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Methodenartikel

Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

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DOI:

10.3791/53704

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26. Oktober 2016

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1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Injizierbare tissue engineering Gerüst aus Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Mikroteilchen (PNIPAAm-g-CS) -haltigen Alginat besteht, wurde hergestellt. Die Haftfestigkeit, Quelleigenschaften und Biokompatibilität in vitro sind in dieser Studie untersucht. Die Charakterisierungstechniken hier entwickelt, können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

Zusammenfassung

Injizierbaren Biomaterialien als implantierbare Materialien definiert , die in den Körper als eine Flüssigkeit eingeführt werden kann und in situ verfestigt. Solche Materialien bieten die klinischen Vorteile der minimal-invasiv implantiert wird und leicht raumfüllende Feststoffe in unregelmäßig geformten Defekte bilden. Injizierbaren Biomaterialien wurden als Gerüste für Tissue Engineering umfassend untersucht. Jedoch für die Reparatur von bestimmten lasttragenden Bereiche im Körper, wie beispielsweise die Bandscheibe sollte Scaffolds Klebeigenschaften besitzen. Dadurch wird die Gefahr der Dislokation während der Bewegung zu minimieren und einen innigen Kontakt mit dem umgebenden Gewebe gewährleistet, eine ausreichende Kraftübertragung bereitstellt. Hier beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung eines Gerüstes, bestehend aus thermisch sensitive poly (N-Isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat (PNIPAAm-g-CS) und Alginat-Mikropartikel. Die PNIPAAm-g-CS-Copolymer bildet eine viskose Lösung in Wasser bei RT, in die alginate Partikel suspendiert Adhäsion zu verbessern. Oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST), um die 30 ° C, bildet das Copolymer ein festes Gel um die Mikropartikel. Wir haben Standard Biomaterialien Charakterisierungsverfahren angepasst zu berücksichtigen, die reversible Phasenübergang von PNIPAAm-g-CS. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einbau von 50 oder 75 mg / ml Alginat Partikel in 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS-Lösungen die Haftzugfestigkeit von PNIPAAm-GCS allein (p <0,05) zu vervierfachen. Der Einbau von Alginat-Mikropartikel ebenfalls wesentlich erhöht Quellungsvermögen PNIPAAm-g-CS (p <0,05) und hilft, eine raumfüllende Gel innerhalb von Gewebedefekten zu halten. Schließlich Ergebnisse der in vitro - Toxikologie-Testkit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT) und Live / Dead Lebensfähigkeitstest zeigen , dass die Klebstoff in der Lage ist, das Überleben und die Proliferation von verkapselten menschliche embryonale Nierenstütz (HEK) 293-cells über 5 Tage.

Einleitung

Injizierbaren Biomaterialien sind diejenigen , die bequem in den Körper als eine Flüssigkeit geliefert werden und in situ verfestigen. Solche Materialien wurden ausführlich in der regenerativen Medizin angewendet, wo sie für die Zellen 5 werden verwendet , um eingekapselten Zellen in das betroffene Seite 1-4 und wirken als dreidimensionale temporäre extrazellulären Matrix zu liefern. Für den Patienten sind injizierbare Biomaterialien vorteilhaft, weil die chirurgische Verfahren zur Implantation minimal invasiv sind und die feste Phase unregelmäßig Gewebedefekte zu füllen geformt, wodurch die Notwendigkeit für kundenspezifische Größe Implantate zu beseitigen.

Injizierbarkeit kann durch eine Vielzahl von Mechanismen erreicht werden. Externe Faktoren, wie pH - Wert, wurden als Auslöser für die Bildung von Gelen untersucht , die 6-8 - Zellen und bioaktiven Molekülen einzukapseln. Jedoch pH darf nicht die praktischste Trigger sein, alle physiologischen Umgebungen zu verwenden, bei. Ein weiteres traditionelles Alternative für Einspeiseleistung Erreichung der in situ chemische Polymerisation oder Vernetzung verwendet. Eine Gruppe entwickelt , die ein wasserlösliches Redoxsystem bestehend aus Ammoniumpersulfat und N, N, N ', N' N' - Tetramethylethylendiamin und verwendet sie für Makromere , bestehend aus Polyethylenglykol und Poly (propylen) glycol 9,10 reagiert. Zan et al. 11 entwickelten injizierbare Chitosan Polyvinylalkohols Netzwerke vernetzt mit Glutaraldehyd. In solchen Systemen muß die Zytotoxizität von reaktiven Komponenten in Betracht gezogen werden, insbesondere für Anwendungen, bei denen Zell Verkapselung. Auch könnte exotherme Polymerisation hoch genug Temperaturen erzeugen umgebende Gewebe zu beeinträchtigen, über die berichtet wurde , für polymere Knochenzemente 12,13.

Noch andere injizierbare Polymersysteme entwickelt worden, die einen Wechsel von der flüssigen in den festen Zustand mit der Temperatur als Auslöser aufweisen. Bekannt als thermogelierende Systeme, das sind aqueous Polymerlösungen , die in - situ - Bildung zu erzielen 14 keine chemischen Stimulus, Monomere oder Vernetzer erfordern. Vielmehr üblicherweise ein Phasenübergang in der Nähe von physiologischen Temperatur auftretenden induziert die Bildung eines physikalisch vernetzten dreidimensionalen Netzwerk. Poloxamere wie Pluronic F127 gehören zu den am häufigsten untersuchten Polymere für thermogelierenden Arzneimittelverabreichungs 15-17 und Zellverkapselung 18,19. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass diese Gele Stabilität bei physiologischen Bedingungen fehlen. Studien haben gezeigt , eine erhöhte Stabilität 21,22 mit Kettenverlängerungs 20 oder chemischen Vernetzer. Dennoch ist die Verwendung dieser Reagenzien kann das Potential der Materialien für die Verkapselung von Zellen begrenzen.

