Ein Druckinjektionssystem zur Untersuchung der Neuropharmakologie der Informationsverarbeitung in Awake Behaving Makaken Cortex

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die Druckinjektion von neuropharmakologischen Substanzen während der Einzelzellaufzeichnung bei einem wachen, sich verhaltenden Makaken. Dieses Verfahren ermöglicht eine pharmakologische Manipulation in unmittelbarer Nähe einer kortikalen Aufnahmestelle.

Zusammenfassung

Die Top-Down-Modulation der Feed-Forward-Kortikalinformationsverarbeitung ist funktional wichtig für viele kognitive Prozesse, einschließlich der Modulation der sensorischen Informationsverarbeitung durch Aufmerksamkeit. Allerdings ist wenig darüber bekannt, welche Neurotransmittersysteme an solchen Modulationen beteiligt sind. Eine praktische Möglichkeit, diese Frage zu beantworten, besteht darin, die Einzelzellaufzeichnung mit lokaler und temporärer neuropharmakologischer Manipulation in einem geeigneten Tiermodell zu kombinieren. Hier demonstrieren wir eine Technik, die akute Einzelzellaufnahmen mit der Injektion von neuropharmakologischen Wirkstoffen in die direkte Nähe der Aufnahmeelektrode kombiniert. Das Video zeigt die Vorbereitung des Druckinjektions-/Aufzeichnungssystems einschließlich der Vorbereitung der zu injizierenden Substanz. Wir zeigen einen Rhesusaffen, der eine visuelle Aufmerksamkeitsaufgabe ausführt, und das Verfahren der Einzelaufzeichnung mit blockweisen pharmakologischen Manipulationen.

Einleitung

In kortikalen und subkortikalen Bereichen wird die neuronale Aktivität durch verschiedene Neuromodulatoren beeinflusst, zum Beispiel Acetylcholin¹. Diese modulatorischen Effekte auf neuronale Reaktionen wurden in in vitro-Studien ² sowie in elektrophysiologischen Aufzeichnungen von anästhesierten Tieren³ und systemischen pharmakologischen Manipulationen beim Menschen⁴ berichtet. Die genaue Rolle der verschiedenen Neuromodulatoren und die Beteiligung verschiedener Rezeptor-Subtypen sind jedoch weitgehend unbekannt. Um die Auswirkungen spezifischer Neuromodulatoren auf die Aktivität einzelner Neuronen zu messen, ist es wünschenswert, eine vorübergehende Neuromodulatoränderung so nah wie möglich an der Aufzeichnungselektrode zu induzieren. Darüber hinaus ist es wichtig, dass diese Manipulationen bei wachen Tieren durchgeführt werden, da kognitive Funktionen nur ohne Anästhesie vorhanden sind. Darüber hinaus interagiert die Anästhesie mit cholinergen und GABAergen Systemen^5,6 und kann zu Veränderungen der neuronalen Aktivität führen³.

In den letzten Jahrzehnten wurden zwei Hauptmethoden der lokalen Wirkstoffverabreichung entwickelt und verfeinert: Iontophorese und Druckinjektion. Bei beiden Methoden werden die Medikamente durch Mikropipetten aus Glas oder Stahl verabreicht. Bei der Iontophorese regelt ein elektrischer Strom die Freisetzung des Medikaments⁷. Zusätzlich gibt es einen signifikanten Beitrag der Elektroosmose zur Gesamtmenge der ausgestoßenen Moleküle⁸, der sowohl mit dem Spitzendurchmesser⁹ der Mikropipette als auch mit der Konzentration⁸ der verwendeten Substanz korreliert. Die Iontophorese ist ein leistungsstarkes Werkzeug, um kleine Volumina von Nervengewebe schnell und präzise zu manipulieren. Für iontophoretische Injektionen werden in der Regel Mehrzylinder-Mikropipetten¹⁰ verwendet, wobei eine als Aufzeichnungsvorrichtung fungiert, während die anderen Positionen als Verabreichungspipetten dienen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass nur geladene Moleküle verwendet werden können, was die Auswahl der Medikamente stark einschränkt.

Die Druckinjektion verwendet entweder Luftkompression oder mechanischen Druck, um eine Substanz aus einer Mikropipette auszustoßen. Mit dieser Methode kann jede lösliche Substanz, geladen oder ungeladen, verwendet werden, einschließlich großer Moleküle. Die Methode der Druckinjektion wurde erstmals 1933 von Reyniers beschrieben und in den 1950er Jahren weiter verfeinert (siehe Lalley¹¹ für einen Überblick). In den 1980er Jahren wurde das Verfahren weiter verfeinert, um die Abgabe von Mengen im Nanoliterbereich (hauptsächlich Lidocain¹²) an ein definiertes Hirnareal¹³ bei gleichzeitiger Einzelzellaufzeichnung zu ermöglichen. Das ausgestoßene Volumen wurde in der Regel durch Beobachtung der Bewegung eines Markers, wie z. B. des Meniskus im oberen Teil der Pipette¹³, überwacht. Die Druckinjektion wurde erstmals in den 1990er Jahren bei wachen Tieren eingesetzt, sowohl extrazellulär¹⁴ als auch intrazellulär^15,16. Basierend auf der in diesen Studien gewonnenen kumulativen Expertise ist es nun möglich, in Kombination mit pharmakologischer Manipulation zuverlässig aus verschiedenen Hirnstrukturen zu erfassen (siehe¹⁷ für einen Vergleich aktueller Druckinjektionssysteme).

