En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O ₂ ^.- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert.

Zusammenfassung

Endothelium-derived Stickstoffmonoxid (NO) aus endothelialen NO-Synthase (eNOS) ist einer der wichtigsten vasoprotektiven Moleküle in kardiovaskulären Physiologie. Dysfunktionalen eNOS wie Entkopplung von eNOS führt in NO Bioverfügbarkeit und Erhöhung Superoxidanion (O ₂ ^.-) Produktion und fördert wiederum kardiovaskulären Erkrankungen zu verringern. Daher sind entsprechende Messung von NO und O ₂ ^.- Ebenen in den Endothelzellen entscheidende für die Erforschung von Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Aufgrund der extrem labile Natur von NO und O ₂ ^.-, ist es schwierig zu messen , NO und O ₂ ^.- direkt in ein Blutgefäß. Es wurden zahlreiche Verfahren NO zu messen entwickelt und O ₂ ^.- Produktion. Es ist jedoch entweder insensitive oder unspezifisch, oder technisch anspruchsvoll und erfordert eine spezielle Ausrüstung. Hier beschreiben wir eine Anpassungdes Fluoreszenzfarbstoffs Verfahren für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären NO und O ₂ ^.- Die zellpermeabel Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) mit jeweils in intakten Aorten von einer Adipositas - Mausmodell induziert von hohem Fettgehalt-Diät Fütterung. Wir zeigen , könnten intrazellulären NO verringert und eine verbesserte O ₂ ^.- Ebenen in den frisch isolierten intakten Aorten von Maus Fettleibigkeit zur Kontroll lean Maus verglichen. Wir zeigen , dass diese Methode ist eine einfache Technik für die direkte Erfassung und Visualisierung von NO und O ₂ ^.- in den intakten Blutgefäßen und kann in weiten Bereichen für die Untersuchung der endothelialen (dys) Funktion unter (Physio) pathologischen Bedingungen angewendet werden.

Einleitung

Die vaskulären Endothelzellen halten Gefäß funktionelle und strukturelle Integrität von vasoaktiven Faktoren ¹ freigibt . Unter diesen Faktoren Endothelium derived Stickstoffmonoxid (NO) , hergestellt aus L-Arginin durch endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist das wichtigste und am besten charakterisierte Faktor in kardiovaskulären Physiologie ^2. NO verursacht Entspannung der glatten Muskulatur und hemmt die Zellproliferation hemmt die Thrombozytenaggregation und entzündliche Zelladhäsion und Infiltration in den subendothelialen Raum, also Gefäßerkrankung Entwicklung ³ zum Schutz vor. Unter vielen physiologischen und pathologischen Beding....

Protokoll

Tier Arbeit wurde von der Ethikkommission der Veterinäramt Fribourg, Schweiz genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien für die Tierpflege und Experimentieren an unserer Hochschule.

1. Herstellung eines Set-up für die Inkubation von isolierten Arterien

1. Konstrukt ein Organbad System , das auf 37 ° C erhitzt werden kann und belüftet mit 95% O ₂ und 5% CO ₂ aus einem Kohlenstoffgastank.
2. Bereiten so viel Krebs-Ringer - Bicarbonat - Puffer , wie mit der Konzentration der folgenden Zusammensetzung benötigt: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH

Ergebnisse

Adipositas ist ein wichtiger Risikofaktor für ischämische koronare Herzkrankheit und ist assoziiert mit einer verminderten NO - Bioverfügbarkeit Endothelzellen, ein Markenzeichen von atherosklerotischen Gefäßerkrankung ^21. eNOS-Entkopplung wurde gezeigt , einen wichtigen Mechanismus der endothelialen Dysfunktion bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Zuständen zu sein , einschließlich der Alterungs ^22, Atherosklerose und Adipositas ^14. Daher h.......

Diskussion

Der Nachweis von NO oder O ₂ ^.- mit Fluoreszenzfarbstoffen wurde in vielen Studien in kultivierten Endothelzellen und auch in Gewebe Kryoabschnitte ²³ häufig verwendet. Hier erweiterten wir diese Methode , um intakte lebende Blutgefäße, dh en Gesichtserkennung von NO und O ₂ ^.- Ebenen in der Endothelschicht mit DAF-2DA und DHE verbunden, die wirksam ist, relativ einfach und intuitiv. Im Vergleich mit dem Verfahren in vaskulären Kryoschnitte zeigt d.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dihydroethidium (DHE)	Invitrogen	D 1168	löst sich mit DMSO zu 5  mmol/L als 1.000x Lagerbestand, gelagert bei -20  ° C
Diaminofluorescein-2-Diacetat (DAF-2DA)	Calbiochem	251505	mit DMSO auf 5  mmol/L als 1.000x Lagerbestand, gelagert bei -20  ° C
4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Invitrogen	D 1306	lösen sich mit Wasser auf 300  &Mikro; mol/L als 1.000x Lagerbestand, gelagert bei 4  ° C
Einbettmedium	Vektor Arbeit. (Reactorolab)	H-1000
Nω -Nitro-L-Argininmethylesterhydrochlorid (L-NAME)	Sigma-aldrich	N5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Dänisches Myo Technology A/S	Modell 610M
Mikroskop	Nikon	SMZ800
Konfokales Mikroskop	Leica	DM6000
Bildverarbeitungssoftware	National Institute of Health (NIH)	Image J
Chirurgische Schere	S& T AG	SDC-11
Mikrochirurgische Schere	F.S.T	15000-01
Pinzette	S& T AG	JF-5
Deckglas rund Durchmesser 15  mm	VWR	631-1579
Spitzen 1 ml	VWR	RFL-1200c
Tipps 200 μ l	VWR	613.0659
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen 1,5 ml	Eppendorf
Acetylcholinchlorid	Sigma-aldrich	A-6625