Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.
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Methodenartikel
Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gen-Silencing- und Überexpressionstechniken sind entscheidend für die Identifizierung von Genen, die an der Embryonalentwicklung beteiligt sind. Die direkte Modifikation von Zielgenen in Präimplantationsembryonen bietet die Möglichkeit, die zugrundeliegenden Mechanismen von Genen zu untersuchen, die beispielsweise an der zellulären Differenzierung in das Trophektoderm (TE) und die innere Zellmasse (ICM) beteiligt sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Rolle von Neogenin als authentischen Rezeptor für die anfängliche Bestimmung des Zellschicksals in Präimplantationsembryonen von Mäusen untersucht. Zunächst diskutieren wir die experimentellen Manipulationen, die verwendet wurden, um durch Mikroinjektion von Neogenin-cDNA und shRNA einen Gewinn und Verlust der Neogeninfunktion zu erzeugen; Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wurde durch eine starke Korrelation zwischen den paarweisen Expressionsniveaus des rot fluoreszierenden Proteins (RFP) oder des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und der immunzytochemischen Quantifizierung der Neogenin-Expression bestätigt. Zweitens führt die Überexpression von Neogenin in Präimplantations-Mausembryonen zu einer normalen ICM-Entwicklung, während der Neogenin-Knockdown dazu führt, dass sich das ICM abnormal entwickelt, was darauf hindeutet, dass Neogenin ein Rezeptor sein könnte, der extrazelluläre Signale weiterleitet, um Blastomere zu frühen Zellschicksalen zu treiben. Angesichts des Erfolgs dieses detaillierten Protokolls bei der Untersuchung der Funktion eines neuartigen embryonalen Entwicklungsstadium-spezifischen Rezeptors schlagen wir vor, dass es das Potenzial hat, die Erforschung und Identifizierung anderer stadienspezifischer Gene während der Embryogenese zu unterstützen.
Einleitung
Preimplantation Embryonalentwicklung kann in mehrere verschiedene Stufen, von der Ein-Zell-Stadium zum Morula und der Blastozyste unterteilt werden. Vieles deutet darauf hin, dass die Polarität und Positions Cues eine Rolle in der frühen Zellschicksal Bestimmung in die Trophektoderm (TE) und der inneren Zellmasse (ICM) spielen. die Art der Signale jedoch, wie sie in zelluläre Signale transduziert werden und die physiologischen Zusammenhänge, in denen solche Signale zu initiieren Zelllinie Differenzierung fähig sind nicht bekannt. Diese differenzierten Zellen dann Spezialisierung durchlaufen, beginnend auf charakteristische Strukturen und Funktionen für die Embryo richtige Bildung und das Wachstum der Plazenta 1-3 benötigt zu nehmen.
Präimplantationsembryonen sind besonders geeignet, um Manipulation durch direkte Injektion von modifizierten genetischen Materialien wie siRNA oder Ziel-cDNA und somit genutzt werden können spezifische Zielmoleküle zu untersuchen. Es gibt ein wachsendes Verständnis, dass genetischeAnalyse von Wirbeltierembryonen ist entscheidend unser Verständnis der embryonalen Entwicklung 4 voran. Precise Einführung eines Wildtyp-Gens oder einer mutierten Form in einen Embryo in einer angemessenen Zusammenhang Verstärkungs- oder Verlust der Funktion des Gens zu erreichen, hat die Untersuchung der entwicklungsregulierter Gene stark erleichtert. Verlust- und gain-of-Funktion via Mikroinjektion von genetischem Material in einzelne frühen Nicht-Säuger und Säugetierembryos ist relativ einfach aufgrund ihrer Größe und große Empfänglichkeit 5. Mikroinjektions wird typischerweise unter Verwendung nicht-viraler Vektoren durchgeführt. Besonders vorteilhaft ist die Leichtigkeit der Verwendung von nicht-viralen Vektoren über virale Vektoren und Transgene genommen. Eine schnelle Verlust- oder gain-of-function - Expressionssystem in Maus - Embryonen entwickelt worden , das uns Genfunktionen in wirbel Embryologie 6,7 zu sezieren und zu verstehen , ermöglicht.