Ein anhaltendes offenes Problem für beide Verabreichungsmethoden ist die Schwierigkeit, das genaue injizierte Volumen zu bestimmen. Dies ist eine noch größere Herausforderung für Experimente mit wachen, sich verhaltenden Rhesusaffen, bei denen das Tier die Versuchsaufgabe in einem separaten Raum durchführt. Dies kann durch den Einsatz eines softwaregesteuerten Systems gemildert werden, anstatt sich auf einen visuellen Marker zur kontinuierlichen Überwachung einer Injektion zu verlassen.

Das hier beschriebene System ist eine Erweiterung eines etablierten elektrophysiologischen Aufzeichnungssystems (Mini Matrix System) und kombiniert eine Injektionspipette mit mehreren parallel ausgerichteten Aufzeichnungselektroden in definierten Abständen in einer anpassbaren Anordnung. Eine pharmakologische Manipulation des Gewebes in der Nähe der Aufzeichnungselektrode ist mit nur einer kleinen Menge Substanz möglich, was eine schnelle Genesung gewährleistet und mehrere Injektionsblöcke und Kontroll-/Wiederherstellungsblöcke innerhalb des begrenzten Zeitfensters ermöglicht, das die Verhaltensaufgabe des Tieres bietet.

Protokoll

Tierpflege und alle experimentellen Verfahren wurden nach den deutschen Gesetzen der Tierpflege und genehmigt von der Bezirksregierung Braunschweig, Niedersachsen, Deutschland durchgeführt.

Hinweis: Da das Experiment in vivo durchgeführt wird, ist es entscheidend , eine möglichst hohe Hygienestandards aufrechtzuerhalten. Wann immer möglich, arbeiten unter sterilen Bedingungen.

1. Stellen Sie die Injektion / Recording System vorbereiten

1. Sterilisieren das Rohr, das die Mikropipette mit der Spritze verbindet. Verwenden Sie die kürzeste Länge des Rohres möglich, in der Versuchsaufbau zwischen Einspritzpumpe und elektroAufzeichnungsSystem.
2. Reinigen Sie die Führungsrohre des Aufzeichnungssystems mit Reinigungsdrähte. Tauchen sie in sterilen Silikonöl und füttern sie durch die einzelnen Führungsrohre mehrmals.
3. Legen Sie die Quarzglas-Mikropipette in ein Führungsrohr des Aufzeichnungssystems. Siehe Abbildung 1A.
4. Nach dem Fixieren der Mikropipette indas Aufzeichnungssystem, heften sich an den Metallstift des Mikro die sterilen Röhrchen. Pass auf; obwohl die Mikropipette im System festgelegt ist, kann sie leicht brechen, wenn das Rohr anbringen. Verwenden Sie zwei sterile Pinzette gleichen Druck auf den Stift und das Rohr aufzubringen.
5. Verwenden Flüssigkeit Superkleber die Verbindung zwischen Rohr und Mikro abzudichten. Warten Sie mindestens 3 Stunden für den Kleber vor dem Befüllen der Mikropipette mit Flüssigkeit zu härten.
6. Einfügen Mikroelektroden (beispielsweise Quarzglas isolierten Platin Wolfram) in den anderen Positionen des Aufzeichnungssystems vor oder nach dem Einsetzen Mikropipette.

2. Vorbereitung des Stoffes

1. Sterilisieren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die spätere Lagerung von Injektionslösungen einen Autoklaven oder andere zuverlässige Verfahren.
2. Wiegen Sie die entsprechenden Substanz Scopolamin-hydrochlorid 5 ml einer 0,1 molaren Lösung herzustellen. Man löst in steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl).
3. Unter sterilen Bedingungen ina Dunstabzug, filtern Sie die Lösung mit einem Spritzenfilter mit ausreichend großen Porendurchmesser unter Verwendung von zB 0,2 & mgr; m.
4. Unter der Dunstabzug, Aliquotierung der Lösung in Mengen ausreichend für ein einzelnes Experiment, zum Beispiel für Scopolamin, 500 & mgr; l in sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie dunkle Röhren, die Substanz vor Licht zu schützen; alternativ wickeln Rohre in Aluminiumfolie. Für Scopolamin, speichern Sie die Lösung für bis zu 14 Tage bei 4 ° C.

