RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

Zusammenfassung

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

Zusammenfassung

RNA-Interferenz (RNAi), ein natürlich vorkommendes Phänomen in eukaryotischen Organismen, ist ein äußerst wertvolles Werkzeug, das im Labor für funktionelle genomische Studien verwendet werden kann. Die Fähigkeit, einzelne Gene selektiv mit dieser reversen genetischen Technik auszuschalten, hat es vielen Forschern ermöglicht, die biologische Rolle zahlreicher Gene in vielen Organismen schnell aufzudecken, indem sie Funktionsverlust-Phänotypen bewerteten. Bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae besteht die vorherrschende Methode zur Verringerung der Funktion der Zielgene in der Injektion von doppelsträngiger (dsRNA) in den Hämocoel der adulten Mücke. Obwohl diese Methode erfolgreich war, schließt der Gen-Knockdown bei Erwachsenen die funktionelle Bewertung von Genen aus, die in präadulten Stadien exprimiert werden und möglicherweise eine Rolle spielen, sowie von Genen, die in einer begrenzten Anzahl von Zellen in adulten Mücken exprimiert werden. Wir beschreiben eine Methode zur Injektion von Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA während des frühen Puppenstadiums und validieren den SRPN2-Protein-Knockdown, indem wir verminderte Zielproteinspiegel und die Bildung von melanotischen Pseudotumoren in adulten SRPN2-Knockdown-Mücken beobachten. Dieser offensichtliche Phänotyp wurde bereits zuvor für den Knockdown der SRPN2-Funktion im adulten Stadium beschrieben, und wir haben diesen adulten Phänotyp durch SRPN2-Knockdown, der während der Puppenentwicklung initiiert wurde, rekapituliert. In Verbindung mit einer farbstoffmarkierten dsRNA-Lösung ermöglicht diese Technik eine einfache Visualisierung der Injektionsqualität und der Verteilung von dsRNA im Hämocoel durch einfache Lichtmikroskopie.

Einleitung

Malaria ist eine durch Moskitos übertragene Infektionskrankheit, die jedes Jahr viele Millionen von Menschen betroffen sind. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtet , dass im Jahr 2013 etwa 584.000 Todesfälle aufgrund von Malaria da waren, 78 Prozent davon ¹ bei Kindern unter dem Alter von fünf Jahren aufgetreten. Die Erreger , die menschliche Malaria verursachen , sind apicomplexan Parasiten der Gattung Plasmodium und zwischen ihren menschlichen Wirten von weiblichen Anopheles - Mücken übertragen. Die Übertragung erfolgt, wenn die Mücke eine Blutmahlzeit von einem Individuum nimmt die infiziert wird und dann Ablagerungen infektiösen Parasiten in einem nicht infizierten Individuum in einer nachfolgenden Blutmehl. Innerhalb der Gattung Anopheles, ist Anopheles gambiae die Spezies mit der größten vektorielle Kapazität und ist der prominenteste Malaria Vektor in Afrika südlich der Sahara ^1-3.

Derzeit setzt die Steuerung mit Moskito-Vektor durch den Einsatz von Insektiziden zu be die wichtigsten Verfahren eingesetzt, um die Belastung der menschlichen Malaria zu reduzieren. Obwohl die Verwendung von Insektiziden seit den 1960er Jahren als äußerst erfolgreich erwiesen hat, hat sich der Anstieg der Insektizidresistenz eine Notwendigkeit für die Entwicklung neuer Insektizide und alternative Kontrollstrategien ^4-7 angetrieben. Im Jahr 2010 zeigte eine insgesamt 49 von 63 Ländern der WHO berichtet das Auftreten von Insektizid - Resistenz der Malariavektoren ^1. Darüber hinaus berichtet der IR - Mapper - Tool, das Peer-Review - Literatur nutzt Widerstandsdaten in Afrotropis Regionen zu bewerten, dass es zwischen 2001 und 2012 46% und 27% Anstieg der Resistenz gegen Pyrethroide und dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) wurden jeweils ^7.

