Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

11.9K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

24. Januar 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors ermöglicht. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die mit Immunoblots unter Verwendung mehrerer phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist.

Zusammenfassung

Der Transkriptionsfaktor IRF3 ist entscheidend für die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger, hauptsächlich durch Interferon-β und antivirale Genexpression. Eine detaillierte Analyse der IRF3-Aktivierung ist unerlässlich, um zu verstehen, wie Krankheitserreger die angeborene antivirale Reaktion auslösen oder umgehen. Unterschiedliche aktivierte Formen von IRF3 können anhand ihrer Phosphorylierung und ihres Monomer- vs. Dimerstatus unterschieden werden. In vivo kann eine Unterscheidung zwischen den verschiedenen aktivierten Spezies von IRF3 durch die Trennung von IRF3-phosphorylierten Formen anhand ihrer Mobilitätsverschiebungen auf SDS-PAGE erreicht werden. Zusätzlich können die Spiegel von IRF3-Monomer und -Dimer mittels nicht-denaturierender Elektrophorese überwacht werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen und die meisten Informationen über den Aktivierungsstatus von IRF3 zu erhalten. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die an Immunoblots unter Verwendung mehrerer Gesamt- und phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist. Diese experimentelle Strategie stellt einen kostengünstigen und sensitiven Ansatz dar, um alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierungs-vermittelten Aktivierung von IRF3 zu erhalten.

Einleitung

Das ubiquitär und konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) ist entscheidend für die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger vor allem durch die Induktion von IFN & beta;, aber auch durch die Induktion des Chemokin (CC motif) Ligand 5 (CCL5 ) und mehrere antivirale Proteine, einschließlich IFN-induzierte Protein mit tetratricopeptide wiederholt IFIT1 / 2/3 1-3. Oder Lipopolysaccharid (LPS) 4: IRF3 Aktivierung wurde nach der Infektion mit einer Vielzahl von Viren, oder durch Einwirkung von Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly-I C) angegeben. Wichtig ist, dass die meisten untersuchten Viren Mechanismen entwickelt, um die IRF3 vermittelte Reaktion entziehen und damit die Flucht der Host angeborenen Immunabwehr 5. Somit überwachen IRF3 Aktivierung ist von großer Bedeutung, um die molekularen Mechanismen der unspezifischen antiviralen Abwehr verstehen, sondern auch, um die durch Viren verwendet, um diese Antwort entgegenzuwirken Strategie zu identifizieren.