3. Tägliche Vorbereitung der Injektion / Recording System

Hinweis: Wenn in dem Aufzeichnungssystem montiert ist, werden die Elektroden und Mikro gespeichert in einer Enzymlösung (Tergazyme, 1% ige Lösung mit deionisiertem Wasser) zwischen den Aufnahmen. Die folgenden Schritte müssen vor jeder Aufnahme durchgeführt werden.

1. Sammeln eines Rohrs der Substanz eingespritzt werden. Lassen Sie es auf RT kommen, wenn gekühlt.
2. Entfernen Sie die Injektion / Aufzeichnungssystem aus der Enzymlösung und spülen Elektrodenund Mikropipette mit VE-Wasser zu reinigen vollständig Enzymlösung.
3. Entfernen Sie die vordere Abdeckung des Aufzeichnungssystems überprüfen, um visuell die Dichtung zwischen Mikro und Rohr.
4. Bewerben sterilen Silikonöl auf das Führungsrohr Lücke (siehe Abbildung 1A) und Spitzen der Elektroden und Mikro, um das System für die reibungslose Bewegung zu schmieren.
5. Prüfen Sie Tipps von Elektroden und Mikropipette mit einem Mikroskop auf Unversehrtheit zu gewährleisten. Ausrichten der Elektroden und der Mikropipette unter dem Mikroskop, so dass sie aus der Führungsrohre mit der gleichen Länge erstrecken. Fahren sie in die Führungsrohre, Stoppen, sobald sie nicht mehr sichtbar sind. Dies wird als Elektrodenposition Null definiert. Eingestellt, die Tiefe der Elektroden und Mikropipette auf 0 in der Software.
6. Füllen Sie eine sterile Spritze mit steriler Kochsalzlösung und führen Sie die Nadel in die Röhre, kümmert sich nicht um die Wand des Rohres zu durchbohren. Treiben die Mikropipette aus dem Führungsrohr für visual Kontrolle der Stoffstrom.
7. Flush mindestens 2 ml steriler Kochsalzlösung durch das Röhrchen und Mikropipette keine Luft sicherzustellen bleibt in der Spritze oder in die Röhre. Nicht zu viel Druck auf den Kolben der Spritze anzuwenden. Sicherstellen, dass die Verbindung zwischen Rohr und Mikro abgedichtet wird. Wenn Leckage sichtbar ist, wieder kleben Sie die Kreuzung (siehe Schritt 1.5) und die Aufnahme zu verschieben.
8. Füllen Sie eine neue sterile Spritze mit der Lösung injiziert werden und es mit dem Lauf der Salz Spritze auszutauschen, das heißt, halten Sie die Nadel der Kochsalzlösung gefüllte Spritze in die Röhre. Stellen Sie sicher, dass keine Luft in das System übertragen wird. Dies wird am besten erreicht, indem die Nadelnabe mit Kochsalzlösung füllen, nachdem die Kochsalzlösung gefüllte Trommel zu entfernen.
9. Spülen Sie das System mit 250 ul der Lösung injiziert werden, um vollständig die Kochsalzlösung aus dem Rohr zu entfernen.
10. Verwendung der Motorsteuerungssoftware einfahren Elektroden und Mikropipette in die guidetubesto eine Tiefe von mindestens -500 um.
11. Senken Sie das Führungsrohr Ring (1A) an der Unterseite der Führungsrohre ihre festen relativen Position zu halten.
12. Reinigen Sie die Basis des Systems mit Ethanol, insbesondere dann, wenn es die Affen Aufnahmekammer berührt.
13. Schließen Sie das Aufzeichnungssystem durch die vordere Abdeckung zu ersetzen und die Schrauben festziehen.

4. Validierung des Einspritzsystems

Hinweis: Obwohl das Unternehmen das System kalibriert, ist es empfehlenswert, die ausgeworfenen Bände mit den Materialien in den Versuchsaufbau (Schläuche, Spritzen etc.) zu validieren.

1. Bereiten, das System als in Schritt 3 beschrieben, halten Elektroden und Mikropipette aus den Führungsrohren verlängert. Eine Tiefe von mindestens 7,000 & mgr; m wird empfohlen, entlang der äußeren Oberfläche der Mikropipette und der Elektroden aufgrund von Haftungsverlust des Messvolumens zu vermeiden.
2. Legen Sie das Aufzeichnungssystem in der Lage, es verwendet wird, während des Experiments in und setzen Sie den syringe in die Mikroinjektionspumpe. Befestigen Sie die Spritze an Ort und Stelle mit dem Gummiband und verstellbaren Griff (siehe Abbildung 1A). Schieben Sie den beweglichen Teil der Pumpe, bis sie fest an ihrem Platz hinter dem Kolben der Spritze ist.
3. Verwendung der softwaregesteuerten Motoreinheit auszuwerfen ein Volumen groß genug , um genau gemessen zu werden, z. B. 1.000 nl. Es ist bevorzugt, einen einzigen Schritt zu verwenden, um das Gesamtvolumen um auszuwerfen Wirkungen Kapillarwirkung entlang der Mikropipette Oberfläche zu vermeiden. Sehr niedrige Geschwindigkeiten (1 nl / s) kann auch während der Validierungsverfahren zu diesem Effekt führen.
4. Sammeln Sie das Gesamtvolumen in einem Behälter unter der Mikropipette platziert, oder vorsichtig den ausgestoßenen Tropfen direkt von der Spitze der Mikropipette zu sammeln. Schätzen Sie das ausgeworfene Volumen mit einer Pipette oder durch mit einer Präzisionswaage.
5. Wiederholen Sie den Vorgang mehrmals Messungen bestätigen.