RNA - Interferenz (RNAi) wurde in den frühen 1990er Jahren als eine Technik identifiziert , die Gene in der Pflanze Petunia ^8,9 und in dem Pilz eingesetzt werden könnten Neurospora crassa ^9,10 zu inaktivieren. Kurz danach,1998 RNAi wurde zuerst ^9,11 als Mittel zur Verringerung der Genexpression in einem Tiermodell durch Einführung von Antisense oder Doppelstrang - RNA (dsRNA) über Injektion oder Fütterungsmethoden in Caenorhabditis elegans dokumentiert. Seit seiner Entdeckung hat RNAi die Ausübung der funktionellen Genomik revolutioniert, indem es den Forschern erlaubt reversen Genetik zu nutzen, um schnell die funktionelle Rolle von Genen von Interesse über eine hochselektive posttranskriptionales Gen-Silencing-Mechanismus zu untersuchen. In einigen Organismen, wie Drosophila melanogaster, die Verwendung von transgenen Organismen , die interfering RNA - Konstrukte exprimieren hat für Knock-Down (KD) weitgehend erfolgreich. Obwohl die Verwendung von Transgenen in An. gambiae für RNAi verwendet wurde , und kann nützlich für große Bildschirme beweisen, die Erzeugung von transgenen Moskitos Stämme ist sowohl arbeits- und zeitintensiv, in der Regel zwei bis drei Monate unter der Identifizierung eines Gens von Interesse für die Generati zu gehenauf einer entsprechenden transgenen Lager ^12. Derzeit ist die primäre Methode der Gen - KD in An. gambiae ist durch Injektion in die Hämolymphe, während der erwachsenen Stadium von dsRNA spezifisch für ein gegebenes Gen ^12,13. Dieser Vorgang dauert typischerweise etwa einen Monat nach Identifizierung eines Gens von Interesse zu Beurteilung des Gens KD zu gehen, was beweist , ¹² viel schneller als transgene Methoden. Methoden für die Larvenstadium RNAi wurden kürzlich in einem etablierten. gambiae und Aedes aegypti über Nanopartikel ^14-17 oder durch die orale Verabreichung von Mikroalgen-basierte dsRNA - Moleküle ¹⁸ Fütterung und bietet Möglichkeiten während der frühen Stadien der Entwicklung funktioneller Genomanalyse durchzuführen. In Direkteinspritzung, Fütterung, und zur Freisetzung von Nanopartikeln Verfahren wird dsRNA durch das Enzym Dicer in 21 bis 25 Nukleotide lange "short interfering RNAs" (siRNAs) ^19,20 autonom durch die Zielzelle und gespalten aufgenommen. Diese siRNAs sind dann incorporated in den RNA-induzierten Silencing - Komplex (RISC), von dem ein Strang abgelegt wird, das RNA-gebundene RISC - Komplex erlaubt die Ziel mRNA zu binden und zu spalten und dadurch das Niveau zu reduzieren und seine Übersetzung ^19,20 hemmen.

Viele wesentlichen Merkmale der grundlegenden Moskito Biologie modulieren vektorielle Kapazität, einschließlich Host - Präferenz (zB Geruchssinn, gustation), Paarung, Reproduktion und Immunität. die Bedeutung dieser biologischen Prozesse gegeben, ist es wahrscheinlich, dass ihre Modulation auf einem genetischen oder pharmakologischen Ebene neue Möglichkeiten zur Vektor-Kontrolle bieten, einschließlich der Umgehung von Insektizidresistenz, und neue Werkzeuge für die breiter integrierte Ansätze zur Vektor-Management. Die Verwendung von funktionellen Genomik die Rolle von Genen zugrunde, diese intrinsische biologische Merkmale zur Beurteilung Identifizierung neuer Ziele ermöglichen und neue Einblicke in das, wie wir neue effektiv zu erstellen, eine wirksamere Kontrolle strateger Jahren. Wir beschreiben die Entwicklung und den Einsatz einer schnellen Injektionsverfahren für RNAi während der Verpuppung eines initiierenden. gambiae. Wir beobachten , dass Verpuppung Injektion eines RNAi - Trigger Beobachtung der resultierenden Phänotypen in einem frühen Stadium Erwachsenen ermöglicht, das heißt, früher nach dem Auflaufen als würde beobachtet werden , wenn Gen - Knockdown im Nachauflauf bei Erwachsenen initiiert wurden. Dieses Verfahren ermöglicht Knock-Down während der pupal Entwicklungsintervall beginnt und sich in adulten Stadien, so dass Knock-Down während pupal Entwicklung initiiert können im frühen Erwachsenen Hämolymphe zugänglichen Zelltypen bestehen und beeinflussen, sowie Zelltypen, die mehr Hämolymphe zugänglich während der Metamorphose als bei Erwachsenen, wie sensorischen Neuronen bei erwachsenen Anhängsel folgende Entstehung gefunden.

