sterilen chirurgischen Klinge (ca. 4 mal).
  10. Absaugen HBSS aus Schale mit einer sterilen Spitze an einer 1-ml-Pipette und 3 ml 0,25% Trypsin, mischen, Transfer in ein 15 ml sterilen konischen Röhrchen und inkubieren das Gewebe bei 37 ° C für 20 min unter leichtem Schütteln.
  11. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min. Absaugen Überstand unter Verwendung sorgfältig mit einer sterilen Glaspipette mit einer Vakuumleitung angebracht. In 10 ml Astrozyten Plattierungsmedium und verreiben (20 - 30 mal) mit einem feuerpolierte Glaspipette, bis die Gewebestücke homogenisieren.
  12. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min. Überstand entfernen und mit 2 ml frischem vorgewärmtem Astrozyten Plattenmedien. Passieren Zellen durch ein 70 & mgr; m-Mesh-Filter (Zellsieb) in ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
  13. Platte gesamte Zellsuspension auf Poly-D-Lysine / Laminin beschichtet sterile T25 Kulturflasche mit 3 mlAstrozyten Plattierung Medien, brüten dann der Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator.
  14. Absaugen gesamte Medien bei Tages- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 und DIV 7 und ersetzen mit 2 ml frischem Astrozyten Plattierung Medien. Beachten Sie die Progression und astrozytären Zusammenfluß unter dem Lichtmikroskop jedes Mal, während die Astrozyten Plattierung Medien zu ersetzen.
    HINWEIS: Bei DIV 1 alle lebensfähigen Astrozyten an der Oberfläche der Kulturflasche angebracht und die toten oder sterbenden Zellen, Nervenzellen enthalten, werden in der überstehenden Flüssigkeit schwimmt. Bei DIV 3 beginnen die anhaftenden Zellen zu teilen astrozytären Zellschicht zu bilden. In Abwesenheit der unterstützenden Bedingungen ist Kultur fast frei von jeder neuronalen Wachstums. Bei DIV 7 ist Astrozyten-Schicht etwa 80-90% konfluent und einige Mikroglia sowie Oligodendrozyten-Vorläuferzellen vorhanden sind auf der Oberseite der Schicht astrozytären.
  15. Saugen Sie das Plattenmedium aus dem Kolben, fügen Sie 2 ml frischem vorgewärmtem Astrozyten Plattierungsmedium gründlich einnd wieder entfernen bei DIV 11, wenn Astrozyten sind konfluent und bereit für die Kultivierung sub.
  16. In 2 ml 0,25% Trypsin, sanft den Kolben einige Male drehen und absaugen Trypsin eine sterile Glaspipette verwenden.
  17. In 2 ml 0,25% Trypsin und ließ den Kolben 4 in der Gewebekultur Haube sitzen - 5 min bei RT.
  18. Entfernen Sie die Trypsin und halten den Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 10 min. In 5 ml vorgewärmtes Astrozyten Plattierungsmedium und entfernen Sie die astrozytären Schicht, indem der Kolben gegen die Handfläche klopfen (3 bis 4 mal) durch leichtes Verreiben gefolgt vollständige Ablösung zu erreichen und die Astrozyten in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln.
  19. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min den Überstand aspirieren, und fügen Sie 1 ml frisches Astrozyten Plattierungsmedium.
  20. Fügen Sie 10 ul der Zellsuspension auf eine Zählkammer und zählen Sie die Zellen in der großen zentralen gerasterten Bereich (1 mm 2) unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop (10X - Objektiv). Multiply von 10 4 , die Anzahl der Zellen pro ml zu bestimmen. Ein T25 - Kolben nachgeben ~ 1 x 10 6 insgesamt dissoziierten Zellen. Seed ~ 1 x 10 5 Zellen in 2 ml astrocyte Plattierungsmedium auf einem 12 mm Durchmesser Poly-D-Lysine vorbeschichteten Deckglas in die Vertiefung einer 24-Well - Kulturschale.
  21. In einer 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C inkubieren. Führen Sie OGD / Reox bei DIV 12 bis 14 (Abschnitt 2).
  22. Behandeln Sie die Astrozytenkulturen bei DIV 3 mit 5 mM L-Leucin-Methylester (LME) Hydrochlorid bis DIV 11, wenn Hippokampus-Kulturen frei von Mikroglia erwünscht sind. Nach LME Inkubation Fachkulturen zu Schütteln (300 Umdrehungen pro Minute für 1 h) verunreinigen Mikroglia zu entfernen.
    HINWEIS: LME ist ein microglial zytotoxischen Mittel , das in großem Umfang als ein Verfahren verwendet wurde Mikroglia 22 zu beseitigen proliferierenden.