Die Fluoreszenzmarkierung von Embryonen würde erheblich die Auswahl an MICR erleichternoinjected oder genetisch manipulierten Embryonen und zugleich ein Mittel gewähren , um indirekt die Expression von siRNA mikroinjiziert oder cDNA 8 basierend auf Fluoreszenzintensität quantifiziert werden . Um diese Markierung, fluoreszierende Protein cDNA erreichen, GFP oder RFP, sind Co-Injections entweder als Fusionskonstrukte oder getrennt. Die Fluoreszenzintensität von GFP oder RFP zeigt das Ausmaß der Expression von siRNA oder fremden DNA, die Verlust- oder gain-of-function, um sicherzustellen, wurde erreicht.
Hier präsentieren wir ein Mikromanipulations Protokoll für Verlust- und Gewinn-of-Funktion Technik, die es uns ermöglicht, zu identifizieren Neogenin als Rezeptor die extrazelluläre Signale wichtig in der frühen Zelldifferenzierung in preimplantation Maus-Embryonen weiterleitet.
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Protokoll
HINWEIS: Alle Verfahren für die Tierzucht und Sorgen wurden nach führten die IACUC Vorschriften Sahmyook University, Seoul, Südkorea.
1. Superovulation, Zucht und Eileiter Isolation
- Pflegen inzüchtig C57BL / 6-Mäuse unter den folgenden Bedingungen: 22 ± 3 ° C, ~ 60% Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus, und Wasser und Nahrung ad libitum.
- Induce Superovulation von 3-5 Wochen alten weiblichen Mäusen durch eine intraperitoneale Injektion von 5 IU trächtige Stute Serum-Gonadotropin (PMSG) bei 0,1 ml / Kopf folgte 48 Stunden später durch eine intraperitoneale Injektion von 5 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) bei 0,1 ml /Kopf.
- Unmittelbar der Injektion hCG, über Nacht Superovulationsbehandlung-induzierte Weibchen mit geschlechtsreifen Männchen der gleichen Stamm von ihnen im selben Käfig halten paaren.
- Am nächsten Morgen, bestätigen den erfolgreichen Paarung durch die Anwesenheit eines Gegenstecker oder Vaginalpfropfens auf den weiblichen Genitaltrakt.
- Sacrifice schwangere weibliche Mäusedurch CO 2 Intoxikation gefolgt durch zervikale Dislokation 18-20 Stunden nach der hCG - Injektion.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle durch die Haut schneiden und dann die Bauch Schicht mit einer feinen Schere.
- Pick-up die Gebärmutterhörner mit einer feinen Pinzette und ziehen weg die Gebärmutter, Eileiter, Eierstock, und Fettpolster sanft aus der Körperhöhle.
- Schneiden Sie den Bereich zwischen den Eileiter und Eierstock mit einer feinen Schere. Neupositionierung der Zange und schneiden die Gebärmutter in der Nähe des Eileiters befestigt, mindestens 1 cm von dem oberen Teil des Uterus verlassen.
- Übertragen die Eileiterampulle in eine 35 mm Petrischale mit M16-Medium bei Raumtemperatur. Pool den Eileitern von mehreren Mäusen in der gleichen Gericht.
- Die Schalen werden unter einem Stereomikroskop für den Abruf von Embryonen.
2. Retrieval und Kultur von 2-pronukleären (2-PN) Embry
- Schneiden Sie das Ende einer 30 oder 32 G Injektionsnadel, schleifen sie in eine stumpfe Spitze, und verwenden Sie es als eine Spülung Nadel.
- Benutzenfeinen Pinzette das Ende des Eileiters auf die Spülung Nadel gleiten kann. Drücken Sie vorsichtig die Spitze der Spülung Nadel gegen den Boden der Schale es an Ort und Stelle zu halten. Spülen Sie die Eileiter mit ~ 0,1 ml M16 Medium, um die in eine Petrischale 2-PN Embryonen freizugeben.
- Gewinnen Sie die 2-PN Embryonen zusammen mit umgebenden Cumulusmassen aus dem gespülten M16 Medium unter dem Stereomikroskop mit einer sterilen Glaspipette und übertragen sie in eine neue Petrischale.
- Dissoziieren Cumuluszellen aus den 2-PN Embryonen durch enzymatischen Verdau mit 1,0 ml von 0,1-0,5% Hyaluronidase in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) bei 37 ° C für 5-10 min.
- Entblößen Embryonen mit einer Glaspipette und physikalische Entfernung von Cumuluszellen vorsichtiges Pipettieren.
- Waschen denudierten Embryonen dreimal mit 30-50 ml frischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro Embryo.