ent "> Viele veröffentlichten Berichten allerdings nur eine begrenzte Analyse IRF3 Aktivierung durch die Überwachung der IRF3-Zielgen Induktion (IFNB1 und IFIT1) durchgeführt und / oder Luciferase-Reportergen-Assay zu niedrige Auflösung Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekoppelt ist (SDS- PAGE) -Analyse IRF3. Jedoch zahlreiche biochemische Studien zeigte die Analyse des Verhaltens verschiedener IRF3 Mutanten und Aufklärung der Kristallstruktur IRF3 6-11 haben dazu beigetragen, dass IRF3 herzustellen ist mit einer komplexen Reihe von aufeinanderfolgenden posttranslationalen Modifikationen durch Phosphorylierung an unterworfen mehreren Standorten. Die Menge der Phosphorylierung in IRF3 Aktivierung beteiligt scheint von dem Stimulus und höchstwahrscheinlich nach Zelltyp zu sein. Bei nicht infizierten Zellen, koexistiert IRF3 als nicht-phosphoryliert und hypophosphorylierten enthaltenden Arten phosphoresidues einschließlich Thr135 und Ser173, in der 1 -198 aa N-terminalen Bereich 6,12-14. Anhäufung dieser hypophosphorylierten form der IRF3 durch Stress induzieren, Wachstumsfaktoren und DNA-schädigende Mittel 6 induziert. Phosphorylierung von Ser / Thr-Reste am C-terminalen Region von IRF3 enthaltend die Transaktivierungsdomäne ausgelöst nach einer Aktivierung, die durch Viren, Poly I: C oder LPS in einer zelltypabhängig 15-17. C-terminale Phosphorylierung von IRF3 beinhaltet nicht weniger als 7 verschiedene phosphoacceptor Standorten in zwei Hauptcluster, Ser385 / Ser386 und Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 organisiert, dass jeder dazu beitragen, IRF3 Aktivierung durch Dimerisierung, Kernakkumulation, Verbindung mit dem CREB bindenden Protein (CBP) / p300 Co-Aktivatoren, DNA-Bindung an sensiblen Antwortelement (ISRE) Konsensus-Sequenzen und Transaktivierung von Zielgenen 9,10,17-19 IFN. Die Phosphorylierung von Thr390 ist auch gedacht, um virusinduzierten IRF3 Aktivierungs 20 beizutragen. Massenspektrometrie-Analysen von IRF3 haben gezeigt, dass Ser386, Thr390, Ser396 und Ser402 Reste direkt phosphorylatdurch den Inhibitor der & kgr; B-Kinase ε (IKKε) ed / TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1) Kinasen 9,10. Phosphorylierung an der C-terminalen Reste auch für die Beendigung des IRF3 Aktivierung über Polyubiquitinierung und Proteasom-vermittelten Abbau 10 erforderlich. Dieses Verfahren ist auch abhängig von der Phosphorylierung an Ser339, der für die Einstellung des propyl Isomerase Pin1 10,11 erforderlich ist. IRF3 Spezies, die mindestens Phospho-Ser339 / 386/396 Rückstände berücksichtigt werden hyperphosphorylierten Formen. Der genaue Ablauf und Funktion der Website bleibt eine Frage der Diskussion 10,21. Es ist nun klar, dass aktiviert IRF3 keinen homogenen Zustand dar, sondern dass verschiedene aktivierte Spezies ausgeprägte Phosphorylierung oder Dimerisierung Eigenschaften aufweisen vorhanden 10,22.

Um ein vollständiges Verständnis der IRF3 Aktivierung in Reaktion auf bestimmte Krankheitserreger liefern, ist es daher notwendig, characterize welche der aktivierten Spezies induziert werden. Induktion IRF3 Zielgene IFNB1 und IFIT1 hat sich als zuverlässige Auslese für IRF3 Aktivierung. Jedoch Überwachen Expression dieser Gene nicht zwischen verschiedenen Aktivierungszuständen des IRF3 unterscheiden. Eine umfassende Analyse der IRF3 Aktivierungszustände in einer bestimmten Einstellung stützt sich auf die detaillierte Charakterisierung ihrer Phosphorylierung und Dimerisierung Status 10. Unphosphorylierten (Form I), hypophosphoryliert (Form II) und hyperphosphoryliertem (Formen III und IV) IRF3 Formen 6,18,23 erfolgreich durch eingeschränkte Mobilität in hoher Auflösung SDS-PAGE-Analyse aufgelöst werden. Monomeren und dimeren IRF3 Spezies effizient durch native-PAGE-Analyse identifiziert werden. Diese Ansätze werden stark verbessert, wenn es in Kombination mit phosphospecific Antikörper gegen verschiedene IRF3 phosphoacceptor Teilen geleitet verwendet.

Standardprotokolle ermöglichen eine schlechte Auflösung vonProteine, die keine wirksame Trennung von unterschiedlichen IRF3 phosphorylierten Formen zulässt. Hier beschreiben wir im Detail ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen, um die Induktion von verschiedenen Virus-aktivierte IRF3 Spezies unter Verwendung von SDS-PAGE, native-PAGE in Kombination mit Immunoblot gekoppelt mit Gesamt und phosphospecific Antikörper zu überwachen. In vivo Diskriminierung zwischen den Aktiv Formen IRF3 wird auf der Basis ihrer in der SDS-PAGE beobachteten Mobilitätsverschiebungen durchgeführt. Zusätzlich kann IRF3 Monomer und Dimer von nicht-denaturierenden Elektrophorese unterschieden werden. Die Kombination dieser zwei komplementären Techniken mit Immunoblot erweist sich als eine kostengünstige und sensiblen Umgang mit alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierung-vermittelte Aktivierung von IRF3 erwerben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll wird hier unter Verwendung von A549-Zellen mit Sendai-Virus (SeV) infiziert beschrieben. Jedoch wird das Protokoll für die SDS-PAGE und native PAGE funktioniert auch bei allen bisher untersuchten humanen und murinen Zelltypen, insbesondere Knochenmarkzellen mit verschiedenen Stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 aktivierende stimuliert.