Protokoll

1. Synthese und Herstellung dsRNA

1. Identifizieren Sie einen 200-800 bp Region Knockdown (um die entsprechenden dsRNA erzeugen) innerhalb des Gens von Interesse , die vorhergesagt wird , keine erkennbaren Nebeneffekte haben (zB keine Sequenzhomologie ≥18 bp innerhalb eines anderen Gens) und eine negative Kontrolle (zB eine heterologe Sequenz, die nicht vorhanden innerhalb der Zielinsekten Genom, wie beispielsweise die Escherichia coli lacZ - Gen (GenBank Gene ID: 945.006) ist. Alternativ dazu verwenden , um eine positive Kontrolle (beispielsweise , die einen leicht beobachtet Phänotyp wie SRPN2 ^21,22 ergibt _, Gene GenBank ID. 1270169) die Sequenz der dsRNA Targeting SRPN2 wird in Michel et al definiert (2005) ^21..
   Hinweis: E-RNAi ist ein Open-Source bioinformatischen Ressource , die für die Identifizierung solcher Regionen und für den Prozess des Entwerfens Oligonukleotidprimer ²³ nützlich ist.
2. Führen Sie standard PCR - Amplifikation (dh durchgeführt mit Taq DNA - Polymerase unter Verwendung von 30-35 Zyklen) eine genomische DNA oder cDNA - Matrize unter Verwendung von dsRNA Synthesemuster durch eine T7 - Promotorsequenz (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') und weiter mit dsRNA Zubereitung flankiert zu erhalten , und unter Verwendung eines kommerziellen in - vitro - Transkription - Kit nach den Anweisungen des Herstellers reinigen-up. Verwendung SRPN2 PCR Amplifikationsbedingungen und Primer Information wie in An et al. (2011) ^22.
3. Quantifizierung gereinigter RNA Amplikon Ausbeuten durch ultraviolette Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 260 nm und passen auf die gewünschte Konzentration (beispielsweise 3 & mgr; g / & mgr; l) in RNase-freiem Wasser.
   1. Für niedrige RNA-Konzentrationen zur Fehlerbehebung reduzieren Flüssigkeitsvolumen von Proben, die in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur oder durch Lyophilisieren Proben und Rekonstitution in kleineren Mengen von Wasser dreht. Die Zeit für die Proben Lyophilisierung erforderlich variiert in Abhängigkeitbei der ersten Probenvolumina und dsRNA-Konzentrationen.
4. Überprüfen der Qualität und der Länge der dsRNA auf einem 2% Agarosegel, hergestellt mit 1x TBE oder TAE-Puffer und gefärbt mit Ethidiumbromid (EtBr), zusammen mit der Matrizen-DNA für die Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die dsRNA wird wandern langsamer als Template-DNA. Qualität und Länge kann durch Sicherstellen, gibt es keine nicht-spezifischen dsRNA Produkte und durch den Vergleich Produkte mit einem Standard-DNA-Marker bzw. bewertet werden.
   Hinweis: EtBr ein potenter mutagen und sollte entsprechend behandelt werden.
   Anmerkung: Bei einer dsRNA Konzentration von 3 ug / ul, 0,5 ul der Probe mehr als ausreichend ist für die Visualisierung auf der EtBr-gefärbten Agarosegel.
5. Speichern von dsRNA bei -20 ° C bis benötigt. Mehrere Frost / Tau-Zyklen kann dies zum Abbau verursachen, so dass Teilmengen sollten für große Mengen von dsRNA hergestellt werden.

2. Bereiten Sie Fast Green FCF Dye (FGD) Schläuche

1. Verdünnen Fast Green FCF Farbstoffvon Stammlösung (≥85% Farbstoffgehalt) auf 0,1% (v / v) (Arbeitslösung) in RNase-freiem Wasser.
2. Pipette 1 ul Farbstoff in den Boden eines 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Die Röhrchen in einem 65 ° C Heizblock für ca. 3 Stunden zu verdampfen Flüssigkeit, dann die Röhrchen bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten abkühlen, bevor Sie. Dieser trockene feste Farbstoff wird in dsRNA Resuspensionslösung wiederherzustellen.

3. Ziehen Injektionsnadeln

1. Ziehen Borosilicatglas Nadeln einen beheizten Nadel Abzieher zu einem Spitzendurchmesser von 10 bis 30 & mgr; m verwendet. Ziehen Sie Einstellungen entsprechen: Abgleich der Heizung nicht. 1 = 100, Abgleich der Heizung nicht. 2 = 70.
2. Um eine Beschädigung der feinen Spitze der Nadel, wenn sich alle gezogen Nadeln horizontal in einer Petrischale auf einem Streifen von Form Kitt vermeiden.
   Hinweis: Weitere Informationen zur Kapillarnadel Methoden ziehen können in weiteren Einzelheiten in der Malaria-Forschung und Referenz-Reagenz Resource Center M findenR4 Handbuch ^24.

4. Bereiten Sie Injection-Station

1. Sammeln Sie Materialien benötigt: Glas Mikrokapillare Nadeln feine Spitze gezogen, Mikroinjektors, dünnes Filterpapier und dickes Filterpapier, Petrischalen, Transferpipetten, Pinsel und sezieren Lichtmikroskop.
2. Bereiten Sie die Mikroinjektors wie in der Anleitung beschrieben Mikroinjektors und setzen Injektionsvolumen auf das gewünschte Volumen pro Impuls (zB maximal 69 nl pro Puls).
3. Auf einer Plattform , die unter dem Mikroskop zu manövrieren ist einfach (zB flache Seite eines Styropor Röhrchenrack), stapeln die beiden Filterpapierblätter mit dem dünnen Filterpapier auf, und befestigen Sie ihn mit Klebeband an den Rändern.
4. Resuspendieren 10 ul jeder dsRNA-Lösung in getrennten farbigen Farbstoff Rohre, und auf Eis.