5. Akute Recordings

1. Stellen Sie die xy-Positiondes Aufzeichnungssystems. Dies definiert den Punkt, an dem die Führungsrohre der Dura mater in der chronisch implantierten Aufnahmeraum gelangen. Achten Sie darauf, die Führungsrohre vollständig zurückgezogen sind (Führungsrohr z-Position 0).
2. Bringen Sie das Aufnahmesystem in die richtige Position und legen Sie die Spritze in der Mikroinjektionspumpe. Befestigen Sie die Spritze an Ort und Stelle mit dem Gummiband und verstellbaren Griff (siehe Abbildung 1A). Schieben Sie den beweglichen Teil der Pumpe, bis sie fest an ihrem Platz hinter dem Kolben der Spritze ist. Wenn ein Tropfen der Substanz an der Spitze der Führungsrohre sichtbar ist, entfernen Sie vorsichtig eine sterile Wattestäbchen verwenden.
3. Bereiten Sie das Tier zur Aufzeichnung nach dem Verfahren des Labors (siehe ¹⁸ zB Richtlinien).
4. Sichere Montage des Aufzeichnungssystem auf der Aufzeichnungskammer des Affen.
5. Langsam manuell die Führungsrohre in die Aufnahmekammer abzusenken, bis die dura erreicht ist, fahren dann die Elektroden den Motor Co mitntrol Software.
6. Da es nicht möglich ist, Impedanz der Mikropipette zu messen, zuerst mit Elektroden treiben und ihre Impedanzen regelmäßig in verschiedenen Tiefen überprüfen. Nach einer Penetration der Dura erfolgreich ohne Beschädigung der Elektroden durchgeführt wird, vorab die Mikropipette.
7. Treiben die Elektroden und der Mikropipette an die Zielelektrode Tiefe, bei der das Gehirn Bereich von Interesse erwartet wird, gefunden werden. vorzurücken langsam die Elektrode bis es nahe genug ist, um die Aktivität einer einzelnen Einheit zu erfassen, wie es durch ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis in dem aufgezeichneten Signal belegt. Wichtig ist, positionieren die Aufzeichnungselektrode und der Mikropipette in derselben Tiefe der Mindestabstand zwischen der Elektrode und Mikropipette zu gewährleisten.
   1. Wenn möglich, die Elektroden und Mikro in dieser Tiefe für die gesamte Aufzeichnung. Wenn jedoch der einzige Weg, die Signalqualität des aufgezeichneten Zelle zu halten ist, um die Elektroden zu bewegen, fahren dann die Elektroden und der Mikropipettegleichzeitig den Abstand zwischen ihnen zu halten.

6. Räumliche Achtung Aufgabe

1. In einer Reihe von Studien, präsentieren zwei bewegliche Punktmuster auf dem Bildschirm, in dem rezeptiven Feld des aufgenommenen Neuron positioniert einen und dem anderen außerhalb davon, zusammen mit einem zentral präsentierten Fixationspunkt , dass das Tier während jeder Versuch zu foveate hat ^{19, 20.}
   Hinweis: Der Affe trainiert wird , auf eine Richtungsänderung in der cued Punktmuster (das Zielereignis) zu ignorieren , jede Richtungsänderung in der anderen Punktmuster zu reagieren, und wird mit einem Tropfen Flüssigkeit für jeden erfolgreichen Abschluss einer Studie ^{19 belohnt, 20.} Als sensorische Kontrollbedingung, hat der Affe eine Helligkeitsänderung des Fixationspunkt zu berichten , während beide bewegende Punktmuster zu ignorieren (Abbildung 2 für eine detailliertere Beschreibung der Aufgabe sehen).

7. Pharmakologische Manipulation während der Aufnahme

Hinweis: Während der Affe die Aufgabe ausführt, die Substanz in einem blockweise injizieren. Drei aufeinanderfolgende Blöcke definiert: Steuerung, die als Grundlage dient; während dessen Injektion, ein Stoff ausgestoßen; und Erholung, in denen gezielt die Zellen durch die Injektion Rückkehr zum Ausgangswert.