1. Die Infektion von A549-Zellen

  1. Aufrechtzuerhalten A549-Zellen in Kultur in einer 15 cm Platte bei 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (HALLO-FBS) und 1% L-Glutamin (gesamt F12K / Ham-Medium).
    Hinweis: Alle für die Zellkultur und Behandlungen verwendet Lösungen müssen steril sein.
  2. Bei 24 Stunden vor der Infektion, saugt den mittleren und die Zellen werden mit 10 ml destilliertem phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) bei RT.
  3. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Platte, die Zellen abdecken und bei 37 ° C für 3 min.
  4. Stoppen Sie die Inkubationszeit, sobald the-Zellen beginnen, von der Platte durch Ausklopfen sanft mit einer Hand zu lösen. Inaktivierung der Trypsin durch Zugabe von 10 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium pro Platte und übertragen Sie die Zellen auf eine 15 ml konischen Röhrchen.
  5. Zentrifuge bei 350 × g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 8 ml komplette F12K / Ham-Medium, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten.
  6. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Pflanzensamen, die Zellen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen pro 60 mm Platte in 4 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium. Inkubation für 20-24 Stunden bei 37 ° C / 5% CO 2. Nach 20 bis 24 h, bilden die Zellen eine 90% konfluenten Monolayer (das entspricht 1,5 x 10 6 Zellen).
  7. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 2 ml Serum-freiem F12K / Ham-Medium (SFM). 2 ml frischem SFM pro 60 mm Platte.
  8. Tauwetter ein Aliquot des Sendai-Virus (SeV) (bei -80 ° C gelagert aliquotiert) auf Eis und kurz vortexen.
  9. Verdünnen Sie the-Virus im vorgeheizten SFM bis 60 HAU / 100 & mgr; l zu erhalten. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren sanft und fügen Sie 100 ul der verdünnten Virus pro Platte, um die Infektion bei 40 HAU / 10 6 Zellen durchzuführen. Sie Virus in der nicht infizierten Kontrollplatte hinzufügen, nicht.
  10. Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2. Man schüttelt die Platten von Hand 3 oder 4 mal, oder mit Hilfe eines automatischen Orbital- oder Schüttler direkt in den Inkubator gestellt, während der ersten Stunde der Infektion.
  11. Bei 2 h nach der Infektion, 2 ml F12K / Ham-Medium, das 20% HALLO-FBS, um eine Endkonzentration von 10% HALLO-FBS zu erhalten.
  12. Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 für eine weitere 1, 4 und 7 h auf insgesamt Infektion Zeiten von 3, 6 und 9 Stunden zu erreichen sind. An jedem dieser Zeitpunkte, fahren Sie mit Schritt 2.1.