Poly (N-isopropylacrylamid) ist ein synthetisches thermogelierende Polymer , das 14 große Aufmerksamkeit im Tissue Engineering und Drug Delivery erhalten hat. Wässrige Lösungen von Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) zeigen eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST), auftretende typischerweise etwa 32 bis 34 ° C 23,24. Unterhalb der LCST, Hydrate Wasser PNIPAAm Ketten. Oberhalb der Übergangstemperatur wird das Polymer hydrophob, was zu einer dramatischen Phasentrennung 25-27 und die Bildung eines festen Gels , ohne die Verwendung von toxischen Monomere oder Vernetzer. Jedoch zeigen PNIPAAm Homo elastischen Eigenschaften schlecht und wenig Wasser bei physiologischer Temperatur halten aufgrund der Hydrophobizität 28. In dieser Arbeit wählen wir Chondroitinsulfat kovalent in das PNIPAAm Netzwerk zu integrieren, die das Potenzial für die enzymatische Abbaubarkeit bietet 29, anti-inflammatorische Aktivität 30,31 und erhöhte Wasser- und Nährstoffaufnahme 32. PNIPAAm Copolymere mit CS wurden in unserem Labor hergestellt, indem das Monomer NIPAAm in Gegenwart von Methacrylat-funktionalisierten CS Polymerisieren gepfropfte Copolymer (PNIPAAm-g-CS) zu bilden. BecAUSE der geringen Vernetzungsdichte des Copolymers bildet PNIPAAm-g-CS eine viskose Lösung in Wasser bei RT und ein elastisches Gel bei physiologischer Temperatur aufgrund der LCST 29. Die Polymerlösungen werden erneut fließfähig auf unterhalb der LCST Abkühlung aufgrund der Reversibilität des Übergangs.

Wir haben gezeigt , dass PNIPAAm-g-CS das Potential hat als Tissue Engineering Gerüst zu dienen, aufgrund von mechanischen Eigenschaften , die angepasst werden können, Abbaubarkeit und cytocompatibility mit humanen embryonalen Niere (HEK) 293 - Zellen 29. Jedoch in bestimmten lasttragenden Bereichen, wie der Bandscheibe, Tissue Engineering Scaffolds sollte die Fähigkeit haben , eine wesentliche Schnittstelle mit umgebenden Scheibengewebe zu bilden , das Risiko einer Luxation 33 zu beseitigen. Diese Schnittstelle ist auch notwendig für die angemessene Kraftübertragung über die Grenzfläche zwischen dem Implantat und dem Gewebe 33. In unserer Arbeit haben wir ausgesetzt einlginate Mikropartikel in wässerigen Lösungen von PNIPAAm-g-CS und fanden , daß eine Gelierung der Mikropartikel lokalisiert, die mit 34 umgebendes Gewebe Adhäsion bereitzustellen. In diesem Papier beschreiben wir die Schritte zur Herstellung des thermogelierende, Klebstoffpolymer. Standardtechniken zur Charakterisierung von Biomaterialien, Cell Imaging und Assays für die Lebensfähigkeit wurden die Temperaturempfindlichkeit des Polymers und die Reversibilität der Phasenübergang zu berücksichtigen angepasst. Die injizierbare Polymer in diesem Papier beschrieben hat breite Potenzial für die Arzneimittelabgabe und Tissue-Engineering-Anwendungen außerhalb der in diesem Papier beschrieben. Außerdem hier beschriebenen Charakterisierungsmethoden können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