2. OGD / Reox Behandlung

  1. Absaugen Medien von Deck enthält adhärenten Astrozyten Kultur (DIV 12 bis 14) und spülen Sie 3-maldurch die 24-Well - Kulturschale das Deckglas ein paar Mal mit 1 ml isotonischer OGD - Lösung (pH 7,4) , die (in mM) hält sanft rotierenden: 0 Glukose, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl 2 und 0,81 MgSO 4.
  2. In 0,2 ml OGD Lösung auch das Deckglas zu bedecken und 2 h in einem hypoxischen Inkubator inkubieren enthält 94% N 2, 1% O 2 und 5% CO 2. Vorsichtig mit einem Orbitalschüttler (50 rpm) für die ersten 30 min der Hypoxie mischen Gasaustausch zu erleichtern.
  3. Inkubieren normoxischen Kontrollzellen für 2 h in 5% CO 2 und atmosphärische Luft in einem Puffer identisch mit der OGD - Lösung mit Ausnahme der Zugabe von 5,5 mM Glucose.
  4. Für Reox absaugen OGD-Lösung und 2 mL Astrozyten Plating Medium. Inkubiere in 5% CO 2 und atmosphärischer Luft bei 37 ° C für 5 h.

3. immunzytochemische Färbung

  1. Absaugen Kulturmedien eine sterile Glaspipette mit einer Vakuumleitung angebracht verwenden und schnell Deck spülen einmal durch Zugabe von 1 ml 0,1 M Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM Trizma-Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) zum Brunnen. Absaugen und mit 2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS). Inkubieren für 15 min bei RT.
  2. Absaugen und fügen Sie 1 ml 0,1 M TBS, legen Sie dann auf einem Schüttler für 2 min. 3-mal wiederholen. In 1 ml Blockierungslösung (10% Ziegenserum, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 in 0,1 M TBS) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C auf einem Schüttler.
  3. Aspirat Blockierungslösung und primären anti-GFAP monoklonalen Maus-Antikörper hinzuzufügen (0,2 ml einer 1: 500-Verdünnung in Blockierlösung) und Kaninchen-polyklonalen Anti-S100B (1: 500) oder polyklonalem Kaninchen-anti-HIF1α (1: 200) für 60 min bei 37 ° C auf einem Schüttler.
  4. und Maus mon: Alternativ werden einige Astrozyten mit polyklonalen Kaninchen-anti-Iba1 (200 1) inkubiertoclonal anti-MAP2 Reinheit der Kultur zuzugreifen.
  5. Absaugen primären Antikörper und spülen Deckglas durch Zugabe von 1 ml 0,1 M TBS und Unterbringung an einem Schüttler für 2 Minuten und dann gründlich absaugen. Zweimal wiederholen.
  6. Hinzufügen 0,2 ml einer 1: 200-Verdünnung des sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-488-konjugiertem und anti-Maus-568-konjugierten Antikörper in Blocking-Lösung für 60 min bei 37 ° C auf einem Schüttler.
  7. Absaugen sekundären Antikörper und spülen Deckglas durch Zugabe von 1 ml 0,1 M TBS und auf einem Schüttler für 2 Minuten und dann gründlich absaugen. Zweimal wiederholen.
  8. Entfernen Sie Deck von gut und trocken, indem man auf eine Folie auf einem Schlitten Trockner positioniert. Berg Deckglas auf einer neuen Folie, indem Sie auf einen einzigen Tropfen des Vectashield Umkehren hardset Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ng / ul).
  9. Bild Deckgläser auf einem konfokalen Mikroskop entweder 20X trocken oder 60X Öl-Objektiv. Erwerben Sie Bilder (512 x 512) für DAPI (405 nm ex / 450 nm em) und Fluorochrom 488 markiert GFAP Antikörper (488 nm ex / 515 nmem). Halten Sie Erfassungsparameter konstant innerhalb der 20X und 60X-Gruppen.