2. Herstellung von Ganzzellextrakte (WCE)

  1. Entfernen Sie das Infektionsmedium. Ernte der Zellen durch Abschaben in 1 mleiskaltem D-PBS und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine vorgekühlte 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
  2. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 16,000 × g bei 4 ° C für 20 sec und sorgfältig dekan alle Spuren von D-PBS.
    HINWEIS: Bei diesem Schritt kann das Zellpellet direkt auf Proteinextraktion oder schockgefroren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis / Ethanol-Bad bei -80 ° C bis zur Lyse gespeichert unterworfen werden.
  3. Vorbereitung der Lysepuffer, enthaltend 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% Glycerin und 1% Nonidet P-40 in destilliertem Wasser (ddH 2 O). Extemporarily hinzuzufügen Protease (1 ug / ml Leupeptin und 2 & mgr; g / ml Aprotinin) und Phosphatase-Inhibitoren (5 mM Natriumfluorid, 1 mM aktiviert Natriumorthovanadat, 2 mM p-Nitrophenylphosphat und 10 mM β-Glycerophosphat, pH 7,5).
    HINWEIS: Der Lysepuffer ohne Inhibitoren können bei 4 ° C gelagert werden. Ein spezifisches Protokoll für die Aktivierung von Natriumorthovanadat in der Tabelle mit den spezifischen Reagenzien / Aufstellb beschriebennt.
  4. Zellpellet in 70 & mgr; l Lysepuffer. Typischerweise ist das Lysat Konzentration wird etwa 2 ug / ul sein.
  5. Inkubieren auf Eis für 20 min. Flash-Einfrieren des Lysats durch Inkubation in einem Bad mit flüssigem Stickstoff für 15 Sek. Auftauen Lysat bei RT, bis es vollständig geschmolzen ist und Vortex für 10 Sekunden. Wiederholen Sie die Frost / Tau / Wirbelzyklus 3 mal.
    1. Alternativ führen Sie den Gefrierschritt in einem Ethanol / Trockeneis-Bad für 1 min.
  6. Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Den Überstand (der dem WCE) in eine neue vorgekühlte 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Halten Sie das WCE auf Eis zu allen Zeiten.
  7. Quantifizierung von Proteinen unter Verwendung jedes Protein Quantifizierungsverfahren mit Lysepuffer wie Bradford-Protein-Assay auf Basis 26 kompatibel.

3. Beschlussfassung der WCE Hohe Auflösung SDS-PAGE

  1. Bereiten Sie drei denaturierenden Elektrophorese Gele.
    1. Zum Nachweis vonIRF3 Formen gießen zwei Gele von mindestens 16 cm Länge mit einem Trenngel 7,5% Acrylamid / Bis-Acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 O TEMED und einem Sammelgel 4% Acrylamid, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 TEMED O.
      Vorsicht! Acrylamid, TEMED und SDS sind toxisch und / oder reizend. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren.
    2. Zum Nachweis von SeV Proteine ​​gießen einem Gel aus einem Minimum von 8,5 cm Länge bei, ähnlich der in 3.1.1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Trenngel enthält 12% Acrylamid-Gel Eigenschaften.
  2. Denaturieren des in Schritt 2.6 erhaltenen WCE durch Zugabe von 1: 4 (v / v) 5x Ladepuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) Glycerin, 0,0005% Bromphenolblau und 25% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O), gefolgt von Erwärmen bei 100 °C für 10 min. Schnellspin die Rohre nach unten die Kondensation, die in der Kappe bildet zu bringen.
    Vorsicht! β-Mercaptoethanol ist giftig beim Einatmen. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren.
  3. Montieren Sie die Gele in der Migrationsgerät. Füllen des oberen und unteren Kammern mit Laufpuffer, der 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS und 192 mM Glycin in destilliertem Wasser (dH 2 O).
  4. Last 14 ul der Molekulargewichtsstandard in einer Vertiefung jeder 16 cm Gel und 7 ul der Molekulargewichtsstandard in einem auch der 8,5 cm-Gel. Last 30 ug denaturierter WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung der beiden Gele in Schritt 3.1.1 IRF3 Formen Detektions hergestellt. Last 8-10 ug denaturierte WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung auf dem Gel in Schritt 3.1.2 SeV Analyse vorbereitet.
  5. Führen Sie die Gele bei 30 mA Konstantstrom, bis der Migrationsfront den Boden des Gels erreicht.
    HINWEIS: Migration dauert in der Regel approximadig 3 Stunden für eine 16 cm-Gel und 45 min für eine 8,5 cm Gel.
  6. Fahren Sie mit dem Transfer auf Nitrocellulosemembranen (Schritt 5).

4. Analyse der IRF3 Dimerisierung von Native-PAGE

Hinweis: Diese Methode wurde ursprünglich von der Gruppe von Dr. T. Fujita 27 beschrieben.