5. Sammeln Pupae zur Injektion

1. Füllen Sie eine kleine 60 mm x 15 mm Petrischale mit 10 ml VE-Wasser und sammeln ~ 50 bleich Puppen (during der ersten 24 Stunden nach der Verpuppung) von einem Insektarium Schale eine Einweg-Plastiktransferpipette.
2. Entfernen Sie alle Puppen, die mittel- bis dunkel Kutikula Bräunung haben.
   Hinweis: Sobald die Nagelhaut zu bräunen beginnt, wird es schwieriger, die Kutikula und Injektion führt zu viel höheren Letalität zu durchdringen.

6. dsRNA Injection

1. Unter dem Binokular, brechen die distale Spitze der Injektionsnadel mit einem Paar von feinen Pinzette ab.
2. Bereiten Sie die Injektionsnadel durch die Nadel mit Mineralöl Verfüllung (eine Spritze mit einem 3-Zoll, 30-Gauge-Nadel) und überschüssiges Öl mit dem Austreiben Mikroinjektor.
3. Vordere Injektionsnadel mit einer maximalen Menge an dsRNA, füllen und ein Impuls unter dem Mikroskop auswerfen die Abgabe von Flüssigkeit zu gewährleisten. Für den Fall, dass keine Flüssigkeit aufgenommen und / oder vertrieben, überprüfen Sie die distale Spitze der Nadel für jede Verstopfung und sicherzustellen, dass die Nadel fest in der microinjecto gesichert istr.
4. Wählen Sie 1-3 pupae, und legen Sie sie auf das Filterpapier.
5. Mit dem Pinsel, positionieren Sie den Puppen auf dem Filterpapier mit dorsalen Kutikula zugänglich, und verwenden Sie den Pinsel auf Filterpapier zu schieben und von überschüssigem Wasser zu absorbieren.
6. Stabilisieren Sie die Puppe mit der Spitze des Pinsels, und legen Sie die Nadel in die dorsale Häutchen zwischen dem Thorax und Abdomen in einem Winkel von etwa 30 ° in Bezug auf die dorsale Oberfläche der Puppe. Die Injektion sollte gegen die hintere Ende der Puppe und der Nadel gerichtet werden sollte, in einer anterioren-to-posterior-Richtung bewegt werden.
7. Injizieren zwei Impulse (69 nl pro Impuls) von 3 ug / ul dsRNA-Lösung in die Hämolymphe, und prüfen, ob die Verteilung der Farbe im ganzen Körper. Wenn keine Farbe erkannt wird, verschieben sich die Injektionsnadel Position leicht die Spitze von Verstopfung zu beseitigen und Flüssigkeitsabgabe wiederholen.
8. Verwenden Sie den benetzten Pinsel vorsichtig Puppe aus der Nadel in das Wasser für die Kultivierung zu bewegen. Ter Pupa zum Pinsel auf leichten Kontakt bleiben sollte.

7. Post-Injektionsbedingungen

1. Legen Sie Petrischale mit injizierten Puppen in einem Moskitokäfig mit geeigneten Luftstrom (zB Mesh - Käfig oder Behälter mit Mesh - Deckel). Pupal Aufzuchtbedingungen sollten konsequent bei 27 ± 3 ° C Temperatur, 75 ± 5% Luftfeuchtigkeit bleiben und sein unter einem Licht: Dunkel-Zyklus von 16: 8 Stunden.
2. Bereiten Sie eine 10% (w / v) Glucoselösung, und legen Sie eine Lösung gesättigten Wattebausch auf dem Moskitokäfig für Erwachsene Fütterung Netz.

8. Beurteilen Sturz

1. In gewünschten Zeitpunkt (e), zu bewerten Phänotypen in experimentellen dsRNA injiziert Insekten, im Vergleich zu Kontrollen.
   1. Beurteilen dsSRPN2 und dsLacZ Insekten täglich von Erwachsenen Kühlen hinunter für ca. 2-3 min bei -20 ° C, um sie zu einer kalten Platte zu übertragen , auf 2 ° C und Identifizieren jedes pseudo-Tumorbildung durch Verwendung eines Präpariermikroskops bei 15XVergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung. Nach Einschätzung Rückkehr Erwachsene Insektarium Bedingungen (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% Luftfeuchtigkeit).
      Hinweis: Die Versuchs- und Kontroll dsRNAs in diesem Protokoll verwendet werden , sind dsSRPN2 und dsLacZ sind. Es gibt viele Möglichkeiten für Kontrollen; Es wird jedoch vorgeschlagen , dass eine positive Kontrolle für die Phänotyp und / oder Expression leicht sichtbar gemacht wird (zB durch Sezieren Mikroskopie) und / oder quantifiziert [zB quantitative real-time PCR (qRT-PCR), Western Blot] verwendet werden soll wenn diese Technik zu erlernen. SRPN2 Protein und Transkript Quantifizierung über Western - Blot und qRT-PCR sind jeweils in Michel et al. (2005) ^21.