1. Während eines Einspritzblock injizieren eine vordefinierte Menge der Substanz in regelmäßigen Abständen z. B. 2 nl pro Minute mit einer Rate von 2 nl / s. Für dieses Beispiel verwenden Scopolamin-Hydrochlorid. Der Einspritzvorgang wird mit einer Software gesteuert, die verschiedene Optionen zur Verfügung stellt. Verwenden Sie zum Beispiel die Sprungfunktion Injektionsvolumen zu definieren, und drücken Sie den Injektionsknopf jede Minute nach dem Takt der Aufnahmesoftware.
   Hinweis: Die genaue Dauer der Injektion Block Substanz ist und experimentieren abhängig, zum Beispiel für Scopolamin Gebrauch 2 nl Injektionen pro Minute für 10 Minuten (20 nl insgesamt).. Es wird bevorzugt, nicht die Elektroden und Mikro duri voranng der Injektionsblock.
2. Beachten Sie die Zeit und den Versuch, in dem die Substanz injiziert wird, um die Tiefe der Elektroden und Mikropipette, sowie die Menge der ausgestoßenen Substanz.
3. Folgen Sie der Injektionsblock mit einem Wiederherstellungsblock, in dem keine Substanz injiziert wird. Die Dauer des Wiederherstellungsblock ist stoffspezifisch und muss in Vorversuchen festgelegt werden. Überwachen und halten Sie die Aufnahmequalität der ausgewählten einzelnen Einheiten bis zum Ende des Wiederherstellungsblock.
4. Wiederholen Sie die drei Blöcke für so lange, wie die Aufnahmequalität und Motivation des Affen ermöglichen.

8. Beitrag Aufnahmeverfahren

1. Nach der Datenaufzeichnung, einfahren Elektroden und Mikro in die Führungsrohre und dann die Führungsrohre manuell zurückzuziehen. Entfernen Sie das Aufzeichnungssystem von der Aufzeichnungskammer des Affen. Lassen Sie die Spritze aus der Einspritzpumpe und übertragen das System in den Vorbereitungsbereich für die Reinigung.
2. Behandeln Sie das Tier(einschließlich Reinigung des Aufnahmeraums ¹⁸⁾ nach den Standardverfahren des Labors und die Rückgabe an das Gehäuse Möglichkeiten.
3. Spülen der Außenseite der Führungsrohre mit Wasserstoffperoxid (3%) und dann mit deionisiertem Wasser. Antriebselektroden und Mikropipette aus den Führungsrohren, Spülen mit Wasserstoffperoxid und anschließend entionisiertes Wasser.
4. Austausch der Zylinder der Spritze mit einem Zylinder einer Spritze mit steriler Kochsalzlösung gefüllt ist, hält die Nadel in der Röhre. Spülen Sie die Schläuche und die Mikropipette mit 1-2 ml Salzlösung. Nach dem Spülen entfernen Sie den Lauf und füllen Sie es mit Luft. Setzen Sie den Lauf in die Nadel und trocknen Sie die Röhre und die Mikropipette von innen, indem Luft durch vorsichtig hineinschieben.
5. Lagern Sie die Führungsrohre, verlängerte Elektroden und Mikro in der Enzymlösung eingetaucht ein Austrocknen zu verhindern sowie den Abbau von organischem Material zu gewährleisten.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die räumliche Aufmerksamkeit Aufgabe der Affe durchgeführt , während der Einspritzvorgang durchgeführt wurde. Der Affe trainiert wurde, um entweder den Reiz innerhalb des rezeptiven Feldes des aufgenommenen Neuron (Teilnahme-in), der Reiz liegt außerhalb des rezeptiven Feldes (Teilnahme-out) oder den Fixierungspunkt (Teilnahme-fix) gelegen zu besuchen. Diese Bedingungen ermöglichen einen Vergleich der neuronalen Aktivität in verschiedenen Aufmerksamkeitszuständen.

Figur 3 zeigt eine peri-Stimuluszeit - Histogramm einer Probe Neurons in einem Experiment unter Verwendung von Scopolamin, einem Muscarin - cholinergen Antagonisten. Der Plot zeigt die Reaktion Unterdrückung während der Scopolamin-Injektion im Vergleich zu keiner Injektion, wenn ein Muster in der Zelle bevorzugte Richtung zu bewegen ist im Inneren des Neurons rezeptiven Feld präsentiert und wird von dem Tier besucht. Die beiden ersten Spitzen repräsentieren das Neuron9; s Antwort auf die On- und Offset des räumlichen Cue, die innerhalb seiner rezeptiven Feld erscheint. Dies wird durch die Reaktion auf das Bewegungsmuster folgt, das auf dem Bildschirm 500 ms nach dem Beginn cue erscheint. Die grau schraffierte Fläche zeigt die Analyseperiode verwendet, um die durchschnittliche Feuerungsrate für jeden Versuch zu berechnen. Der grüne Bereich unterstreicht die unterdrückende Einfluss von Scopolamin-Injektion auf die Feuerrate der Zelle. Der dunkelgrüne Bereich zeigt die Unterdrückung innerhalb der Analyseperiode.

