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Methodenartikel

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

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⸱

DOI:

10.3791/53741

⸱

3. Februar 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Metastasierung ist eine Hauptursache für krebsbedingten Morbidität und Mortalität. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess und aufgrund seiner Komplexität, die genauen zellulären und molekularen Prozesse, die metastatische Verbreitung und Wachstum sind immer noch schwer zu regieren. Echtzeit-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der dynamischen und räumlichen Wechselwirkungen von Zellen und ihrer Mikroumgebung. Soliden Tumoren metastasieren häufig in die Lunge. Jedoch stellt die anatomische Lage der Lungen eine Herausforderung für die intravital Bildgebung. Dieses Protokoll stellt eine relativ einfache und schnelle Methode zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung Stroma in Lungenmetastasen. Mit dieser Methode kann die Motilität von Krebszellen als auch Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Stromazellen in ihrer Mikroumgebung für mehrere Stunden in Echtzeit visualisiert werden. transgenen fluoreszierenden Reporter-Mäuse Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Zelllinie, injizierbare fluoreszenzmarkiertenMoleküle und / oder Antikörper, mehrere Komponenten der Lunge Mikroumgebung visualisiert, wie Blutgefäße und Immunzellen werden. Um das Bild zu den verschiedenen Zelltypen, eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop, das langfristige kontinuierliche Bildgebung mit schnellen, vierfarbige Bildaufnahme ermöglicht verwendet wurde. Zeitraffer-Filme aus Bildern zusammengestellt mehrere Positionen und Brennebenen gesammelt über zeigen Wechselwirkungen zwischen Live-metastatischen und Immunzellen für mindestens 4 Stunden. Diese Technik kann weiter zu testen Chemotherapie oder gezielte Therapie verwendet werden. Darüber hinaus könnte dieses Verfahren für die Untersuchung von anderen Lungenbezogenen Pathologien angepasst werden, dass die Lunge Mikroumgebung beeinflussen.

Einleitung

Der tödlichste Aspekt von Krebs ist die Metastasierung, die mehr als 90% der krebsbedingten Morbidität und Mortalität ausmacht1. Die Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, und aufgrund ihrer Komplexität sind die genauen zellulären und molekularen Mechanismen, die die Ausbreitung und das Wachstum von Metastasen steuern, noch schwer fassbar. Um Metastasen zu bilden, müssen sich Tumorzellen im Primärtumor von ihren Nachbarzellen und der Basalmembran lösen, die extrazelluläre Matrix durchqueren, intravasieren, über Blut- oder Lymphgefäße wandern, an der sekundären Stelle extravasieren und schließlich überleben und Sekundärtumoren etablieren. Neben den Eigenschaften der Tumorzellen ist der Beitrag der Mikroumgebung, die das benachbarte Stroma zusammen mit den normalen Gegenstücken der Krebszellen umfasst, entscheidend für die Aussaat und Etablierung von metastasierenden Läsionen2.

Traditionelle Methoden zur Untersuchung von metastasierender Aussaat und Wachstum untersuchen statische Zustände, während Gewebe für die Histologie herausgeschnitten und geschnitten werden. Diese Daten erzeugen nur eine Momentaufnahme dieses hochdynamischen Prozesses. Obwohl aus diesen Studien einige nützliche Informationen gewonnen werden können, kann der komplizierte Prozess, durch den Tumor- und Stromazellen während der Metastasierungsbildung interagieren, mit diesen Methoden nicht angemessen bewertet werden. Darüber hinaus ist es nicht möglich, Einblicke in die Migrationsmuster von Tumor- oder Stromazellen zu gewinnen, die für die Etablierung einer Kolonie an der entfernten Stelle wichtig sind. Um den Metastasierungsprozess effektiv untersuchen zu können, ist es unerlässlich, verschiedene Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung kontinuierlich und in Echtzeit sichtbar zu machen.