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Protokoll

1. Poly (N-isopropylacrylamid) -g-Chondroitinsulfat Synthesis

  1. Vor der Synthese des bioadhäsive Hydrogel, zu reinigen N-Isopropylacrylamid (NIPAAm) monomer und Methacrylat Chondroitinsulfat (CS).
    1. Gewicht von mindestens 10 g NIPAAm und das Monomer in 400 ml n-Hexan bei 60 ° C auflösen. Rühren Sie die Behälter in regelmäßigen Abständen bis zur vollständigen Auflösung. Rekristallisieren der Lösung in einem -20 ° C Gefrierschrank für 24 Stunden.
    2. Entfernen des kristallisierten Monomer aus dem Behälter und Vakuumfilter das n-Hexan unter Verwendung eines Büchner-Trichters. Platzieren des Monomers in einem Vakuumofen bei RT für 24 h alle verbleibenden n-Hexan zu entfernen. Lagern Sie das Monomer in einem -20 ° C Gefrierschrank für eine spätere Verwendung (siehe Schritt 1.2).
    3. Abwiegen und 2,0 g Chondroitinsulfat lösen sich in 8,0 ml VE-Wasser. erhitzen Sie vorsichtig die Lösung auf 60 ° C.
    4. Der pH-Wert der Lösung auf 10 unter Verwendung von etwa 10 bis 40 & mgr; l von 50% (w / w) NaOH.
    5. In 0.298 ml Methacrylsäureanhydrid (MA). Reflux für 24 h, während bei 60 ° C gerührt wurde.
    6. Gießen Sie 400 ml Acetonlösung in ein Gefäß und Chill O / N in einem -20 ° C Gefrierschrank.
    7. Nach 24 Stunden vergangen sind, langsam die gesamte methacrylierten CS (mCS) -Lösung in 400 ml kaltem Aceton gießen, während mit einem magnetischen Rührstab gerührt.
    8. Entfernen Sie die MCs aus dem Aceton und legen Sie den Niederschlag in einem Vakuumofen. Führen Sie diesen Schritt schnell ein intaktes und Kohäsions Zustand für MCs aufrechtzuerhalten. Lassen Sie das Restaceton unter Vakuum verdampfen mindestens 24 Std.
  2. Co-Auflösen von 10 g gereinigtem NIPAAm und 2.209 g mCS in 232 ml deionisiertem Wasser hergestellt.
  3. Spülen Sie die Lösung von Sauerstoff unter Verwendung von inerten Stickstoffgas. Halten Sie einen kräftigen, aber dennoch niedrigen Gasflussrate der Lösung aus sprudelnden über 15 min zu verhindern.
  4. Weiter die Lösung mit Stickstoffgas gespült und fügen 0,976 ml tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Als nächstes initiieren, indem man 97,6 mg Ammoniumpersulfat (APS) die Polymerisationsreaktion.
  6. Mischen Sie die Lösung für etwa 20 Sekunden und schnell die Lösung versiegeln jedes Eindringen von Luft in den Behälter zu verhindern. Lassen Sie die Lösung für 24 Stunden unter Fluoreszenzlicht zu polymerisieren.
  7. Nach 24 Stunden, stellen Sie das Reaktionsgefäß in einen Ofen 37 ° C. Ermöglichen das Hydrogel von einer Flüssigkeit in einen gelartigen Zustand übergeht. Unterzutauchen das polymerisierte Hydrogel in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für insgesamt 7 Tage für die Diffusion von nicht umgesetztem Monomer aus dem Hydrogel zu ermöglichen.
  8. Verwendung einer Schere geschnitten, das Hydrogel in mehrere kleine Stücke, die nicht größer als 5 cm im Durchmesser. Um das Hydrogel verhindern einen gelartigen Zustand in einen flüssigen Übergang aus, Würfel, das Polymer in der 37 ° C-Lösung PBS. Übertragen Sie die Portionen in 50 ml konischen Röhrchen.
  9. Bereiten Sie die Proben für die Gefriertrocknung durch die Wipfel Einwickeln vondie Rohre mit Kimwipes und Gummibänder. Einfrieren der Rohre bei -70 ° C für 1 bis 2 Stunden.
  10. Platzieren Sie die konische Röhrchen auf dem Gefriertrockner das gesamte Wasser aus dem Hydrogel zu entfernen. Vor der Inbetriebnahme muß der Gefriertrockner mit einer Temperatur und einem Druck von etwa -40 ° C und 0,04 mbar, jeweils zu erreichen. Ein Minimum von 7 Tagen zur vollständigen Trocknung erforderlich.
  11. Grind der gefriergetrockneten Polymers zu einem feinen Pulver und Speicher in einem 4 ° C Kühlschrank für eine spätere Verwendung (siehe Schritt 3.1).

2. Calcium-Alginat Vernetzte Mikroteilchen Synthese

  1. Vorbereiten eines 2% (w / v) Alginatlösung durch Auflösen von 400 mg in 20 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird auf etwa 60 ° C die Auflösung zu erleichtern.
  2. Vorbereiten eines 2% (w / v) Calciumchlorid-Lösung durch Zugabe von 400 mg zu 20 ml entionisiertem Wasser.
  3. Erstellen eine Öl in Wasser-Mischung durch Kombination von 100 ml Rapsöl, 1,0 ml Tween 20, und 20 mlvon 2% (w / v) Alginat. Emulgieren der Mischung für 10 min mit einem Homogenisator bei 15000 Umdrehungen pro Minute. Zusätzlich bei 200 Umdrehungen pro Minute oder 2000 Umdrehungen pro Minute mit einem magnetischen Rührstab mischen bzw. große oder kleine Mikropartikel zu erzeugen.
  4. Absaugen 2% (w / v) Calciumchlorid-Lösung mit einer Spritze mit einer 18 G Nadel Spitze verwendet wird. Langsam in die Emulsion, die Calciumchlorid tropfenweise.
  5. Sobald die 20 ml Calciumchlorid erschöpft sind, ermöglichen die Mikropartikel in der Emulsion 10 min zu vernetzen.
  6. gleichmäßig zu verteilen, die Charge von Mikroteilchen in gekappt 50 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bis zu einer Kraft von 1.400 × g für 2 min die anfängliche Schicht von Rapsöl zu entfernen.
  7. Nacheinander waschen, Wirbel und Zentrifuge die Mikropartikel mit Isopropanol restliche Rapsöl zu entfernen, insgesamt dreimal bei 1.400 g für 2 min. Entsorgen Sie das Isopropanol Überstand nach jedem Zentrifugationsschritt und waschen mit frischem Isopropanol.
  8. Sobald die oil entfernt wurde, wiederholen Sie den Waschvorgang noch dreimal mit entsalztem Wasser restliche Isopropanol zu entfernen. Entsorgen Sie das VE-Wasser-Überstand nach jedem Zentrifugationsschritt und waschen mit frischem entionisiertem Wasser. Entfernen Sie etwa 100 mg der nassen Mikropartikel und lagern in einem Fläschchen. Die nassen Mikropartikel werden verwendet, um den durchschnittlichen Durchmesser der Charge unter dem Lichtmikroskop zu messen.
    1. Mit Hilfe der Lichtmikroskopie, dispergieren, um eine kleine Probe der feuchten Mikropartikel in entsalztem Wasser auf einem Objektträger. Je nach Größe der Mikropartikel, ein 10X oder 20X Ziel verwenden, und die numerische Apertur einzustellen, bis die Teilchen in den Fokus kommen. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop für die richtige Ziel kalibriert ist und die Helligkeit der Lichtquelle nach Bedarf anpassen. Verwenden Sie eine Linie Werkzeug, um den längsten Durchmesser von 50 zufällig Alginat-Mikropartikel und erhalten eine durchschnittliche Größe für die Charge zu messen.
  9. Bereiten Sie die Mikropartikel für die Lyophilisation by sie mit Kimwipes Einwickeln und sie mit Gummibändern zu befestigen. Einfrieren der Mikropartikel bei -70 ° C für 1 Stunde.
  10. Platzieren der Mikropartikel auf dem Lyophilisator und ermöglichen die Probe für mindestens 24 Stunden zu trocknen. Grind die gefriergetrockneten Mikropartikel zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel und Speicher in einem 4 ° C Kühlschrank für eine spätere Verwendung (siehe Schritt 3.3).