4A zeigt die Wirkung von Scopolamin auf die durchschnittliche Feuerungsrate der Probe Neuron in jeder der drei attentional Bedingungen. Die Feuerrate des Neurons für die beiden räumlichen Aufmerksamkeit Bedingungen (Aufmerksamkeit innerhalb oder außerhalb des rezeptiven Feldes des Aufzeichnungs Neuron) sowie für die sensorische Zustand (Achtung bei Fixationspunkt) fiel kurz nach der ersten Injektion des Injektionsblock (grau schattierte sinda) und während des Rückgewinnungsblock nach einer Verzögerung auf das gleiche Niveau wie vor der Injektion erhöht.

4B zeigt eine Steuerung von einer zweiten Probe neuron Aufzeichnung in denen Kochsalzlösung (0,9% NaCl) injiziert wurde, wie für den Scopolamin - Injektion das gleiche Protokoll verwenden. Während der Injektion blockieren keine Änderung in der Kadenz des Neurons beobachtet wurde, im Vergleich zu dem Steuerblock.

Abbildung 1. Set-up für die pharmakologische Manipulation verwendet während der Aufnahme. (A) zeigt die Mikroinjektionspumpe und das elektroAufzeichnungsSystem ausgerüstet mit Elektroden und Mikro. Das Führungsrohr Lücke, in die Silikonöl eingesetzt wird, um die Elektroden und Mikro zu schmieren, wird vergrößert dargestellt. (B) Zeigt ein Beispiel Mikro ( siehe oben)und Aufzeichnungselektrode (unten). Für Größenvergleich, ein Euro - Cent (Durchmesser: 16 mm). Unten platziert Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Task - Design räumliche Aufmerksamkeit zu lenken. Monkeys wurden ausgebildet , um eine Bewegungsrichtung Änderung der cued Punktmuster zu erkennen. Der Cue wurde entweder innerhalb des Neurons rezeptiven Feldes platziert (Teilnahme-in), wie in der Figur gezeigt, oder außerhalb (Teilnahme-out). Als sensorische Kontrolle wurde der Affe , der einen Helligkeitsänderung des Fixierungspunkt zu erfassen , trainiert (Teilnahme-fix). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Einfluss des Antagonisten Scopolamin auf Feuerrate. Die peri-Stimulus Zeit - Histogramm für eine Probe Neuron ist für die attend-Zustands (Aufmerksamkeit innerhalb der rezeptiven Feld des aufgenommenen Neuron) während des Spritzblock und während des Steuerblocks gezeigt. Die x-Achse zeigt die Zeit in Millisekunden nach cue Einsetzens und der y-Achse zeigt die Feuerungsrate in spikes / sec. Der graue Bereich zeigt die Analyseperiode (300-800 ms nach Beginn des Stimulus) verwendet, um die Studie gemittelten Feuerrate zu berechnen. Der grüne schattierte Bereich zeigt die Unterdrückungsrate über die beiden Bedingungen in Brand. Die dunkelgrüne Farbe hebt die Unterdrückung im Analysezeitraum. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Wirkung von Scopolamin und Kochsalzlösung auf Feuerrate. (A) -Antagonisten Scopolamin - Injektion. Die Probegemittelten Feuerungsrate der Probenzelle aus 3 über den Verlauf des Experimentes wird für alle drei attentional Bedingungen für die bevorzugte Stimulus gezeigt. Die x-Achse zeigt die Teststartzeit in Minuten und die y-Achse zeigt die Feuerrate der Einheit in Spikes pro Sekunde. Symbole ( Teilnahme-in, Teilnahme-fix, Teilnahme-out) repräsentieren die Feuerrate des Neurons in der Analyseperiode in jeder erfolgreich durchgeführt Versuch und horizontale Linien (durchgezogene Linie: Teilnahme-in, gepunktete Linie: Teilnahme-fix, gestrichelte Linie: Teilnahme-out) zeigen durchschnittliche Feuerungsrate für die drei verschiedenen experimentellen blocks (Kontrolle, Injektion, Verwertung). Die grau schraffierte Fläche zeigt das Injektionsblock, mit der ersten Injektion beginnt und endet 1 min nach der letzten Injektion. Während des Einspritzblocks 2 nL von 0,1 molar Scopolamin wurden jede Minute mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 2 nl / s injiziert. (B) Saline - Injektion. Die Brennrate einer Probenzelle über den Verlauf des Steuer Experiment wird für die bevorzugte Stimulus für alle drei attentional Bedingungen gezeigt. Grau schraffierte Fläche visualisiert den Block von Salzinjektion. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Hier haben wir im Detail dargestellt, wie Single-Cell-Aufnahmen mit einem "off-the-shelf" zuverlässige und präzise Injektionen und qualitativ hochwertige Druckeinspritzsystem auszuführen. Während diese Methode der Arzneimittelabgabe vorher in benimmt Affen ( zusammengefasst in ¹⁷⁾ verwendet wurde, präsentiert das System hier hat Vorteile, unter prüft.