Die Lunge ist eine häufige Stelle für Metastasen von soliden Tumoren wie Brust-, Darm-, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom und Sarkom3. Die intravitale Bildgebung wurde zuvor zur Untersuchung der Zell-Zell-Interaktion in verschiedenen Primärtumor- und Metastasenmodellen eingesetzt4,5. Methoden der Lungenbildgebung bei Mäusen, einschließlich intravitaler Bildgebung, Lungenschnittbildgebung und eines ex vivo Lungenmetastasenassays, wurden veröffentlicht6–9. Bei der intravitalen Bildgebung der Lunge von Mäusen wird ein thorakales Saugfenster verwendet, um die Lunge zu stabilisieren6. Diese Methode wird für die Zeitraffer-Bildgebung der Lungenmikrozirkulation und der Alveolarräume verwendet. Die anatomische Lage der Lunge stellt eine Herausforderung für die intravitale Bildgebung dar. Um Zugang zur Lunge zu erhalten, muss die Brusthöhle geöffnet werden, was zu einem Verlust des Unterdrucks und einem Kollaps der Lunge führt. Diese Methode erlaubt nur die Visualisierung eines kleinen Teils der Lunge und ist technisch anspruchsvoll; Eine unnötige Komplikation in Studien, die Prozesse untersuchen, die unabhängig vom Blutfluss sind. Darüber hinaus erfordert diese Methode auch ein Aushebeln der Bewegung, die durch die Atmung verursacht wird. Dies geschieht entweder durch das Sammeln von Bildern zwischen den Atemzügen oder während der Analyse nach der Bildaufnahme10. Die alternative ex vivo Lungenschnittbildgebung sorgt für Stabilität und Tiefe und bereitet auch das Lungenparenchym für die Immunfärbungvor 7. Der langwierige Schnittprozess führt jedoch zu einer großen Verzögerung zwischen dem Zeitpunkt der Tiertötung und dem Beginn der Bildgebung. Darüber hinaus verursacht der Prozess des Durchtrennens einer Mauslunge einen beträchtlichen Zelltod8, wodurch die Qualität und Quantität der Bildgebungsproben beeinträchtigt und möglicherweise die Tumor-Stroma-Wechselwirkungen unnötig verändert werden. Um eine technische Brücke zwischen den Methoden der intravitalen Bildgebung und der Lungenschnittbildgebung zu schlagen und gleichzeitig die Vorteile beider Techniken zu nutzen, wurde eine relativ schnelle und einfache Methode zur ex vivo Lungenbildgebung entwickelt. Diese Methode wurde durch die Bildgebung von nicht geschnittenen ganzen Lungenlappen erreicht. Mit dieser Methode können die Beweglichkeit von Krebszellen sowie Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Stromazellen in ihrer Mikroumgebung über mehrere Stunden in Echtzeit sichtbar gemacht werden.

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Protokoll

Alle beschriebenen Verfahren muss mit Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung durch die lokalen Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) entsprechend durchgeführt werden.

1. Erzeugung von Lungenmetastasen für Ex-Live-Imaging (Transgene oder Schwanzveneninjektion) vivo

HINWEIS: Lungenmetastasen kann durch Verwendung gentechnisch veränderter Mausmodelle oder durch intravenöse (iv) Injektion von Krebszellen erzeugt werden.