Ergebnisse

Pupal Injektion für die Gen - KD Ausbeuten optimale Ergebnisse , wenn die Einspritzung während der frühen Verpuppung durchgeführt wird, wenn Kutikula Bräunungsspiegel niedrig sind (Abbildung 1A, links, und 1B). Erhöhte Gerben und Verhärtung der Kutikula, in der Regel nach 24 Stunden, führt zu einer erhöhten pupal Tod nach der Injektion (Abbildung 1A, in der Mitte und rechts). Die Rate der pupal Entwicklung kann auf Insektarium Bedingungen und der Tierdichte variieren je ^24,25; Daher ist es am besten Pigmentierung visuell zu beurteilen.

Während des Einspritzvorgangs wird der Kapillarnadel in die dorsale Cuticula etwa 30 ° in der anterior posterior - Richtung (2A) in einem Winkel von eingefügt. Sobald die Nadel eingeführt wird und die dsRNA + 0,01% (w / v) FGD verzichtet wird, ist die Verteilung der Farbstoff evident ganzen Hämolymphe (Figure 2B).

Beurteilung der erwachsenen Auflaufen für pupae mit 0,01% injiziert (w / v) FGD einer durchschnittlichen Rate von 70% ergab Auflaufen, im Vergleich zu 96,7% Entstehung von nicht-injizierten Kontrollen (3A). Zu beachten ist , teilweise Austritt aus der Puppenhülle wurde für eine große Anzahl von nicht-überlebenden Stechmücken (3B) beobachtet. Injizierten Tiere keine Verzögerungen bei der Entstehung Zeit aufweisen (Abbildung 4A) oder voreingenommen Auswirkungen auf beide Geschlechter (4B). Zusätzliche Beurteilung der Erwachsenen Überleben bis zum Tag 10 durchgeführt , nach dem Auswuchs zeigt keine offensichtliche Auswirkung auf Nachauflauf erwachsenen Überleben (4C).

Validierung von KD Qualität wurde durch die melanotic Pseudotumor (dunkel pigmentierten Gewebe cluster) Phänotyp mit SRPN2 Knockdown ^21,22 als positive Kontrolle für Zuschlags und die zugehörige beurteilt Fehlen mit dsLacZ Injektion als Negativkontrolle assoziiert Phänotypen. Erwachsene Mücken, die entstanden wurden am Tag 8 nach der Injektion (Tag 6-7 Nachauflauf) erzielt. Melanotischen pseudo-Tumoren (5A und 5B) wurden durch die Kutikula von 93,5% der dsSRPN2 vs. beobachtet 0% der dsLacZ erwachsenen Mücken (6A). Cluster von dunkel melanisierten Gewebe wurden auf Präparation von Pigmentflecken (5C) identifiziert. Pseudo-Tumoren auf den Erwachsenen - Kutikula so früh wie Tag 3 nach dem Auswuchs und waren auch in einer Untergruppe von dsSRPN2 Hämolymphe und Darmgewebe sichtbar waren (Daten nicht gezeigt). Bei 5 Nacheinspritzung (frühen Erwachsenenstadium) verringerte sich deutlich SRPN2 Ebenen in dsSRPN2, aber nicht dsLacZ oder nicht injizierten Hämolymphe Protein Isolate beobachtet (6B).

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Abbildung 1: Entwicklungs Inszenierung für pupal dsRNA Injektion Frühe pupal Injektion von dsRNA führt zu optimalen Überleben und die Progression in das Erwachsenenstadium.. Niedrige Konzentrationen von Kutikula Pigmentierung (A, links und B) innerhalb der ersten 0-24 hr folgenden Verpuppung beobachtet werden. Bräunung der pupal Kutikula vorhergehenden Einspritzung (A, Mitte und rechts) ergibt mäßige bis schlechte Überleben.

Fig . 2: Injektionsposition und Verteilung von farbstoffmarkierten dsRNA (A) Kapillarnadel Injektion von farbstoffmarkierten dsRNA in die dorsale Cuticula in einem Winkel von etwa 30 °, in Richtung von vorne nach hinten. (B) Der Farbstoff sichtbar ist in der pupal Hämolymphe verteilt. dsRNA Injektionsvolumen von 138 nl, mit 0,01% markiertem FGD (w / v).

Fig . 3: Post-Injektions erwachsenen Auflaufen (A) 70% pupae mit 0,01% FGD injiziert (w / v) erfolgreich heraus (n = 60), verglichen mit 96,7% nicht-injizierte Kontrollen (n = 60). Drei biologischen Replikate wurden durchgeführt. (B) Partielle Austritt aus dem pupal Fall wurde für eine große Anzahl von nicht-überlebenden Moskitos beobachtet. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM).

Abbildung 4: Notrate, sex Bewertung und Erwachsenen Überleben (A) Vergleichbare Auflaufen Zeiten wurden folgende pupal Injektion mit 0,01% FGD beobachtet (24 hr = 80% und 48 hr = 20%), im Vergleich zu nicht-injizierten pupae (24. hr = 83% und 48 h = 17%). (B ) Ungefähr gleich männlichen und weiblichen Erwachsenen Entstehung wurde für 0,01% REA injiziert pupae (weiblich = 48% und männlich = 52%) und nicht injizierten pupae (weiblich = 52% und männlich = 48%) beobachtet. (C) Überlebensanalyse zeigt , dass die Injektion mit 0,01% REA nicht erwachsenen Überleben auswirkt, bewertet bis zum Tag 10 nach dem Auswuchs. Die Ergebnisse stellen Daten aus drei unabhängigen Experimenten mit 0,01% FGD injiziert (n = 60) und nicht-injizierten (n = 60) pupae (gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM).