3. Herstellung der Klebstoffe

  1. in 1 ml 1x PBS unter Verwendung des gefriergetrockneten Polymerpulver, schaffen eine 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS-Lösung von 50 mg Hydrogel-Pulver aufzulösen.
  2. Mischen Sie die Lösung einen Wirbel und Kälte im Kühlschrank bei 4 ° C für 24 Stunden unter Verwendung.
  3. Sobald die viskose Lösung bildet eine homogene Zusammensetzung verursachen durch Zugabe von 25 oder 50 mg gefriergetrocknete Alginat-Mikropartikel zu dem Hydrogel-Lösung und Wirbel. Lagern Sie den Composite in einem Kühlschrank bei 4 ° C für die spätere Verwendung (siehe Schritte 4.3 und 4.8).

4. Bioadhäsive Mechanisch Zugversuche

  1. Vor der Zugversuche durchführen, extrahieren Knorpelsubstrat aus einem Schweineohr.
    1. Auftauen ein porcine Ohr in einem warmen 0.9% (w / v) NaCl-Lösung; Dies wird dazu beitragen, um das Gewebe zu lösen.
    2. Mit einem Skalpell isolieren und Abschnitt aus einer flachen, rechteckigen Bereich von vertikal obwohl die epidermale Schicht, subkutane Gewebe schneiden, und Knorpel. Vermeiden Sie die gekrümmten Rippen des Schweine-Ohr schneiden.
    3. Trennen Sie die epidermalen Schicht der Haut aus dem Knorpel durch parallel durch das subkutane Gewebe zu schneiden. Der Knorpel ist ein hartes, weißes Gewebe unter der Schweinehaut gefunden.
    4. Sorgfältig schaben das subkutane Gewebe, das an den Knorpel mit der Seite des Skalpells angebracht ist. Vermeiden Sie in das Knorpelgewebe mit dem Skalpell zu schneiden.
    5. Stellen Sie sicher, dass nur eine Seite der Knorpel freigelegt und flach bei Zugversuch. Falls erforderlich, glätten die Knorpel durch die unebene Haut auf der Unterseite abschneiden.
    6. Schneiden Sie das Knorpelgewebe in mehrere Stücke mit den Abmessungen von 1 cm x 1 cm. Speichern das Knorpelgewebe in konische Röhrchen mit 0,9% gefüllt (w / v) NaCl-Lösung in einen -20 ° C Gefrierschrank.
  2. Bereiten 2,0 L von 0,9% (w / v) NaCl-Lösung. Vorheizen Salzlösung auf 37 ° C. Die Temperatur dieser Lösung müssen während des Tests beibehalten werden.
  3. Tauen der gefrorenen Knorpel. Halten Sie sowohl die Schweineknorpel und die Hydrogel-Proben in einem Styropor-Behälter mit Eisbeutel.
  4. Bringen Sie das Kraftmessgerät auf den Arm des Prüfstandes. Legen Sie eine Heizplatte auf der Oberseite des Kraftständer und die Temperatur auf 50 ° C.
  5. Affix eine 1 cm x 1 cm großes Stück Knorpel an der Edelstahlblock mit Sekundenkleber und einer Pinzette. Kleben Sie ein zusätzliches Stück Knorpel an den Delrin Zylinder und befestigen Sie den Zylinder mit dem Kraftmessgerät. Es ist sehr wichtig, dass beide Knorpeloberflächen einander zugewandt sind und das Hydrogel in Verbindung.
  6. Ortdas Plexiglas Wasserbad auf der heißen Platte und legen Sie die Edelstahlblock mit dem Knorpel Substrat innerhalb des Bades.
  7. Senken Sie den Arm des Prüfstandes und richten Sie beide Knorpel Substrate miteinander. Heben Sie den Arm und lassen Sie genügend Raum um das Hydrogel anzuwenden.
  8. Mit einer Verdrängerpipette verzichten 200 ul des bioadhäsive Hydrogel auf den Boden Stück Knorpel.
  9. Senken Sie den Arm des Kraft Stand auf 1 mm / min, bis die Hydrogel in Kontakt mit dem oberen Stück Knorpel und übt eine Vorspannkraft von 0,001 N.
  10. Gießen Sie die 37 ° C Salzlösung in das Bad, bis das Volumen der vorgesehenen Wasserstand erreicht. Überprüfen Sie die Temperatur der Lösung mit einem Thermoelement.
  11. Lassen Sie das Hydrogel für insgesamt 5 Minuten einzustellen. Sobald das Gel erstarrt ist, heben den Arm mit einer Geschwindigkeit von 2 mm / min. Der Test ist beendet, sobald die bioadhäsiven aus dem Knorpel Grund ablöst, oder wenn ein signifikanter Abfall in Kraft tritt,Signalisierungsausfall.
  12. Sammeln Sie die aufgezeichneten Daten und den Arm des Prüfstandes erhöhen. Entfernen Sie die Delrin Zylinder aus dem Kraftmessgerät. Gießen Sie die Salzlösung in seinen vorherigen Behälter und erhitzen auf 37 ° C.
  13. Berechnen Spannungen, die durch die Kraft Subtraktion durch das Polymer aus der Auftriebskraft eines "leeren" ausgeübt wird, die Delrin Befestigung ohne Knorpel oder Klebstoff, mit der gleichen Geschwindigkeit erhöht und durch die Bindungsfläche dividiert wird.