  1. Generieren Lungenmetastasen für die Bildgebung durch eine gentechnisch veränderte Tumormausmodell in einer transgenen Reporter Maus überqueren, zum Beispiel, über die Brustkrebs-Mausmodell, Maus-Mammatumorvirus Long Terminal Repeat-Polyoma-Mitte-T-Antigen (MMTV-PyMT) 11 in ACTB-ECFP Mausmodell 12.
    HINWEIS: Das drückt ACTB-ECFP Modell cyan fluoreszierende Protein (ECFP) unter der β-act verbessertin Promotors, so dass alle Zellen fluoreszieren in dem blauen, CFP-Kanal. Jedoch sind die Krebszellen mit Abstand zu den führenden und als Hauptteil ECFP-positive Zellen unter dem Mikroskop erscheinen. Der MMTV-PyMT Mausmodell entwickelt sich eine progressive Erkrankung, bei der Mammatumorwachstum mit der Verbreitung von Krebszellen an die Peripherie zugeordnet ist, insbesondere an der Lunge. In MMTV-PyMT Mäuse auf dem FVB / n Hintergrund können Mikrometastasen um 10 bis 11 Wochen alt sind zu beachten. Im Allgemeinen werden diese Fortschritte zu Makrometastasen bei etwa 14 Wochen alt 13.
    ODER
  2. Generieren experimentellen Metastasen mit Primärzellen oder syngenen Zelllinien. Verwenden in vitro manipuliert Primärtumorzellen oder Zelllinien (z. B. Transduktion), gefolgt von iv-Injektion 14.
    1. Ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimierenden (+) MMTV-PyMT Zelllinie in fluoreszierenden Reporter-Mäuse (ACTB-ECFP) oder Wildtyp-Mäusen Kurz gesagt, in diesem Protokoll injizieren. Dann,visualisieren diese als VO-PyMT Zellen 15 bezeichnet Zellen, die grün, GFP Kanal.
      HINWEIS: Die ursprüngliche VO-PyMT Zelllinie an der Vanderbilt Orthopädie in Nashville, TN abgeleitet wurde. VO steht für Vanderbilt Orthopädie.
    2. Im Anschluss an die Injektion von 10 6 Zellen (in 200 ul), Krebszelle Extravasation sofort und bis zu ein paar Stunden nach der Injektion beobachtet; beobachten Mikrometastasen zwischen 1-3 Wochen nach der Injektion und erkennen Makrometastasen 3 Wochen nach der Injektion 15.
      HINWEIS: Weniger Zellen injiziert werden, die Zeit von der Injektion bis Metastasenwachstum zu verlängern.

2. Markierung von interessierenden Komponenten in dem metastatischen Mikromilieu (Transgene und / oder Injektionspräparate)

HINWEIS: Labeling kann durch transgenen Mäusen und / oder durch verschiedene Injektionen erreicht werden. Stellen Sie sicher, verschiedenen fluoreszierenden Farben für die Markierung von verschiedenen Zelltypen zu verwenden.

  1. Label-Komponenten des metastatischen Mikroumgebung unter Verwendung von transgenen Mäusen. Überqueren den zuvor genannten Maustumormodell (z. B. MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in ein transgenes Mausmodell, in dem die stromalen Zellen von Interesse durch ein fluoreszierendes Protein markiert sind, die nicht ECFP ist, z. B., c-fms-EGFP 4,16.
    HINWEIS: Zusätzlich zu Visualisierung von Krebszellen in der GFP-Kanal ermöglicht diese Visualisierung von myeloischen Zellen in der GFP-Kanal 4.
    UND / ODER
  2. Beschriften verschiedenen Komponenten des metastatischen Mikroumgebung mit Injektionen in transgene Mäuse oder fluoreszierenden Reporter (nicht fluoreszierenden) Wildtyp-Mäusen.
    HINWEIS: Mehrere Verbindungen können verschiedenen Komponenten des metastatischen Mikroumgebung, beispielsweise ein AF647-konjugierten Gr-1-Antikörper wird verwendet, hier zu beschriften Neutrophilen und Monozyten einige 13 und unterschiedlichem Molekulargewicht Dextrane zu beschriften werden injiziert werden verwendet,Lungenkapillaren zu kennzeichnen. Für die Herstellung dieser injizierbaren siehe Schritt 4.