  1. Bereiten Sie die obere (-) und unteren (+) Kammer Elektrophorese-Puffer. Die obere Kammer Puffer besteht aus 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM Glycin und 1% Natriumdeoxycholat (DOC) in ddH 2 O. Die untere Kammer Puffer enthält 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) und 192 mM Glycin in ddH 2 O.
    HINWEIS: Die obere und die untere Kammer der Elektrophorese-Puffer bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. Stellen Sie jedoch sicher, dass sie auf RT vorgewärmt, bevor Sie die Elektrophorese.
  2. Gießen eines nicht denaturierenden Trenngel von mindestens 8,5 cm Länge, enthaltend 7,5% Acrylamid / Bisacrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 1% ammonium Persulfat und 0,1% in ddH 2 O. TEMED
  3. Vorlauf das Gel bei 40 mA Konstantstrom für 30 Minuten auf Eis. Drücken Sie die Laufgerät in das Eis in etwa der Höhe des unteren Kammer Elektrophorese-Puffer. Es ist wichtig, dass das Gel nicht in das Eis.
  4. Während Vorlauf, mischen WCE auf Eis gehalten mit 2x nativen PAGE-Ladepuffer 1: 1 (v / v), die 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau in ddH 2 O.
  5. Last 8 - 10 & mgr; g WCE (hergestellt wie in Schritt 4.4 beschrieben) unmittelbar am Ende des Vorlauf.
  6. Führen Sie das Gel bei 25 mA Konstantstrom auf Eis, wie oben für den Vorlauf beschrieben, bis der Migrationsfront den Boden des Gels (ca. 40 min) erreicht.