- Inkubieren Embryonen in einer 35 mm-Kunststoff-Petrischale in M16 Medium mit 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA ergänzt, FractIonen - V) bei 37 ° C in 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator , bis der Mikroinjektion durchgeführt wird, die in der Regel später weniger als 4 Stunden ist.
3. Embryo Reverse Transkription (RT) und die Polymerasekettenreaktion (PCR)
- Sammeln mindestens 10 Embryonen aus jeder Stufe bis zum Blastozystenstadium und sie gemeinsam in 4,0 ul 5x-Reverse-Transkriptase-Vormischung Lösung, die reverse Transkriptase, RNase-Inhibitor, Oligo dT Primer, Random 6mers, dNTP-Gemisch, und die Reaktionspuffer in einem PCR-Röhrchen.
- Hinzufügen RNase-freiem destilliertem H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul und beschallen die gepoolten Embryonen für 30 sec bei 200 W. der RT - Reaktion initiieren sofort bei 42 ° C für 1 Stunde , gefolgt von 5 min Inkubation bei 95 ° C.
- Für jede 5,0 ul cDNA - Lösung erzeugt wird , führen normalen PCR - Amplifikation mit Primern für Neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, oder β-Aktin (Primersequenzen in Tabelle 1 ist . PCR besteht aus 40 Zyklen von 15 sec Inkubation bei 95 ° C, 30 sec bei Glühtemperatur (gezeigt in Tabelle 1) und 30 sec bei 72 ° C.
- Getrennte PCR-Produkte durch Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel und zu visualisieren, das Gel unter UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid.
- Normalisieren Zielgenexpression gegen β-Actin-Ebenen.
4. Immuncytochemie von Embry
- Fix Embryonen aus jeder Stufe mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei Raumtemperatur durch eine kurze Wasch gefolgt 3 mal mit PBS 0,01% BSA enthält.
- Permeabilisieren Zellmembranen von 10 Embryonen Inkubieren in 1,0 ml PBS, enthaltend 0,1% Tween 20 und 0,1% Triton X-100 bei Raumtemperatur für 10 min.
- So blockieren unspezifische die permeabilisierten Embryonen in 1,0 ml PBS Bindung Inkubation mit 10% normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die blockierten Embryonen Witzh Kaninchen-anti-Neogenin Antikörper bei 1: 100 Verdünnung in PBS, enthaltend 0,1% BSA über Nacht bei 4 ° C.
- jeder in Tropfen PBS Nach dreimaligem Waschen für 30 sec, inkubieren Embryonen entweder mit Alexa 488-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG oder Alexa 568-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG bei 1: 500-Verdünnung in PBS / BSA-Lösung über Nacht bei 4 ° C .
- An Aktinfilamente visualisieren, inkubieren Embryonen in 1 & mgr; g / ml Phalloidin in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Beflecken die Kerne durch Zugabe von 5 ml PBS, die 1 & mgr; g / ml DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid) für 5 min bei Raumtemperatur.
- Wash Embryonen dreimal kurz mit PBS.
- Übertragen Embryonen auf einen Glasobjektträger und bedecken sie mit einem Tropfen Mineralöl.
- Nehmen Bilder bei 1,000x Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop mit einem Anregungs der geeigneten Wellenlänge.
5. Herstellung von Neogenin-RFP und Neogenin-siRNA GFP Plasmide
- Subklonen cDNA, die Maus Neogenin in ein rot fluoreszierendes Protein (RFP) enthaltenden Vektor, was zu Neogenin-flag-RFP.
- Subklon RNA small hairpin Neogenin in ein Emerald Green Fluorescent Protein Targeting (EmGFP) enthaltenden Vektor, was in pcDNA-EmGFP-miR-Neogenin (in Abbildung 1 gezeigt).
- Amplify beide Neogenin-flag-RFP und pcDNA-EmGFP-miR-Neogenin Plasmide und reinigen sie mit herkömmlichen Methoden.
- Stellen Sie die Endkonzentrationen von Plasmiden auf ~ 1,0 & mgr; g / ml in sterile Tris-EDTA (TE) Puffer.
6. Mikroinjektion von Plasmiden in 2-PN Embry
- Waschen Sie die entblößte 2-PN Embryonen einmal, kurz, mit frischen M16 Medien.
- Zentrifugieren der 2-PN Embryonen für 10 min bei 1000 xg in einer Tischzentrifuge zur Beobachtung der Pronuclei zu erlauben.
