Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors ermöglicht. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die mit Immunoblots unter Verwendung mehrerer phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist.
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Methodenartikel
Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Transkriptionsfaktor IRF3 ist entscheidend für die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger, hauptsächlich durch Interferon-β und antivirale Genexpression. Eine detaillierte Analyse der IRF3-Aktivierung ist unerlässlich, um zu verstehen, wie Krankheitserreger die angeborene antivirale Reaktion auslösen oder umgehen. Unterschiedliche aktivierte Formen von IRF3 können anhand ihrer Phosphorylierung und ihres Monomer- vs. Dimerstatus unterschieden werden. In vivo kann eine Unterscheidung zwischen den verschiedenen aktivierten Spezies von IRF3 durch die Trennung von IRF3-phosphorylierten Formen anhand ihrer Mobilitätsverschiebungen auf SDS-PAGE erreicht werden. Zusätzlich können die Spiegel von IRF3-Monomer und -Dimer mittels nicht-denaturierender Elektrophorese überwacht werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen und die meisten Informationen über den Aktivierungsstatus von IRF3 zu erhalten. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die an Immunoblots unter Verwendung mehrerer Gesamt- und phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist. Diese experimentelle Strategie stellt einen kostengünstigen und sensitiven Ansatz dar, um alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierungs-vermittelten Aktivierung von IRF3 zu erhalten.
Einleitung
Das ubiquitär und konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) ist entscheidend für die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger vor allem durch die Induktion von IFN & beta;, aber auch durch die Induktion des Chemokin (CC motif) Ligand 5 (CCL5 ) und mehrere antivirale Proteine, einschließlich IFN-induzierte Protein mit tetratricopeptide wiederholt IFIT1 / 2/3 1-3. Oder Lipopolysaccharid (LPS) 4: IRF3 Aktivierung wurde nach der Infektion mit einer Vielzahl von Viren, oder durch Einwirkung von Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly-I C) angegeben. Wichtig ist, dass die meisten untersuchte....
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Protokoll
HINWEIS: Das Protokoll wird hier unter Verwendung von A549-Zellen mit Sendai-Virus (SeV) infiziert beschrieben. Jedoch wird das Protokoll für die SDS-PAGE und native PAGE funktioniert auch bei allen bisher untersuchten humanen und murinen Zelltypen, insbesondere Knochenmarkzellen mit verschiedenen Stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 aktivierende stimuliert.
1. Die Infektion von A549-Zellen
- Aufrechtzuerhalten A549-Zellen in Kultur in einer 15 cm Platte bei 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (HALLO-FBS) und 1% L-Glutamin (gesamt F12K / Ham-Medium).
Hinwei....
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Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt ein typisches Bild der Immunoblot IRF3 mit IRF3 Gesamt Antikörper und IRF3-phosphospecific Antikörper gegen Ser396 und Ser398 nach der Auflösung des WCE durch hochauflösende SDS-PAGE nachgewiesen. In unstimulierten Zellen A549 wird IRF3 als zwei Banden bei 50 und 53 kDa in der SDS-PAGE entsprechend dem nicht-phosphoryliert (Form I) und der hypophosphorylierten (Form II) Spezies IRF3 detektiert. Exposition der Zellen A549 SEV für 3-9 Stunden ergibt eine .......