5. Immunoblotanalyse IRF3 Species

  1. Vorbereitung der Transferpuffer, der 25 mM Tris-Base und 192 mM Glycin in ddH 2 O. Kühlen den Transferpuffer bei 4 ° C vor dem Gebrauch.
  2. Nass drei Stück Nitrocellulose-Membran auf eine Größe geringfügig größer als die Gele in einem Kunststoff / Glas-Box mit den Übertragungspuffer geschnitten. Geben Sie die Orientierung der Membran durch Abschneiden einer Ecke. Der Übertragungspuffer kann 3-mal wiederverwendet werden. Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C zwischen den Anwendungen.
  3. Ungegossen die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) und schneiden Sie eine Ecke jedes Gel für die richtige Orientierung.
    1. Für native-PAGE, Inkubation des Gels bei RT unter leichtem Schütteln für mindestens 30 min in der SDS-PAGE-Laufpuffer, um das DOC vor der Übertragung auf dem Übertragungspuffer zu entfernen.
  4. Die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) in der Transferpuffer Inkubation für 5 - 10 min.
  5. Montieren Sie einen Transfer-Sandwich pro Gel in einer Transferkassette mit der Membran in Richtung der positiven Elektrode (Schaumstoffpolster / Filterpapier / Membran / Gel / Filterpapier / Schaumstoffunterlage). Seien Sie vorsichtig, um alle Luftblasen zwischen den Schichten des Sandwich zu entfernen.
  6. Führen Sie die Übertragung, wie empfohlen by der Hersteller für die Übertragungsvorrichtung verwendet wird.
    HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationen und Waschungen in den nächsten Schritten auf einem Schaukel oder Orbitalschüttelvorrichtung Plattform.
  7. Am Ende der Bewegungsphase, Inkubation der Membranen für 15 min in der Fixierungslösung, die 7% Essigsäure, 40% Ethanol und 3% Glycerin in ddH 2 O. Waschen der Membranen 3x 5 min in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 und 1,8 mM KH 2 PO 4 in dH 2 O).
    Vorsicht! Essigsäure ist giftig, reizend und brennbar. Schutzhandschuhe tragen und unter dem Abzug zu manipulieren.
    HINWEIS: Die Fixierungslösung kann mehrfach wiederverwendet werden.
  8. Für die native-PAGE-Membran gehen Sie direkt zu Schritt 5.11.
  9. Spülen der drei SDS-PAGE Membranen schnell in dH 2 O vor dem Inkubieren für 1 min in rot ponceau Lösung, enthaltend 6,57 mM rotem Ponceau und 1% Essigsäure in ddH 2 O.
    HINWEIS: Die rote ponceau Lösung r eused mehrmals.
  10. Spülen Sie die Membranen in dH 2 O, bis der Hintergrund ist weiß genug, um die Proteinbanden in rot gefärbt sehen. Beachten Sie die Markierungen mit einem Bleistift und den überflüssigen Membran um den Proteinen. Entfärben Membranen durch Inkubation für 5 min in PBS unter Rühren.
  11. Die Membranen 1 h bei RT oder O / N Inkubieren bei 4 ° C in Blockierungslösung (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 und 5% fettfreier Trockenmilch (PBS-T-Milch). Waschen der Membranen 3x 5 Minuten in PBS-T.
    HINWEIS: Die PBS-T Wäsche ist optional und nur dann erforderlich, wenn die Anwendung streng Antikörper in PBS-T, enthaltend 5% Rinderserumalbumin (PBS-T-BSA) (Abbildung 1 und Tabelle 1) in der nächsten Stufe verdünnt.
  12. Inkubieren Sie die vier Membranen (von SDS-PAGE und native-PAGE) mit den primären Antikörper gemäß der Reihenfolge in Abbildung 1 und Tabelle 1 beschrieben. Führen Sie 5x 5 min Waschen in PBS-T.
"> figure-protocol-1
Abbildung 1. Reihenfolge der Immunoblot Analysen. Die schematische beschreibt die einzelnen SDS-PAGE und native-PAGE-Gelen erforderlich, um die verschiedenen IRF3 phosphoryliert und monomeren / dimeren Formen zu erkennen. Die spezifische Reihenfolge der Antikörper an die Membran von jedem Gel im Immunoblot Verfahren hervor angewandt ist. Beachten Sie, dass die Anti-Aktin-Antikörper werden zuerst verwendet, um eine gleiche Beladung der Proben vor Anwenden anderer spezifischer Antikörper zu gewährleisten. Die alternierende Sequenz, mit anti-Aktin-Antikörper, die nach den anti-phospho-IRF3 Antikörper aufgebracht, auch funktioniert. Stripping ist zwischen anti-Aktin und anti-SeV Antikörpern oder zwischen anti-Phospho-IRF3 und Anti-IRF3 Antikörper wegen der Größe der überlappenden Signalen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Primäre Antikörper Verdünnung Verdünnungspuffer Incubation Sekundärantikörper Bemerkungen
Anti-Actin 1 / 10.000 PBS-T-BSA 15 min bei RT Anti-Maus- Zu verwenden, nach SDS-PAGE
Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert.
Anti-IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N bei 4 ° C Anti-Kaninchen- Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE.
Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung
Anti-IRF3-P-Ser396 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N bei 4 ° C Anti-Kaninchen- Verwenden Sie nach der SDS-PAGE.
Es wird nicht empfohlen, um die Wiederverwendung der verdünnten Antikörpers Anti-IRF3-P-396 ist auch von Cell Signaling. Optimale Verdünnung wurde als 1 / 1.000 für diesen Antikörper definiert, sondern kann zwischen den Chargen variieren.
Anti-IRF3-P-Ser398 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N bei 4 ° C Anti-Kaninchen- Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung
Anti-IRF3 voller Länge 1 / 7.500 PBS-T-Milch 3 h bei RT Anti-Kaninchen- Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Anti-IRF3 Antikörpers voller Länge kann nach der nativen PAGE verwendet werden, aber es ist weniger empfindlich, um das Monomer zu erkennen. Verdünnt Antikörper können mehrmals wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert.
Anti-IRF3-NES 0,5 ug / ml PBS-T-Milch 3 h bei RT Anti-Kaninchen- Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert.
Anti-SeV 1 / 14.000 PBS-T-BSA 3 h bei RT Anti-Kaninchen- Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert.
HINWEIS: Verdünnung und Puffer für HRP-gekoppelten sekundären Antikörper verwendet werden, müssen optimiert werden, da sie variiert von einem Unternehmen zum anderen.

Tabelle 1. Technische Daten der Antikörper im Immunoblotting-Verfahren verwendet.