5. Geschwulst Studium der PNIPAAm-g-CS mit Alginate Mikroteilchen

  1. Bereiten Sie saubere Glasfläschchen und beschriften sie in geeigneter Weise mit einem Zeitpunkt, Probentyp und Probennummer. Die Klebstoffe können auch erzeugt werden, wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie insgesamt fünf Proben (n = 5) für jeden Probentyp pro Zeitpunkt.
  2. Pre-wiegen alle Glasgefäße und ihre Anfangsmasse bei RT aufzeichnen.
  3. Unter Verwendung einer Spritze, verzichtet werden ungefähr 0,4 ml der vorbereiteten Klebstoffprobe in jeden der fünf Vials.Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Probentyp in allen getesteten Zeitpunkten.
  4. Wiegen und die Masse jedes Fläschchen mit dem Klebstoff Probentyp bei RT aufzeichnen.
  5. Vorwärmen eine orbitale Inkubator und 1 l 1x PBS-Lösung auf 37 ° C.
  6. Organisieren Sie alle der Fläschchen auf einem Gestell, und legen Sie das Rack in den Inkubator. Erlauben die Klebstoffe für etwa 5 bis 10 min von einer Flüssigkeit in ein Gel zu überführen.
  7. 5,0 ml 1x PBS in jedes Fläschchen. Achten Sie darauf, sorgfältig die PBS-Lösung entlang der Seite des Fläschchens fügen Sie die Hydrogelscheibe Auseinanderbrechen zu verhindern.
  8. Kappe Jedes Fläschchen Verdampfung der PBS-Lösung und Aufrechterhaltung der Innentemperatur des Inkubator bei 37 ° C zu verhindern. Jeder Satz von Hydrogelscheiben müssen in PBS für eine bestimmte Zeitdauer unter Wasser zu bleiben.
  9. Nach einer 7-tägigen Zeitpunkt erreicht ist, den Satz von Fläschchen uncap und die PBS-Lösung von jedem Fläschchen entfernen. Wiegen jeder Flasche mit der Klebstoffprobe wieder bei RT.