Abbildung 5: Pseudo-Tumor - positive Kontroll Phänotyp spiegelt erfolgreiche Knockdown Pseudo-Tumoren beobachtet wurden auf der (A) Bauch- und (B) thorakalen Kutikula dsSRPN2 -injected, aber nicht dsLacZ -injected adult Stechmücken am Tag 8 nach der Injektion..(C) Eine stärkere Vergrößerung (400X) Bildgebung (a) der Kutikula und Präparation von Pigmentflecken (b) zeigt Cluster von dunkel melanisiert Zellen.

Abbildung 6: Quantifizierung von pseudo-Tumorbildung und verminderte SRPN2 Proteinspiegel (A) Verpuppung Injektionen resultieren in pseudo-Tumorbildung in 93,5% der dsSRPN2 Erwachsenen (n = 21) im Vergleich zu 0% von dsLacZ Kontrollen (n = 19). . Ergebnisse Tag 8 nach der Injektion erhalten. (B) Western - Blot (links) zeigt verringerte SRPN2 Ebenen in dsSRPN2, aber nicht dsLacZ oder nicht injizierten Hämolymphe Protein Isolate (Tag 5 nach der Injektion). Die Ergebnisse basieren auf drei unabhängigen Experimenten. Anti-SRPN2 ²¹ und anti-SRPN3 ²⁶ Antikörperverdünnungen verwendet wurden , waren 1: 1.000 und 1: 2.000, respectively. Ziege anti-ra5000: BBIT IgG-HRP (Produkt sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) wurde bei 1 verwendet. Alle Proteinspiegel wurden (rechts) durch Bandenintensität (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalisiert auf SRPN3 quantifiziert und statistisch verglichen mit ungepaarten t - Test. P <0,05 *, P ≥0.05: ns (nicht signifikant). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM).

Diskussion

Aktuelle Methoden zur beinhalten in Stechmücken nicht-transgenen RNAi induzieren direkte Injektion von dsRNA in die Erwachsenen Hämocoel ^12,13 oder Larvenfraß von RNAi - Trigger-beschichtete Nanopartikel ^14-17 oder Mikroalge-basierte dsRNA - Moleküle ^18. Targeting adulten Stechmücke, während extrem wertvoll, kann eine große Anzahl von Genen ausschließen, die während der früheren Entwicklungsperioden funktionieren. Preissturz durch Larvenfraß ausgelöst inkonsistent Phänotypen während der erwachsenen Stadium ergeben darauf zurückzuführen, zum Teil auf das Potential der variablen Protein Persistenz durch die Verpuppung. Daher Einführung eines zusätzlichen Verfahren, das ein Mittel liefert speziell an Initiieren RNAi während pupal Entwicklung ausgerichtet ist, um mehr vollständig Genfunktionen während der Pre-adult Entwicklungsstadien sowie verbesserte Fähigkeiten zur Bewertung der Genfunktion während adulte Stadien beurteilt. Wie bei Knock-Down-Ansatz basiert auf dsRNA Injektion oder Ausdruck, der Persistenz der Knock-Downkann nicht vorhergesagt werden. Daher Transkript oder Protein-Ebene für Gen von Interesse während der Entwicklungszeiten von Interesse bewertet werden sollten. Obwohl wir eine Fortsetzung beobachten von Proteinspiegel am Tag 5 nach der Injektion für SRPN2 in SRPN2 dsRNA-injizierten Tieren vermindert, Faktoren wie Proteinumsatz und Halbwertszeit kann für verschiedene Ziele unterscheiden. Es ist entscheidend, aber auch, um sicherzustellen, dass die dsRNA zur Injektion verwendet werden gut konzentriert ist, und erscheint auf einem Agarosegel intakt. Wir empfehlen Experimentatoren diese Faktoren neu bewerten, wenn Zuschlags Ergebnisse nicht ausreichend sind, und die jeweiligen Konzentrationen von dsRNA müssen empirisch für spezifische Gen-Targets getestet werden.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Initiierung der RNA - Interferenz während der Verpuppung von An. gambiae Entwicklung. Dieses Verfahren beruht auf der Einführung über Mikroinjektion von dsRNA direkt in die Hämocoel der frühen Puppen und ermöglicht die Beurteilung von Injektionsqualität durch dieVerwendung von Farbstoff-markierten dsRNA. Die Fähigkeit Injektionsqualität zu visualisieren stellt eine entscheidende Verbesserung für die Gewährleistung erfolgreichen Zuschlags und stellt einen Aspekt der Injektion basierende Knock-Down, der nicht in den meisten bisher berichteten dsRNA-basierte Protokolle Fokussierung auf das Erwachsenenstadium berücksichtigt hat. Durch die Ausrichtung der Puppe zu Beginn dieser Entwicklungszeit, Gene, die eine Rolle in dieser kritischen Entwicklungsintervall spielen könnte, oder während der frühen Stadien des Erwachsenenalters können funktionell ausgewertet werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren dsRNA Lieferung an Zellen ermöglichen, und Etablierung von RNA-Interferenz in Zellen, die während der Metamorphose zugänglich sind, aber weniger zugänglich in voll ausgebildeten erwachsenen Mücken.