4. Geschlechtsbestimmung mittels PCR

  1. Wärme Pup Zeh oder Finger Schnittgut bei 95 ° C für 45 min in 50 mM NaOH und Neutralisieren mit einem gleichen Volumen von 1 M Tris, pH 6,8.
  2. 1 & mgr; l der extrahierten DNA-Lösung zu 19 & mgr; l des folgenden Gemisches: 5 pmol Primer für die MYOG und Sry Gene, 1x Reaktionspuffer, 0,2 mM von jedem Desoxynukleotid und 8 U Taq-Polymerase.
  3. Verwenden Sie Primer-Sequenzen; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' und MYOG 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Führen Sie die folgende PCR-Protokoll: 95 ° C für 3 min, dann 30 Zyklen Denaturierung bei 95 ° C für 15 s, Annealing bei 58 ° C für 15 s und Verlängerung bei 72 ° C für 1 min. Nach dieser 30 Zyklen schließt die Reaktion mit einem letzten 72 ° C Elongation für 1 min.
  5. Separate PCR Produkte elektrophoretisch auf einem mit Ethidiumbromid, das 2% Agarose-Gel und unter UV-Beleuchtung sichtbar. (2A.) ACHTUNG! Ethidiumbromid ist ein potenzielles Karzinogen und muss sorgfältig und fachgerecht gemäß Institution Vorschriften entsorgt behandelt werden.

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Ergebnisse

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Verständnis haben die Rollen von sexed Astrozyten Funktionen unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen wurden durch die Kultivierung dieser Zellen unter in vitro Bedingungen immens aufgeklärt. Der wichtige Aspekt gesextem Züchten der Durchführung ist das Geschlecht der Maus Welpen vor seiner Verwendung zu bestimmen. Wir stellten fest , das Geschlecht der Maus genetisch durch PCR und durch visuelle Beurteilung (Abbildung 2) 16. Die Me...

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Diskussion

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Um die geschlechtsspezifische Unterschiede in den Eigenschaften und Funktion der Astrozyten unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, die Vorbereitung von sexed primären Astrozyten in der Zellkultur ist ein wichtiges Instrument zu nutzen. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine hocheffiziente und ein reproduzierbares Verfahren zur Kultur ein hochangereichertes homogene Population von sexed Hippokampus - Astrozyten von Neugeborenen (P0-P2) C57Bl / 6 (Wildtyp) oder K19F (GFAP null) Ma...

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Offenlegungen

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Keiner der Autoren haben im Wettbewerb oder widerstreitenden Interessen.

Danksagungen

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Clinical and Translational Science Award Programm von NCATS UL1 TR0000427 und KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 an das UW ICTR von NIH/NCATS und Mittel vom Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 von NINDS (Cengiz P) und NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Wir danken Albee Messing, PhD, für die Bereitstellung der GFAP-Knockout-Mäuse.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Astrozyten-Kulturmedien
DMEM, hoher GlukosegehaltCellgro10-013-CV
PferdeserumGibco26050-070Endkonzentration: 10%
Penicillin-StreptomycinCellgro 30-002-CIEndkonzentration: 1%
L-LeucinmethylesterhydrochloridAldrichL1002-25GEndkonzentration: 5
mMLösung für die Verdauung von HirngewebeHBSS
Life Technologies14170-088
Trypsincellgro25-050-CIEndkonzentration: 0,25%
Sonstiges
70% (vol/vol) EthanolRoth9065.2
Poly-D-Lysin (PDL) 12 mm runde Deckgläser Corning354087
WaterSigmaW3500
PBScellgro21-040-CVZellkulturqualität
0,05 % Trypsin-EDTALife Technologies25300-062
70 μ m Steriles Zellsieb Fisher scientific22363548
3,5 cm PetrischaleBD Falcon353001
15 mL Falcon RöhrchenBD Falcon352096
50 mL Falcon RöhrchenBD Falcon352070
Pinzette, fein Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Pinzette, flache SpitzeKLS Martin12-120-11
13 cm OP-SchereAesculapBC-140-R
KonfokalmikroskopNikonA1RSi 
ZentrifugeEppendorf5805000.0175804R
OrbitalschüttlerThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741Kaninchen monoklonal
Anti-MAP2SigmaM2320Maus monoklonal
Anti-HIF1alphaabcamab179483Kaninchen monoklonal
Anti-S100BSigmaHPA015768Kaninchen polyklonal
Anti-GFAP (Cocktail)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Kaninchen IgG)Vector LabsPK-6101enthält 4 Reagenzien 
Ziege Anti Kaninchen Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Ziege Anti Maus Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004

Referenzen

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Schlagwörter

Sauerstoff und GlukoseentzugAstrozytenkulturreaktive AstroglioseGFAP ExpressionS100B Expressionneonatale Hirnsch digungImmunfluoreszenzf rbung

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