Wie in 4A dargestellt, kann mit und ohne pharmakologische Injektionen in unmittelbarer Nähe der Aufnahmeort stabile Messung der Aktivität einzelner Neurone liefern das hier beschriebene System. Wie in 4B gezeigt, hat die Injektion einer Kontrollsubstanz, Salzlösung, nicht Geschwindigkeit beim Brennen zu einer Veränderung führen. Diese Steuerung veranschaulicht, dass der Einspritzvorgang selbst keinen meßbaren Einfluß auf die Brenneigenschaften der aufgezeichneten Neuronen aufweist.

Die räumliche Anordnung von Neuron, Aufzeichnungselektrode und Mikro ist von entscheidender in diesen Experimenten Bedeutung. Obwohl eine genaue Messung ihrer relativen Positionen in dem Gewebe während der Aufzeichnung nicht möglich ist, können wir auch für mögliche Quellen Varianzsteuerung berücksichtigen. Zuerst wird während Volumen Injektion besteht das Risiko, daß das Neuron in der Nähe von der Aufzeichnungselektrode weg verschoben werden kann, um die Stabilität der aufgezeichneten Signale zu beeinflussen. Aus diesem Grund ist es ratsam, die Feuerrate vor und nach der Injektion Block zu vergleichen Signalstabilität zu überprüfen. Zweitens definiert der Führungsrohr - Konfiguration des Aufzeichnungssystems um den Abstand zwischen den Elektroden und Mikropipette (z. B. 305 & mgr; m in der konzentrischen 3-Kanal - System in diesem Experiment verwendet). Da die Systemsteuerung für die Tiefe der Elektroden und Mikropipette in das Gewebe präzise Position bereitstellt, kann der Abstand zwischen ihnen durch eine sorgfältige Kalibrierung relativen Tiefe vor der Aufzeichnung (Schritt 3.5), und halten sie in einer gemeinsamen Tiefe während Aufnahmen minimiert werden.

ent "> Mögliche Einschränkungen
Zusätzlich zu in-house Qualitätskontrolle durch den Hersteller, muss das System unter Laborbedingungen validiert werden, da verschiedene Marken von Rohren usw. Spritzen verwendet werden können und auf Unterschiede in der ausgeworfenen Volumina führen könnte. Obwohl das System, wie in dem Experiment sehr kleinen Volumina zu injizieren, verwendet werden können, hier dargestellt, sind diese unter dem Mindestvolumen, das aus praktischen Messgrenzen in einer normalen Laborumgebung validiert werden kann. Jedoch können größere Injektionsvolumina, die die Beziehung zwischen dem Software-definierten Volumen und dem Volumen, das durch die Hardware ausgeworfen abzuleiten verwendet werden. Wenn transparente Röhren verwendet werden, eine zusätzliche visuelle Kontrolle des Einspritzvorgangs ist durch die Verschiebung eines visuellen Marker zu messen.

der Mikropipette in das System einfügen ist anspruchsvoller als Elektrodeneinführungs, als der Durchmesser der Mikropipette etwas größer ist und das Material ist zerbrechlicher. In Ergänzung,das Rohr an den Stift der Mikropipette Füge ist anspruchsvoll, da es den oberen Teil der Mikropipette eine hohe Bruchgefahr birgt. Jedoch ist die Lebensdauer eines erfolgreich geladen Mikro mehrere Monate auch bei den täglichen Gebrauch.

In der Praxis haben wir noch nicht eine Blockierung in der Injektionssystem während Nachaufzeichnung Reinigung des Systems auftreten. Nichtsdestoweniger ist kein "online" Überprüfung möglich ist, und es besteht die Gefahr, dass eine physikalische Blockierung (wie Gewebe an der Mikropipettenspitze) könnte Stoffeinspritzung zu verhindern. Es kann daher ratsam sein, die Daten konservativ zu analysieren, wie sie nur jene Zellen, in die weitere Analyse einschließlich, die zwischen den Kontroll- und Injektions Blöcke des Experiments in Feuerraten deutliche Veränderungen ergeben.

Trotz ihres geringen Durchmessers, Mikroelektroden und Pipetten werden Hirngewebe verdrängen und kann einige lokale Gewebeschäden verursachen. Dies kann durch die manuelle Positionierung der Spitze th minimiert werdene Führungsrohre knapp oberhalb der Dura mater. Die Elektroden dringen dann die Dura und ihre Intakt geschlossen wird durch ihre Impedanzen Online-Messung. Danach wird die Mikropipette eingeführt. Bei dieser Methode wird eine regelmäßige Entfernung von Gewebe oberhalb der Dura empfohlen, um die Gefahr einer Elektrode oder Pipette Bruch weiter zu reduzieren.