6. Qualitative Zelllebensfähigkeit eines Live / Dead-Test unter Verwendung

  1. Vor der Durchführung der Live / Dead-Assay mit PNIPAAm-g-CS, wachsen menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (HEK-293) auf 80% Konfluenz.
    1. Schnell tauen die gefrorenen HEK-293-Zellsuspension durch die Cryovial in einem 37 ° C Wasserbad platziert, dann zentrifugiert werden die Zellen bei 400 × g bei 4 ° C für 5 min in einem 15 ml konischen Röhrchen.
    2. Um die erste Passage Zellwachstumsmedium bilden, verbinden in hoher Glukose (4,5 g / L) nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) in einer Endkonzentration von 20% und dem 100x Penicillin-Streptomycin-Lösung ( Pen-Strep) bis zu einer Endkonzentration von 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Für alle anderen Passagen, wechseln Sie in DMEM mit 10% FBS und 1x Pen-Strep.
    3. Zellpellet in 10 ml Wachstumsmedium und übertragen Sie die Suspension in einem Durchmesser von 100 mm Petrischale. gleichmäßig distribute die Zellen vorsichtig die Schale vorne Kippen nach hinten und links ein paar Mal pro Richtung nach rechts.
    4. Kultur der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. Falls nötig, ändern Sie das Medium alle zwei Tage.
    5. Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, replizieren die Kultur in mehrere Gerichte. Entfernen Sie das Medium von der Platte.
    6. 1 ml 0,5% Trypsin zu der Platte. Erlauben die Platten für 10 min bei 37 ° C inkubieren. Überprüfen Sie, ob die Zellen von der Oberfläche lösen, indem die Platte leicht schwenken.
    7. Zum Aufspalten des Kultur 1:10 fügen 9 ml regelmäßigen Wachstumsmedium (DMEM mit 10% FBS) in die Zellen trypsiniert und vorsichtig durch Kippen der Schale mischen.
    8. Dispense 1 ml der verdünnten Zellsuspension in jede neue Schale und fügen 9 ml des Wachstumsmediums. Vorsichtig mischen durch das Kippen der Schale.
    9. Kultur der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. Falls erforderlich, das Medium wechseln jey 2 Tage, bis die Zellen erreichen 80% Konfluenz.
  2. Entfernen Sie die Medien aus zwei Kulturschalen zu 80% Konfluenz gezüchtet.
  3. 1 ml 0,5% Trypsin zu jeder Platte. Erlauben die Platten für 10 min bei 37 ° C inkubieren. Überprüfen Sie, ob die Zellen von der Oberfläche lösen, indem die Platte leicht schwenken.
  4. Waschen Sie die HEK-293-Zellen auf der Platte mit 3 ml Wachstumsmedium zweimal und fügen beide Suspensionen auf den gleichen 15 ml konischen Röhrchen.
  5. Zentrifugieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen für 10 min bei 400 × g bei 4 ° C.
  6. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 3 ml Medium durch Pipettieren von oben und unten.
  7. Pipette 10 ul der Zellsuspension in einen Hämocytometer und führen eine Zellzahl der Zelldichte zu bestimmen. Erhöhen Sie die Suspension Volumen des Mediums, wenn die anfängliche Zellkonzentration zu hoch ist, und umgekehrt die Lautstärke zu verringern, wenn die Konzentration zu niedrig ist, um ein Ziel concent zu erhaltenration von 1 x 10 6 Zellen / ml. Zentrifuge die HEK-293-Zellen bei 400 xg und das Zellpellet in dem korrigierten Volumen der Medien resuspendieren entsprechend.
  8. verwirbeln vorsichtig die Zellsuspension und gleichmäßig in die Zelle Mischung in vier separate 15 ml konische Röhrchen für die folgenden Testbedingungen verteilen: positive Kontrolle einschichtige, negativ getötet Kontrolle in PNIPAAm-g-CS unter Verwendung von 70% (v / v) Methanol, HEK-293 Zellen eingekapselt in PNIPAAm-g-CS und HEK-293-verkapselten Zellen in PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel.
  9. Erstellen Sie positive Kontrolle Monolayern durch Pipettieren von mehreren 300 & mgr; l Volumen der Zellmischung in eine 24-Well-Platte 4-6 Wiederholungsproben zu erzeugen.
  10. Entfernen Sie die Medien aus den konischen Rohren im Zusammenhang mit der getöteten Kontrolle, PNIPAAm-g-CS und PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel.
    1. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen für 5 Minuten bei 400 · g und entfernen Sie den Überstand.
    2. Pflegen Sie die gleiche Zellkonzentration durch Resuspendieren des cells in dem gleichen Volumen PNIPAAm-g-CS als entfernt Medien. Pipette, um die Polymerzelle Mischung nach oben und unten eine serologische Pipette bis zur Homogenität unter Verwendung.
      1. Wenn mit Alginat-Mikropartikel Säen, übertragen Sie die PNIPAAm-g-CS-Zellsuspension (erhalten wie für 6.10.2 beschrieben) in eine 35 mm Kulturschale und einzuführen, um die Partikel in die Mischung. Pipette, um die Zellmischung nach oben und unten eine serologische Pipette bis zur Homogenität unter Verwendung.
    3. Verwendung der serologischen Pipette verzichtet werden mehrere 300 & mgr; l der Polymerzellmischung in jede der Vertiefungen für getötet Kontrolle PNIPAAm-g-CS und PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel zu erzeugen, von 4 bis 6 Wiederholungsproben.
  11. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 10 bis 15 min und damit die PNIPAAm-g-CS von einer Flüssigkeit in ein Gel übergehen (das Polymer bildet eine opake, weiße disc).
  12. Positionieren Sie eine Folie wärmer in der Motorhaube und die Temperatur auf 37 ° C. Mit dem Schiebe wärmer Well-Platte haltenTemperatur und Pipette 600 ul vorgewärmte Medium in jeder Vertiefung. Um den Übergang des Polymers in einen flüssigen Zustand zu verhindern, positionieren, um eine Lampe mit einer Leuchtstofflampe über dem Gericht die Luft über sie zu erwärmen.
  13. Inkubiere die Zellen für 5 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  14. Nach fünf Tagen verstrichen sind, bereiten Sie die Live / Dead Farbstoff-Mix Ethidiumhomodimer mit (EthD-1) und Calcein Uhr. Beide Substanzen sind lichtempfindlich und am Tag der Verwendung hergestellt.
    1. Tauen Sie das Calcein AM und EthD-1 aus dem Kit bei RT.
    2. 5 ml sterile 1x PBS auf eine konische Röhrchen und wickeln Sie es in Alufolie.
    3. Hinzufügen, 6,67 & mgr; l von 2 mM EthD-1 zu dem konischen Rohr. Vortex die Lösung Mischung gründlich.
    4. Als nächstes wurden 2,5 ul 4 mM Calcein AM zum konischen Röhrchen hinzufügen. Vortex die Mischung gründlich.
  15. Entfernen Sie die Medien aus den Vertiefungen der Monoschicht (positive Kontrolle), PNIPAAm-g-CS und PNIPAAm-g-CS Witzh Alginat-Mikropartikel. Waschen Sie alle Vertiefungen gründlich, aber sanft, mit PBS und entfernen Sie die PBS.
  16. Lassen die Hydrogelscheiben Alginat-Mikropartikel enthält, bei RT zu verflüssigen und mit 2 ml 50 mM Natriumcitrat zu jeder der Vertiefungen.
  17. Entfernen Sie die Medien aus den getöteten Zell Brunnen (Negativkontrolle). Lassen Sie die Hydrogelscheiben bei RT zu verflüssigen, und 300 & mgr; l von 70% (v / v) Methanol in jede Vertiefung.
  18. Inkubiere die Platte für 45 min bei 37 ° C.
  19. Entfernen Sie die Natriumcitrat und Methanollösungen aus den Vertiefungen und jeder der Hydrogel-Suspensionen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Zentrifugiere die Röhrchen bei 2.000 xg für 10 min, um die Zellen aus der Hydrogel-Suspension zu trennen.
  20. durch Pipettieren der Lösung aus dem konischen Rohr und Zurücklassung dem Zellpellet vorsichtig die Suspension entfernen. Das Pellet in 300 ul PBS und Transfer zum Original-Well-Platte.
  21. In 300 ul ter Live / Dead-Farbstoff-Mix zu jedem der Wells. Wickeln Sie die Well-Platte in Aluminiumfolie und Inkubation für 45 min auf einer Wippe bei RT.
  22. Bild alle Proben unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einem 10X-Objektiv. Lebenden Zellen und abgetöteten Zellen wird eine grüne und rote Fluoreszenz zeigen, respectively.