  1. Inkubieren der Membranen mit der Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörper, wie in Abbildung 1 und Tabelle 1 aufgeführt. Waschen der Membranen 5x 5 min in PBS-T, gefolgt von 2 x 5 min in PBS, um Spuren von Tween vollständig entfernen.
  2. Die Membranen 1 min Inkubieren in einem Volumen von verstärkter Chemilumineszenz-Reagenz ausreicht zur vollständigen Bedeckung der Membranen. Trocknen Sie die Membranen unter Verwendung von Filterpapier.
  3. Legen Sie die Membranen in einem lumineszierenden Bildes Analysator, um die immunreaktiven Banden sichtbar zu machen.
    1. Alternativ führen Sie den Nachweis von immunreaktiven Banden mit empfindlichen Röntgenfilme.
  4. Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen.
    HINWEIS: Bei diesem Schritt können die Membranen trocken gehalten werden. Ist jedoch eine weitere Abziehen erforderlich ist, ist es besser, das Strippen vor dem Trocknen der Membran durchzuführen. Membranen können auch zur kurzfristigen in PBS gelagert werden.
  5. Für die Membranen, die nicht Strippen zwischen Inkubation mit Antikörpern erfordern (siehe Abbildung 1) gehen Sie direkt zu Schritt5.20.
  6. Beim Abisolieren zwischen Antikörpern (siehe Abbildung 1), Inkubation der Membranen in vorgewärmtem Ausstreiflösung, die 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT) und 0,7% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O bei 50 ° C erforderlich für 20 min unter regelmäßiger Bewegung. Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen.
    HINWEIS: Agitation während des Stripping-Verfahren ist der Schlüssel. Strippen kann in einem Hybridisierungsofen durchgeführt werden. Alternativ Strippen kann unter Verwendung von Membranen, die in Kunststoffbeutel versiegelt und in ein Wasserbad eingetaucht werden. In diesem Fall ist es wichtig, um die Membranen 4 rühren - 5 mal während der Inkubation.
  7. Die Membranen inkubiere 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C in PBS-T-Milch.
  8. Die Schritte 5,12-5,16 gemäß 1.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt ein typisches Bild der Immunoblot IRF3 mit IRF3 Gesamt Antikörper und IRF3-phosphospecific Antikörper gegen Ser396 und Ser398 nach der Auflösung des WCE durch hochauflösende SDS-PAGE nachgewiesen. In unstimulierten Zellen A549 wird IRF3 als zwei Banden bei 50 und 53 kDa in der SDS-PAGE entsprechend dem nicht-phosphoryliert (Form I) und der hypophosphorylierten (Form II) Spezies IRF3 detektiert. Exposition der Zellen A549 SEV für 3-9 Stunden ergibt eine ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das Protokoll beschreiben wir hier aus einer Kombination von hochauflösenden SDS-PAGE und native-PAGE auf die Verwendung von mehreren phosphospecific Antikörper zu den monomeren / dimeren und phosphoforms I-IV IRF3 unterscheiden gekoppelt. Entsprechende Erfassung dieser IRF3 Spezies ist wichtig, um vollständig zu charakterisieren IRF3 Aktivierung in einer bestimmten Umgebung. B. LPS-Stimulierung von aktivierten Makrophagen führt zur Bildung von dimeren, Ser396 / 398 phosphoryliert IRF3 die eine hypophosphorylierten (For...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken früheren und aktuellen Mitgliedern des Labors für die Entwicklung der Protokolle. Die Arbeit wurde durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] und des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012] unterstützt. NG ist Träger eines Tier II Canada Research Chair. AR ist Stipendiatin des Ausbildungsprogramms des Respiratory Health Research Network des Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
F12/Ham LifeTechnologies11765-054Warm bei 37°; C Bad vor Gebrauch.
Fötales RinderserumLife Technologies12483-020