3. Herstellung von Materialien vor Dissection

  1. 2% Agarose
    1. Wiegen 0,2 g Agarose und in den 10 ml 1 x PBS. Die Lösung wird die Agarose zu lösen. Agarose wird bei RT verfestigen, so halten sie in einem 37 ° C Wasserbad, bis die Inflation eingesetzt.
  2. CO 2 und Temperaturregler
    1. Prüfen ddH 2 O in die Befeuchtungskammer. Füllen Sie, wenn nötig. Legen Konfiguration Platte in Temperaturstufe Plattenhalter (Klimakammer). Schalten Sie den CO 2-Controller und setzen CO 2 bei 5%. Sicherstellen, dass die Luftdurchsatz bei 0,4 Nl / min eingestellt ist.
    2. Öffnen Sie die Luft und CO 2 Ventile. Schalten Sie den Temperaturregler. Sicherstellen, dass die Temperatur der Klimakammer und der Deckel auf 37 ° C eingestellt sind.
    3. Lassen Sie Luftdruck auf die CO 2 Meter. Prüfen CO 2 zu erhöhen, equilibration kann bis zu 30 Minuten dauern.
  3. Spinning Disk Konfokalmikroskop
    HINWEIS: Details des Mikroskops Set-up vorher 4,17 beschrieben wurden.
    1. Schalten Sie den Laser (Argon-Laser für 488 nm Anregung und der Festkörper 405 nm, 561 nm und 640 nm Laser). Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera, den Spinnplattensteuereinheit, die AOTF, die Laser-Steuereinheit und der Kamerasteuerung.
    2. Öffnen Sie das Mikroskop Verschluss, schalten Sie den Computer das Mikroskop ausgeführt und die Software öffnen.
  4. Herstellung der Werkzeuge und Dissektion Plattform.
    1. Schalten Sie das heiße Perle Sterilisator und lassen Sie es 250 ° C erreichen. Saubere zwei Paare von chirurgische Scheren und Pinzetten mit Wasser und Seife. Sterilisieren Sie die Tools für mindestens 30 Sekunden. Lassen Sie die Werkzeuge abzukühlen. Verwenden Sie einen Polystyrol Deckel als Dissektion Plattform. Decken Sie sie mit einem Stück Labor Soaker.

4. Herstellung von Injektionen

HINWEIS: In Abhängigkeit von der Halbwertszeit und die bevorzugte Reaktion, spritzen fluoreszenzmarkierten Antikörpern und / oder fluoreszierende Moleküle entweder unmittelbar vor der Tieropfer oder ein paar Stunden bis Tage vor.

  1. Um das Bild zu Gr1-positive Neutrophile und Monozyten, eine Spritze mit 7 ul Lager AF647-konjugierte Gr-1-Antikörper (1 mg / ml) in 100 ul sterilem PBS unter der Haube vorzubereiten. Legen Sie eine 27 G ½ Nadel auf die Spritze.
  2. Um die Bild Lungenkapillaren, bereiten eine zweite und dritte Spritze mit 100 ul von entweder 70 kD Rhodamin-konjugiertem Dextran (4 mg / ml) oder 10 kD AF647-konjugiertem Dextran (4 mg / ml). Legen Sie eine 27 G ½ Nadel auf den Spritzen.
  3. Spritzen Sie die AF647-konjugierte Antikörperlösung iv 5 Stunden vor der Lunge 'Exzision.
  4. Einspritzen eines oder beider Dextranlösungen iv unmittelbar vor der Lunge 'Exzision.

5. Herstellung von Lungen für Ex-vivo-Live-Imaging

HINWEIS: Versuchen Sie, so steril und vorsichtig wie möglich zu arbeiten, um unnötige Herausforderungen der Immunzellen in der Lunge zu vermeiden.