7. Quantitative Zelllebensfähigkeit eines XTT-Assay unter Verwendung

  1. Wachsen HEK-293-Zellen auf 80% Konfluenz. Entfernen Sie die Wachstumsmedien aus zwei Kulturschalen.
  2. 1 ml 0,5% Trypsin zu jeder Platte. Erlauben die Platten für 10 min bei 37 ° C inkubieren. Überprüfen Sie, ob die Zellen von der Oberfläche lösen, indem die Platte leicht schwenken.
  3. Waschen Sie die HEK-293-Zellen auf der Platte mit 3 ml Medium zweimal und fügen beide Suspensionen auf den gleichen 15 ml konischen Röhrchen.
  4. Zentrifugieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen für 10 min bei 400 × g bei 4 ° C.
  5. Entfernen Sie den Überstand und das Zellpellet in 3 ml Mediumdurch Pipettieren von oben und unten.
  6. Pipette 10 ul der Zellsuspension in einen Hämocytometer und führen eine Zellzahl der Zelldichte zu bestimmen. Wie zuvor beschrieben, eine Zielkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten. Zentrifuge die HEK-293-Zellen bei 400 xg und das Zellpellet in dem korrigierten Volumen der Medien resuspendieren entsprechend.
  7. verwirbeln vorsichtig die Zellsuspension und gleichmäßig in die Zelle Mischung in vier separate 15 ml konische Röhrchen für die folgenden Testbedingungen verteilen: positive Kontrolle einschichtige, negativ getötet Kontrolle in PNIPAAm-g-CS unter Verwendung von 70% (v / v) Methanol, HEK-293 Zellen eingekapselt in PNIPAAm-g-CS und HEK-293-verkapselten Zellen in PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel.
  8. Erstellen Sie positive Kontrolle Monolayern durch Pipettieren von 300 ul der Zellmischung in eine 24-Well-Platte 4 zu erzeugen - 6 Wiederholungsproben.
  9. Entfernen Sie die Medien aus den konischen Rohren im Zusammenhang mit der getöteten Kontrolle, PNIPAAm-g-CS und PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel.
    1. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen für 5 Minuten bei 400 · g und entfernen Sie den Überstand.
    2. Aufrechterhaltung der gleichen Zellkonzentration durch Resuspendieren der Zellen in dem gleichen Volumen PNIPAAm-g-CS als entfernt Medien. Pipette, um die Zellmischung nach oben und unten eine serologische Pipette bis zur Homogenität unter Verwendung.
      1. Wenn mit Alginat-Mikropartikel Säen, übertragen Sie die PNIPAAm-g-CS-Zellsuspension in eine 35 mm Kulturschale und die Partikel in die Mischung einführen. Pipette, um die Zellmischung nach oben und unten eine serologische Pipette bis zur Homogenität unter Verwendung.
    3. Verwendung der serologischen Pipette verzichtet werden 300 ul der Zellpolymermischung in jede der Vertiefungen für getötet Kontrolle PNIPAAm-g-CS und PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel zu erzeugen, von 4 bis 6 Wiederholungsproben.
  10. Sobald alle der zellhaltigen Proben wurden auf die Platte mit 24 Vertiefungen hinzugefügt wurde, verzichtet werden mehrere 300 & mgr; l Volumina PNIPAAm-g-CS und PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel ohne Zellen in benachbarten Vertiefungen zu erzeugen 4 - 6 Wiederholungsproben.
  11. Inkubiere die Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C für 10 bis 15 min und damit die PNIPAAm-g-CS von einer Flüssigkeit in ein Gel übergehen (das Polymer bildet eine opake, weiße disc).
  12. Positionieren Sie eine Folie wärmer in der Motorhaube und die Temperatur auf 37 ° C. Mit dem Schiebe wärmer und Plattentemperatur und Pipette 600 ul vorgewärmtes klar DMEM in jede Vertiefung halten. Um den Übergang des Polymers in einen flüssigen Zustand zu verhindern, positionieren, um eine Lampe mit einer Leuchtstofflampe über dem Gericht die Luft über sie zu erwärmen.
  13. Inkubiere die Zellen für 5 Tage bei 37 ° C bei 5% CO 2.
  14. Nach fünf Tagen verstrichen sind, bereiten die 2,3-Bis (2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-Tetrazolium-5-carboxanilid (XTT) Reagenz vom Hersteller. Das XTT-Reagenz ist lichtempfindlich und bereit, am Tag der Nutzung.
    1. Entfernen Sie die gelbe Flasche enthaltening das XTT Pulver aus dem Kühlschrank. Mit einer sterilen Spritze und Nadel, injizieren 5 ml klares DMEM (kein Phenol rot) durch das Gummiseptum in den bernsteinfarbenen Flasche.
    2. Wärme des Reagenzes auf 56 & deg; C in einem Wasserbad für 10 min oder bis gelöst.
    3. verdünnen ferner den XTT-Reagenz bis 20% (v / v) in einem 15 ml konischen Röhrchen in Aluminiumfolie eingewickelt. Aliquot der Überschuss XTT-Reagenz in Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in der -20 ° C Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.
  15. Entfernen Sie die Medien aus den getöteten Zell Brunnen (Negativkontrolle) und 300 & mgr; l von 70% (v / v) Methanol in jede Kavität. bei 37 ° C für 45 min inkubieren und das Methanol aus den Vertiefungen zu entfernen.
  16. Entfernen Sie die Medien aus den verbleibenden Vertiefungen der einschichtigen (positive Kontrolle), PNIPAAm-g-CS und PNIPAAm-g-CS mit Alginat-Mikropartikel. Waschen Sie alle Vertiefungen gründlich, aber sanft, mit PBS und anschließend die PBS zu entfernen.
  17. In 300 ul der 20% XTT-Reagens zu jedem der Wells. Wickeln Sie die 24-Well-Platte in Aluminiumfolie und Inkubation für 24 Stunden auf einer Wippe bei RT.
  18. Nach 24 Stunden wurden 200 ul 50 mM Natriumcitrat zu allen Vertiefungen hinzu und für eine weitere Stunde auf der Wippe inkubieren.
  19. Übertragen alle Polymersuspensionen in Mikrozentrifugenröhrchen und bei 2.000 xg für 10 min bei RT.
  20. Übertragung von 200 & mgr; l des Überstandes aus jedem Reaktionsgefäß in eine 96-Well-Platte. Unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegerät, erhalten spezifische Absorptionswerte bei 450 nm und nicht-spezifische Absorptionswerte bei 690 nm.

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Ergebnisse

Eine thermisch ansprechende gepfropfte Copolymer wurde erfolgreich synthetisiert und auf ihre bioadhäsiven Festigkeit, Quelleigenschaften und in vitro cytocompatibility. Wir entschieden uns für Alginat zu untersuchen, aufgrund seiner etablierten mucoadhäsive Eigenschaften. Alginat-Mikropartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 59,7 ± 14,9 um wurden mit 5% gemischt (w / v) PNIPAAm-g-CS bei Konzentrationen von 25, 50 und 75 mg / ml. Diese Konzentrationen wurden auf der...