L-GlutaminLife Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144Für die Zellkultur.
Trypsin/EDTA 0,25%Life Technologies25200-072
Sendai Virus Cantell StammCharles River Laboratories600503
HepesBioshopHEP001
Natriumchlorid (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
GlycerinBioshopGLY001.1Schneiden Sie das Ende der Spitze ab und pipetieren Sie langsam, da sie sehr dick ist.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771Eingetragene Marke entsprechend Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol (Nonidet P-40) Waschmittel
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25 
NatriumfluoridSigma-Aldrich201154
NatriumorthovanadatMP Biomedicals159664Aktivierung von Natriumorthovanadat 0,2 M : 1) Erhöhen Sie den pH-Wert auf 10,0 mit entweder 1 N NaOH oder 1 N HCl. Der Ausgangs-pH-Wert der Natriumorthotovanadatlösung kann mit vielen Chemikalien variieren. 2) Die Lösung ist bei einem pH-Wert von 10,0 gelb. 3) Kochen Sie, bis sie farblos sind. 4) Auf RT abkühlen lassen. 5) Den pH-Wert auf 10,0 erhöhen und die Schritte 3-4 wiederholen, bis die Lösung farblos bleibt und sich bei 10,0 stabilisiert. Lagern Sie die aktivierten Natriumorthovanadat-Aliquots bei -20 °C.
p-Nitrophenylphosphat DinatriumsalzhexahydratSigma-AldrichP1585
Beta-GlycerophosphatSigma-AldrichG6376 
Bio-Rad Protein Assay Reagenz Bio-Rad500-0006 zytotoxisch
Acrylamid/Bis-Acrylamid (37,5 : 1) 40%BioshopACR005 zytotoxisch
Tris-BaseBioshopDEO701
Salzsäure (HCl)LabChemLC15320-4 Arbeiten Sie unter Abzug. Giftig und reizend.
Natriumdodecylsulfat (SDS)BioshopSDS001.1 aufreizend.
AmoniumpersulfatSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010Giftig und reizend.
BromphenolblauFisher ScientificB392-5
Beta-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250Arbeiten unter dem Abzug. Giftig für das Nervensystem, die Schleimhäute. Kann giftig für die oberen Atemwege, die Augen und das Zentralnervensystem sein.
GlycinBioshopGLN001.5
NatriumdesoxycholatSigma-AldrichD6750
Natriumhydroxid (NaOH)BioshopSHY700 aufreizend.
Nitrozellulose-Membran (0,45 mm)Bio-Rad162-0115
Essigsäure GletscherBioshopACE222.4Arbeiten unter dem Abzug. Giftig, reizend und brennbar.
Roter PonceauSigma-AldrichP3504   
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP3911 Für PBS-Zusammensetzung für Immunoblot.
Na2HPO4BioshopSPD307.5Für die PBS-Zusammensetzung für Immunoblot.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 Für PBS-Zusammensetzung für Immunoblot.
RinderserumalbuminSigma-AldrichA7906Für PBS-T-BSA-Zusammensetzung für Immunoblot.
Fettfreie TrockenmilchCarnation
Polysorbate 20 (Tween)MP Biomedicals103168Schneiden Sie das Ende der Spitze ab und pipetieren Sie langsam, da sie sehr dick ist.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Aliquotiert bei -20 oC. Frost/Auftauen vermeiden.
Anti-IRF-3-P-Ser396Hausgemacht19Lagern, aliquotiert bei -80 oC. Frost/Auftauen vermeiden.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Cell Signaling Technology4947sBei -20 oC lagern.
Anti-IRF-3-P-Ser398Hausgemacht15Lagern bei -80 oC. Frost/Auftauen vermeiden.
Anti-IRF-3-Actif-Motiv in voller Länge39033Aliquotiert bei -80 oC lagern. Frost/Auftauen vermeiden.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781Store aliquotiert bei -20 oC.
Western Lightning Chemilumineszenz-Reagenz PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini CCD-KameragerätGE Healthcare
SDS-PAGE Molekulargewichtsstandards, BreitenbereichBio-Rad161-0317Aliquotiert bei -20 oC.

Referenzen

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

IRF3 AktivierungPhosphorylierungsanalyseSDS PAGENative PAGEImmunoblotSendai VirusGanzzellextraktphosphospezifische Antik rpernicht denaturierende Elektrophoresehochaufl sendes Gel
Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.