  1. Spritzen Sie die Maus intraperitoneale (ip) mit einer tödlichen Überdosis eines Narkosemittels durch das Tier Protokoll von IACUC genehmigt erlaubt, z. B. 1 ml 2,5% Avertin. Warten, bis die Maus Atem anzuhalten und vollständig nicht mehr reagiert auf Schmerzreize (Hinterpfote Prise) sein.
    HINWEIS: Genickbruch und Euthanasie Kohlendioxid sollte, wie es nachteilig Lungenzelllebensfähigkeit beeinflussen vermieden werden können.
  2. Immobilisieren die Maus auf einer Dissektion Bord und sterilisieren Sie die Maus mit 70% Ethanol.
  3. Verwenden chirurgische Scheren, zunächst einen quer im Oberbauch Schnitt durch die Haut zu machen, um einen ähnlichen Schnitt durch die Bauchfell gefolgt. Halten Sie die Dissektion Bord in einer vertikalen Position und schneiden Sie den absteigenden Aorta, so dass die Blutbäder nach unten in den Bauch und nicht in der Brusthöhle.
  4. Sersticken eine kleine Öffnung in der Membran Vakuum freizugeben. Schneiden Sie entlang der 10. und 12. Rippe mit der Membran herauszuschneiden und visuellen Zugriff auf die Lunge gelangen.
  5. Verwenden chirurgische Schere, um die Haut zu schneiden bis zur Luftröhre über den Brustkorb, aber lassen Sie den Brustkorb erhalten. Trennen Sie die Haut vor dem Brustkorb. Setzen Sie die Luftröhre durch das umgebende Bindegewebe zu entfernen, man aufpassen, nicht die Luftröhre selbst (1A) zu beschädigen.
  6. Snip eine kleine Öffnung in etwa 1 mm im Durchmesser in dem freigelegten Luftröhre parallel zu den Knorpelringe, so nahe wie möglich dem Kehlkopf (1B). Achten Sie darauf, nicht vollständig durch die Luftröhre zu schneiden.
  7. Nehmen Sie eine 20 G-Nadel und legen Sie die Nadel langsam 4-5 mm in die Luftröhre ohne Gegenkraft (1D). Das Ende der Nadel wird durch die Luftröhre (1C) sichtbar. Verwenden einer Pinzette die Nadel in die Luftröhre zu stabilisieren. Alternativ kann ein Nahtmaterial gebunden around die Luftröhre, die Nadel in Position zu halten.
    HINWEIS: zu tief Einsetzen der carina traumatisiert werden können oder nur eine Seite der Lunge könnte aufgeblasen werden.
  8. Füllen einer Spritze mit 400 ul von 37 ° C 2% niedrig schmelzende Agarose-Temperatur (direkt von einem Bad mit konstanter Temperatur entnommen). Achten Sie darauf, das Sezieren Board steht und vermitteln langsam die warme Agarose durch die Nadel in die Lunge, verwenden Sie ~ 400 & mgr; l in die Lungen aufzublasen.
    Hinweis: Sehen Sie sich die Lunge in den Brustkorb Aufblasen. Nicht über-Aufblasen der Lunge, wie es reißt.
  9. Sobald die Lunge aufgeblasen sind, füllen ~ ⅔ des Brustkorbs, die Spritze zu lösen und die Nadel in der Luftröhre halten zu einem Agarose nicht auslaufen.
  10. Gießen ca. 50 ml 20 ° C PBS in den aufgeblasenen Lungen die Agarose in der Lunge zu ermöglichen, festzulegen und zu verfestigen. Die Nadel langsam entfernt und die Luftröhre mit einer Pinzette schließen Agarose jede nichtverfestigten nicht auslaufen.
  11. Expose der Lunge durch eine Sternotomie durchführen und herauszuschneiden anschließend in die Lunge. Zum Herausschneiden der Lunge, halten, um die Luftröhre, während vollständig durch die Luftröhre zu schneiden. Ziehen Sie die Luftröhre auf, das Bindegewebe und Speiseröhre beim Ziehen die Lunge aus dem Brustraum weggeschnitten, bis die Lungen von der Maus (1E) getrennt ist.
  12. Tauchen Sie in die Lunge in warmem RPMI-1640 übermäßiger Blut abzuwaschen und trennen Sie vorsichtig die Lappen von Schere und Pinzette die Lappen "Hauptstamm Bronchien bei Nabel (1F) zu schneiden.
  13. Legen Sie die Lappen, mit der flachen Oberfläche nach unten Abbildungsfläche zu maximieren, in eine Vertiefung einer 24-Well-Bildplatte (1G). Füge 100 & mgr; l von 37 ° C RPMI-1640 auf der Oberseite der Lappen. Legen Sie mehrere 15 mm Kreis Mikroskop Abdeckung gleitet oben auf den Lappen, damit sie nicht schwimmen.
  14. Gießen warmen PBS in die umgebenden Vertiefungen die RPMI-1640-Medium aus evap zu verhindernOrating. Legen Sie die 24-Well-Platte in der Klimakammer ins Gleichgewicht gebracht und unterhält die Lungenlappen bei 37 ° C mit Luft und 5% CO 2. Legen Sie die Klimakammer auf der Bühne des konfokalen Mikroskops.
    Hinweis: andere Gasgemische (beispielsweise 5% O 2, 5% CO 2 in N 2 Zellverhalten unter Bedingungen von Hypoxie / niedrigeren Sauerstoff zu untersuchen) ebenfalls berücksichtigt werden.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Das Protokoll für die Vorbereitung der Lunge für die Live-Darstellung. (A) Die Exposition der Luftröhre nach der Herstellung der Maus. (B) kleine Schnipsel aus in die freiliegende Luftröhre parallel zu den Knorpelringe. (C) 20 G Nadel eingeführt 4-5 mm in die Luftröhre. (D) Instillation von 400 ul 2% niedrig schmelzende Agarose-Temperatur in die Lunge. (E) Inflated Lungen von der Maus getrennt. (F) Lobes nach dem Aufblasen getrennt. (G) Keulen in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen Bildgebung gestellt. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