Eine kürzlich Microarray - Analyse von Harker et al. (2012) identifiziert 560 ein. gambiae - Transkripte , die während verschiedene Entwicklungsstadien von mindestens 4-fach hochreguliert oder herunterreguliert wurden, angefangen vom Embryo zum Erwachsenen. Von den 560 Transkripte identifiziert, ein Satz von 309 wurde hochreguliert während pupal Entwicklung ^27. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es viele Anforderungen für die differentielle Genexpression gesamten Moskito Entwicklung, einschließlich derer, die im Puppenstadium eintreten, ein Intervall, in dem der Organismus Metamorphose unterzogen wird. In vielen Insektenarten, darunter ein. gambiae, in den Prozessen beteiligten Gene wie Entwicklung (dh pupal kutikulären und Chitin-bindende Proteine) ^27-31 und Immunantwort (dh Toll - Rezeptor-ähnliche Proteine) ^27,32-34 werden während der Verpuppung stark exprimiert. Sobald ein voll ausgebildet Erwachsenen entstanden ist, wird es die Genexpression in Reaktion fortgesetzt ökologischen und physiologischen ³⁵ ändert. Bemerkenswert ist , während der frühen Entwicklung im Erwachsenenalter gibt es eine Erhöhung der Expression von Entwicklungsgenen (dh erwachsene kutikulären und sarcoplasmic Proteine) ^36, sowie andere Schlüsselgene (dh , Sperma spezifisches Protein und Cytochrom - P450 - Stoffwechsel - Enzyme) ^27,36.

Die positive Kontrolle bei der Entwicklung dieses Protokolls SRPN2, ist ein An. gambiae Serin - Protease - Inhibitor (Serpin). SRPN2 spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulierung des Insekten Melanisierung, ein breites Spektrum angeborene Immunantwort in Insekten ^21,22. Preissturz von SRPN2 bei erwachsenen Mücken Ergebnisse in pseudo-Tumorbildung ^21,22, einem Phänotyp , die leicht durch die Verwendung von Lichtmikroskopie beobachtet wird. Da dieser deutlichen Phänotyp kann leicht in lebenden Insekten erzielt werden, haben wir SRPN2 für die anfängliche Verpuppung RNAi - Injektionen. Zusätzlich wird SRPN2 während aller Entwicklungsstadien ³⁷ ausgedrückt, wodurch ein gutes Ziel für die Verpuppung RNAi Injektion und Beurteilung der Funktion im frühen Erwachsenenbereitstellt. Wir zeigen, dass die Methode, die wir entwickelt haben, ist in der Lage zu induzieren ähnlich Erwachsenen melanotischen pseud o-Tumorbildung als Folge der dsRNA Einspritzungen während der Verpuppung der Entwicklung durchgeführt. In diesem Protokoll zu entwickeln, haben wir , dass die Injektion während der frühen Entwicklung pupal beobachtet (dh die ersten 24 Stunden nach der Larven-pupal molt) für den Erhalt der optimalen Erwachsenen Entstehung entscheidend ist. Für den Fall, dass eine schlechte Auflaufen Nacheinspritzung erreicht wird, empfehlen wir Staging-Larven mit größerer Genauigkeit, Puppen mit weniger umfangreichen Cuticula Härtung zu erhalten und frühen Puppenstadium Injektions gewährleisten erreicht. Darüber hinaus kann in einem optimalen Notraten und zunehmender Vergrößerung während der Injektion eine Beschädigung der Kutikula Ergebnisse zu minimieren helfen sicherzustellen, dass nur der vorgesehene Bereich des Tieres durchstochen wird. Wenn die Nadel in die ventrale Kutikula Punktion durch sollte Pooling von farbstoffmarkierten Flüssigkeit auf der Außenseite der Puppe offensichtlich sein, oder das Filterpapier zu sättigen. Es wird dringend jede pupae wegzuwerfen empfohlen, die mehr als eine Kutikula Einstich aufweisen.