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Diskussion
Das Protokoll beschreiben wir hier aus einer Kombination von hochauflösenden SDS-PAGE und native-PAGE auf die Verwendung von mehreren phosphospecific Antikörper zu den monomeren / dimeren und phosphoforms I-IV IRF3 unterscheiden gekoppelt. Entsprechende Erfassung dieser IRF3 Spezies ist wichtig, um vollständig zu charakterisieren IRF3 Aktivierung in einer bestimmten Umgebung. B. LPS-Stimulierung von aktivierten Makrophagen führt zur Bildung von dimeren, Ser396 / 398 phosphoryliert IRF3 die eine hypophosphorylierten (For.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren danken früheren und aktuellen Mitgliedern des Labors für die Entwicklung der Protokolle. Die Arbeit wurde durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] und des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012] unterstützt. NG ist Träger eines Tier II Canada Research Chair. AR ist Stipendiatin des Ausbildungsprogramms des Respiratory Health Research Network des Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| F12/Ham Life | Technologies | 11765-054 | Warm bei 37°; C Bad vor Gebrauch. |
| Fötales Rinderserum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Für die Zellkultur. |
| Trypsin/EDTA 0,25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai Virus Cantell Stamm | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerin | Bioshop | GLY001.1 | Schneiden Sie das Ende der Spitze ab und pipetieren Sie langsam, da sie sehr dick ist. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Eingetragene Marke entsprechend Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol (Nonidet P-40) Waschmittel |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Natriumfluorid | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Natriumorthovanadat | MP Biomedicals | 159664 | Aktivierung von Natriumorthovanadat 0,2 M : 1) Erhöhen Sie den pH-Wert auf 10,0 mit entweder 1 N NaOH oder 1 N HCl. Der Ausgangs-pH-Wert der Natriumorthotovanadatlösung kann mit vielen Chemikalien variieren. 2) Die Lösung ist bei einem pH-Wert von 10,0 gelb. 3) Kochen Sie, bis sie farblos sind. 4) Auf RT abkühlen lassen. 5) Den pH-Wert auf 10,0 erhöhen und die Schritte 3-4 wiederholen, bis die Lösung farblos bleibt und sich bei 10,0 stabilisiert. Lagern Sie die aktivierten Natriumorthovanadat-Aliquots bei -20 °C. |
| p-Nitrophenylphosphat Dinatriumsalzhexahydrat | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphat | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagenz | Bio-Rad | 500-0006 | zytotoxisch |
| Acrylamid/Bis-Acrylamid (37,5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | zytotoxisch |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Salzsäure (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Arbeiten Sie unter Abzug. Giftig und reizend. |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | aufreizend. |
| Amoniumpersulfat | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Giftig und reizend. |
| Bromphenolblau | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Arbeiten unter dem Abzug. Giftig für das Nervensystem, die Schleimhäute. Kann giftig für die oberen Atemwege, die Augen und das Zentralnervensystem sein. |
| Glycin | Bioshop | GLN001.5 | |
| Natriumdesoxycholat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Bioshop | SHY700 | aufreizend. |
| Nitrozellulose-Membran (0,45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Essigsäure Gletscher | Bioshop | ACE222.4 | Arbeiten unter dem Abzug. Giftig, reizend und brennbar. |
| Roter Ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Kaliumchlorid (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Für PBS-Zusammensetzung für Immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | Für die PBS-Zusammensetzung für Immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Für PBS-Zusammensetzung für Immunoblot. |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Für PBS-T-BSA-Zusammensetzung für Immunoblot. |
| Fettfreie Trockenmilch | Carnation | ||
| Polysorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Schneiden Sie das Ende der Spitze ab und pipetieren Sie langsam, da sie sehr dick ist. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Aliquotiert bei -20 oC. Frost/Auftauen vermeiden. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Hausgemacht19 | Lagern, aliquotiert bei -80 oC. Frost/Auftauen vermeiden. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Bei -20 oC lagern. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Hausgemacht15 | Lagern bei -80 oC. Frost/Auftauen vermeiden. | |
| Anti-IRF-3-Actif-Motiv in voller Länge | 39033 | Aliquotiert bei -80 oC lagern. Frost/Auftauen vermeiden. | |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquotiert bei -20 oC. |
| Western Lightning Chemilumineszenz-Reagenz Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD-Kameragerät | GE Healthcare | ||
| SDS-PAGE Molekulargewichtsstandards, Breitenbereich | Bio-Rad | 161-0317 | Aliquotiert bei -20 oC. |
Referenzen
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