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Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte, um das Hydrogel-Mikropartikel-Composite bei der Synthese und seine Haftfestigkeit der Bewertung, Quellfähigkeit und zelluläre Biokompatibilität. Radikalische Polymerisation von PNIPAAm-g-CS erfordert eine erfolgreiche Methacrylierung von Chondroitinsulfat, eine vollständige Auflösung der Monomerkomponenten und sauerstofffreie Reaktionsbedingungen. Das Verhältnis von Monomer zu NIPAAm methacrylierte Chondroitinsulfat in dem Reaktionsgemisch wurde gewählt , weil es in unserer früheren Ar...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren möchten dankbar die Hilfe von Dr. Jennifer Kadlowec bei der Entwicklung des Protokolls Klebstoff Zugversuch bestätigen.

Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde durch das National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett-und Hautkrankheiten und dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer 1R15 AR 063920-01 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
N-Isopropylacrylamid, 99%, rein, stabilisiertAcros Organics2210-25-5Stabilisator mit Hexan kühlen und entfernen
Chondroitinsulfat Ein Natriumsalz (aus der Luftröhre von Rindern)Sigma-Aldrich39455-18-0Hexane kühlen
Fisher ScientificH302-4In einem brennbaren Schrank aufbewahren
50% (w/w) NatriumhydroxidFisher ScientificSS254-1Ätzende Natur
MethacrylanhydridSigma-Aldrich276685Starke Dämpfe; Verwendung in einem Abzug
AcetonFisher ScientificA18-4Vor Gebrauch im Kühlschrank kühlen
StickstoffgasPraxair7727-37-9Teilenummer: NI 4.8, Zylinderausführung T, 99,998 % reiner Stickstoff (Argon kann als alternatives Inertgas verwendet werden)
Tetramethylethylendiamin, 99% extra reinAcros Organics110-18-9
AmmoniumpersulfatSigma AldrichA3678Hygroskopisch und wird in Gegenwart von Wasser abgebaut
Phosphatgepufferte KochsalztablettenFisher ScientificBP2944Trocken halten
Alginsäure, NatriumsalzAcros Organics177775000Verwenden Sie Wärme, um das Auflösen
zu erleichternCalciumchlorid-DihydratFisher ScientificC79
RapsölLokaler LadenBeziehen Sie von einem lokalen Geschäft
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) IsopropoanolFisher ScientificA416-4
SchweineohrenHaine's Pork ShopBeziehen Sie von einem örtlichen Metzger
NatriumchloridFisherScientific S271-3
Menschliche embryonale Niere 293 ZellenATCCATCC CRL-1573Für den Langzeitgebrauch in flüssigem Stickstoff lagern
DMEM: 1x, hoher Glukosegehalt, kein PyruvatLife Technologies11965126Kühlen
Fötales RinderserumLife Technologies10082-147
Kühlen Penn Strepto: 10.000 U/mlLife Technologies15140-122
Trypsin-EDTA kühlen: 0,5%, 10xLife Technologies15400-054
MethanolVWRAAA44571-K7
Lebend-/Totzellen-ViabilitätskitLife TechnologiesL3224Lichtempfindlich, gefroren
halten XTT-ZellviabilitätskitSigma AldrichTOX2-1KTLichtempfindlich, gefroren
halten Klares DMEM: 1x, hoher Glukosegehalt, kein PhenolLife Technologies21063-029Kälteschrank
Dulbecco's PBS: 1xLife Technologies14190136Kälteschrank
NatriumcitratEMDSX0445-1
VerdrängerpipetteBrandTech Scientific, INC2702904Dispensiert 100 - 500 &Mikro; l und wird mit aufsteckbaren Spitzen
Nr. 3 geliefert. Skalpellgriff aus EdelstahlSigma AldrichS2896
Miltex sterile chirurgische KlingenFisher Scientific12-460-440Größe 10
Power Edelstein HomogenisatorFisher Scientific08-451-660Modell # 125
Porzellanmörser und StößelSigma AldrichZ247464Fasst 50 ml
FreeZone 1 L Tisch-GefriertrocknungssystemLabconco7740020Proben vor Gebrauch einfrieren
Ölabgedichtete DrehschieberpumpeEdwardsA65301906Modell # RV5
Inkubations-OrbitalschüttlerVWR12620-946Modell # 980153
Tischgekühlte ZentrifugeForma Scientific, INCModell # 5682
Beheizte ÖfenVWRModell # 1235PC
2 N KraftmessgerätShimpoFGV-0.5XYModell # FGV-0.5XY
E-Force-PrüfstandShimpoFGS-200PVModell # FGS-200PV
Schwingschaufelzentrifuge für GewebekulturenBeckman Coulter366830Modell #6S-6KR
Mikrozentrifuge für GewebekulturenEppendorfModell #5415C
Hämazytometer-SetHausser Scientific3720Erfordert Ersatz-Deckglas Rutschen
FolienwärmerLab ScientificXH-2022Modell # XH-2002
Tragbare HeizlampeUnderwriters LaboratoriesHilft, die Polymertemperatur bei 37 & Grad zu halten; C
Inverses FluoreszenzmikroskopZeissModell Axiovert 25 CFL
Beheiztes WasserbadVWRModell # 1235PC
SchaukelplattformVWRSerie 100
Multiskan FC Mikrotiterplatten-ReaderThermo ScientificTyp 357
Zellkultur-InkubatorVWRModell # 2350T
Auffrischer Biosicherheitswerkbank / Klasse IILabconcoDelta Series
kühlen

Referenzen

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