jove_content "> Mit den umfangreichen Erfahrungen von vielen Labors mit der Leistung der Erwachsenen Moskito Injektionen können zuvor identifizierten Mikroinjektions Ansätze mit einfachen Protokoll Änderungen in pupal RNAi-Experimente Einsatz angepasst werden. Insgesamt ist das Ziel dieser Methode ist es, Forscher, um die Fähigkeit zu erweitern Sie den Zeitrahmen , in denen genetische Analysen umkehren durchgeführt werden, weiter ermöglichen , Forschung, die Entwicklung neuer Kontrollstrategien unterstützen wird. Interessant ist , dass Experimente in anderen Arten, wie Rhodnius prolixus und Spodoptera frugiperda, zeigen , dass die Gen - Silencing - Effekte sind in der Regel viel zu sein größer , wenn während der Pre-adulte Stadien ^38,39. während aller Phasen der Entwicklung RNAi-vermittelten Knock-Down unterliegt Überlegungen in Bezug auf die Schnelligkeit und Ausdauer von Gen - Silencing, und die Stabilität der kodierten Proteine ​​durch gezielte Gene. die ideale RNAi - Ziel initiiert Gene sind in der Regel diejenigen, die kodieren für ein protei seinn oder RNA , die hat eine kurze Halbwertszeit und eine hohe Fluktuationsrate ^11,40.

Während transgene RNAi Strategien auch Überlegungen zur Adresse verwendet werden kann , in Bezug auf Schnelligkeit und Persistenz von RNAi bei pre-adulte Stadien weisen transgene Techniken viele Nachteile (beispielsweise Zeit für die Erzeugung von transgenen Linien erforderlich, experimental Zeitrahmen für Moskito Paarungen Insekten zu erzeugen mit geregeltem dsRNA-Expression und Wartung von transgenen Aktien). Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine einfachere und schnellere Methode für die Einleitung Knock-Down während pupal Entwicklung und in Zelltypen, die während der Metamorphose zugänglich und sind aber weniger zugänglich sind bei Erwachsenen. Die Verwendung von Farbstoff-markierten dsRNA Suspensionen ermöglicht eine einfache Beurteilung der Injektion Erfolg und die Verbreitung von eingeführten Materials innerhalb pupae. Unsere Daten auf den Beginn der Tumorbildung in pupal injizierten Erwachsene, wie Erwachsene zu injizierenden Tieren verglichen, steht im Einklang mit initiation von RNAi-vermittelten Knockdown während der Verpuppung. Mit unserem G3 Moskito-Linie und unter unseren Insektarium Bedingungen haben wir die Erwachsenen melanotischen Pseudotumorbildung so früh wie 10 Tage nach der Injektion von Erwachsenen im Nachauflauf injiziert drei bis fünf Tagen zu beobachten. Zu Beginn des Jahres pupal stufigen Einspritzung durchgeführt wird , beobachten wir sichtbar melanotischen Pseudotumorbildung bereits fünf Tage nach der Injektion (dh drei bis vier Tage nach der Entstehung). Diese Daten implizieren , dass diese Methode ermöglicht die Einleitung von Knock-Down während einer bisher untersuchten Entwicklungszeit (dh pupal Entwicklung). Unsere Farbstoffmarkierungsverfahren kann auch als nützlich erweisen, für die Entwicklung neuer larvalen Injektionsprotokolle, aufgrund der durchscheinenden Natur der Kutikula bei allen Larvenstadien. Während die Steuerung in dieser Studie verwendet Progression in erwachsenen Stadium erfordert einen Zuschlags Phänotyp anzuzeigen, um zukünftige Experimente Verpuppung spezifischen Phänotypen Beurteilung nach der Injektion von frühen pupae liefertwertvolle Einblicke, die Erweiterung dieser Methode in zusätzliche Entwicklungszeiten wie spät pupal Entwicklung. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren einen wertvollen RNAi-Protokoll für Verpuppung Initiierung von RNAi-vermittelten Knock-Down und erweitert die funktionelle Genom Werkzeuge zur Verfügung, für die Verwendung innerhalb des Vektors Insektenforschungsgemeinschaft.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MEGAscript RNAi-Kit	Ambion	AM1626
Nanoject II Injektor	Drummond	3-000-204
Nanoject II Fußschalter	Drummond	3-000-026
Kapillaren aus Borosilikatglas	Drummond	3-000-203-G/X
Glas-Mikropipettenabzieher	Narishigne	PB-7
Fast Green FCF Farbstoff	Sigma	F7258	Kann durch einen ungiftigen Lebensmittelfarbstoff ersetzt werden.
Transferpipetten aus Kunststoff	Thermo Scientific	1371150	¼ Zoll von der Spitze geschnitten, um eine breitere Öffnung zu schaffen.
Whatman " dünn" Filterpapier	GE Healthcare	1001-090	Dies ist ein Durchmesser von 9 cm Grad 1, kann aber je nach Größe des Injektionskissens geändert werden.
Westlicher Blot " dick" Filterpapier	BioRad	107-3931	Dies ist das Filterpapier, das im Allgemeinen für Western-Blots verwendet wird.
Petrischalen (60 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Pinsel (Größe 0)	Michael' s Art	10474940	Pinselgröße und -marke können je nach Verfügbarkeit und Benutzerpräferenz variieren.
Lichtmikroskop zum Präparieren	----	-----	Dies kann je nach Verfügbarkeit und Benutzerpräferenz variieren.