Vergleich zu alternativen Methoden
Das hier verwendete System zeigt deutliche Vorteile gegenüber anderen Druckeinspritzsystemen. Einen starken Vorteil ist der Durchmesser der Mikropipette (ca. 100 um), der ¹⁷ die Hälfte der Größe von anderen verfügbaren Sonden und daher minimiert neuralen Gewebeschäden. Im Gegensatz zu früheren Entwürfen setzt das aktuelle System räumlich Aufzeichnungselektrode und Mikro getrennt. Obwohl andere Systeme einen geringeren Abstand zwischen Elektrode und Pipette bereitzustellen beschriebene System ermöglicht hier unabhängig Tiefenänderungen von Elektroden und Pipette, wodurch permitting variablen relativen Abstände innerhalb einer Aufnahme-Session. Wichtig ist, muss keine Kompromisse in Bezug auf die Aufnahmequalität gemacht werden, da das Einspritzsystem eine Erweiterung eines etablierten Aufnahmegerät ist. Während nur eine Mikropipette und damit eine Substanz in diesem Protokoll verwendet wird, ist es möglich, mehrere Substanzen innerhalb eines experimentellen Verfahrens zu injizieren. Um dies zu erreichen, können mehrere Mikropipetten in separate Führungsrohre eingeschraubt werden und mit Spritzen in Einzeleinspritzpumpen montiert. Schließlich ist das System einfach zu steuern, da nur ein Computerprogramm benötigt wird, um die Elektroden und Mikropipette, zu fördern und die Druckeinspritzung während des Experimentes durchzuführen.

Vergleichen Druckeinspritzung zu Iontophorese gibt es relativen Vorteile und Nachteile. Zum Beispiel erfordert Druckeinspritzung größere Mengen in das Gewebe als Iontophorese eingebracht werden, wodurch das Risiko von neuronalen Verschiebung zu erhöhen. Der aktuelle Prototypcol verwendeten Volumen im nL-Bereich, und wir selten erlebt spürbaren Veränderungen in einer Signalqualität der aufgenommenen Zelle. Das System erlaubt auch größere Volumina injiziert werden, die für verhaltens Manipulationen potentiell nützlich ist, jedoch könnte die Stabilität neuronaler Aufnahme auswirken. Ein klarer Vorteil von Druckeinspritzung über Iontophorese ist die größere Vielfalt der verwendbaren Substanzen, da es nicht erforderlich ist, geladene Substanzen zu verwenden. Allerdings pH - Werte sollten zwischen Versuchs- und Kontrollsubstanzen (z. B. Kochsalzlösung) geprüft und verglichen werden.

Die Frage kann entstehen, warum die seit langem etablierte Methode der Druckeinspritzung zu verwenden, anstatt von neueren Techniken wie Optogenetik für neuronale Aktivität zu manipulieren. Obwohl auch bei Nagern gegründet, ist noch nicht zuverlässig Optogenetik in Rhesusaffen etabliert. Insbesondere gibt es noch nicht die lokale Manipulation von Zellen ermöglichen, die selektiv für einen bestimmten Neurotransmitter-Typ. Auf längere Sicht sehen wirein großes Potential für die Kombination der Vorteile der pharmakologischen Manipulationen mit den Vorteilen der optogentic Manipulationen in die neurale Basis der kognitiven Funktionen aufzuklären.

Hier haben wir gezeigt, wie Druckinjektion kann verwendet werden, um pharmakologisch einen lokal begrenzten Bereich im Gehirn wach manipulieren, verhalten Rhesusaffen. Wir hoffen, dass diese Methode andere Wissenschaftler inspiriert neuromodulatorischen Beiträge an die Dynamik der neuronalen Aktivität zu untersuchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(-)-Scopolaminhydrochlorid	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339,81 g/mol
NaCl 0,9 %	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Enzym Detergen
Wasserstoffperoxid	Roth		Verwendet in 3%iger Lösung mit deionisiertem Wasser
Ethanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Deionisiertes Wasser
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Spritze und Nadel
Eppendorf Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, gelb	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Quarzglas-Mikropipette	Thomas Recording
Recording-Elektrode	Thomas Recording		Quarz-/Platin-Wolfram-Faserelektrode; Impedanzwert 1-2 MΩ   und 0,3-0,5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Maße: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Sekundenkleber
Silikonöl	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Spritzenfilter
Mehrkanal Mikro-Injektionssystem	Thomas Recording		Mehrkanal-Mikroelektroden-Manipulator " System Eckhorn" ausgestattet mit Mikroelektroden und Mikropipetten und einer Präzisions-Mehrkanal-Mikroinjektionspumpe
McLab	kundenspezifische		interne Laborsoftware zur Steuerung der Reizpräsentation