- Inkubiere die Embryonen in einem Mikrotropfen von 20-30 & mgr; l M16 Medien pro Embryo unter Mineralöl bei 37 ° C in 5% CO 2 für eine additional 1-2 Std.
- Herstellung Injektion Pipetten und halten Pipetten durch Ziehen Borosilikat-Glaskapillarröhren (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) mit einem mechanischen Puller.
- Fabrizieren Injektion Pipetten stumpfen Spitzen und polierten Öffnungen von <500 & mgr; m Spitzenlänge zu haben und 1-2 um Spitze Innendurchmesser ein microgrinder und microforger verwenden.
- Fabrizieren Pipetten halten, so dass sie stumpfen Spitzen und polierten Öffnungen mit einem Innendurchmesser von 20 & mgr; m und einem Außendurchmesser von 100 & mgr; m haben.
- Lastinjektionspipetten mit einer ausreichenden Menge (> 200 nl) der Plasmid-Lösung mit 1,0 ug / ul.
- Microinject ~ 10 pl von Plasmid-Lösung für jede 2-PN Embryo in einen der Vorkerne eine Mikroinjektors an einem motorisierten Mikromanipulator angebracht verwendet wird; Während dieses Vorgangs halten Embryonen in Position durch Unterdruck mit einer Haltepipette aufgebracht wird.
- Nach Mikroinjektion, waschen Sie die 2-PN Embryonen 3-mal mit frischem M16 Medien für less als 1 min jedes Mal.
- Kultur Die 2-PN Embryonen in einem Tropfen frisch M16 Medien auf einer Plastikkulturschale mit einer Mineralöltropfen abgedeckt Medien Verdampfung zu verhindern.
- Beachten Sie die Embryonen bei 24 Stunden Abständen unter einem Differentialinterferenzkontrast (DIC) inverses Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung.
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Ergebnisse
Wir entdeckten , dass Neogenin vorübergehend in den frühen Entwicklungsstadien von preimplantation Maus - Embryonen, erscheinen so früh wie in der 2-Zellstadium und nachhaltig bis in die frühen Morula ausgedrückt wird , aber am Ende Morula defizienten immer und Blastozyste Stufen (2A). Zusätzlich wurde die räumliche Verteilung der Neogenin beschränkt hauptsächlich außerhalb der Zellen. Die Ergebnisse der RT-PCR - Analyse wurden im Einklang mit der frühen und vergängliche...
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Diskussion
Im vorliegenden Protokoll zeigen wir neue Verfahren der Mikroinjektion von genetischen Materialien, entweder cDNA oder shRNA, in die 2-PN Maus-Embryonen, die Rolle der Neogenin in der frühen Zelldifferenzierung während der Maus Embryonalentwicklung zu erkunden. Genetische Veränderung von Präimplantationsembryonen ist eine leistungsstarke Technik in die wichtigsten Informationen über zugrunde liegenden molekularen Mechanismen aufzudecken für zum Beispiel die erste Zelllinie Bestimmung. Genetische Modifikation ist eine de...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich auch Dr. Xiong Gruppe an der Georgia Health Sciences University für die Herstellung und die gemeinsame Nutzung der Konstrukte für Neogenin cDNA und shRNA Vektoren zu bestätigen. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Basic Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) gefördert von der koreanischen Forschungsgemeinschaft und durch ein Forschungsstipendium von Sahmyook Universität unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| M16 | mittel,Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Ziegenserum, | Dako (Glostrup, Dänemark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineralöl | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| humanes Choriongonadotropin und trächtiges Stutenserum Gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transkriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR vor der Mischung | ( Bioneer, Daejon, Südkorea) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agarose (molekulare Qualität) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyd-Lösung, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyklonaler Kaninchen-Anti-Neogenin-Antikörper | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa Fluor 488 markierter Anti-Kaninchen-Antikörper | Molekulare Sonden (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa Fluor 555 markierte Anti-Kaninchen-Antikörper | Molekulare Sonden (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molekulare Sonden (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Rekombinante humane RGM-C/Hämojuvelin | R&;D Systeme | 3720-RG | |
| alle Plasmidkonstrukte | Prof. Wen Cheng Xiong an der Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | Für die vorliegenden Studien wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt | |
| Neon® Transfektionssystem | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Mikromainpulationssystem mit Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Halterung | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| Mühle | Narishige | EG400 | |
| Abzieher | Sutter Instrumnet Company | P-97 | |
| CO2 Inkubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermocycler | LifeTechnologies | 4388444 |
Referenzen
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