6. Akquisition und Analyse der Bilder

HINWEIS: Die Bilder können durch verschiedene Softwareprogramme unterstützt mit einer Vielzahl von Spinnplatten konfokalen Mikroskopen erworben werden. In diesem Protokoll entweder μManager mit einem maßgeschneiderten drehende Scheibe konfokalen Mikroskop oder Zen mit einem handelsüblichen Konfokalmikroskop drehende Scheibe ist für die Bildaufnahme verwendet, während Imaris für die Filmbearbeitung und Analyse verwendet wird.

  1. Erwerben Sie Bilder mit μManager. Eine detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Erfassung von Bildern μManager Software zuvor 18 beschrieben.
    ODER
  2. erwerben Sie BilderVerwendung von Bildanalysesoftware wie Zen (siehe Abbildung S1).
    1. Klicken Sie auf "Suchen" Registerkarte und wählen Ziel (10x oder 20x) in der "Light Path 'Werkzeug (Abbildung S1A, roter Kasten). Anschließend klicken Sie auf 'Eyes - DAPI "bei der GFP-Kanal durch das Okular schauen (Abbildung S1A, blauer Kasten). Lokalisieren Sie die Probe manuell das Mikroskop. Klicken Sie auf "Alle Off'after das Gewebe Mitte des Sichtfeldes ist.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte "Übernahme" für die Bildaufnahme alle Parameter einzustellen.
    3. In der Werkzeug 'Channels', klicken Sie auf die Schaltfläche "+" (Abbildung S1B, roter Kasten). Ein Pop-up-Menü erscheint und für den Farbstoff (en), die in der Probe in der 'Dye Datenbank' (Abbildung S1B) suchen. Wählen Sie den Farbstoff und klicken Sie auf "Hinzufügen".
      HINWEIS: Das Programm wird eingestellt Alle Filter optimiert werden. Ein Farbstoff kann gelöscht werdenindem Sie sie anschließend das Papierkorbsymbol (Abbildung S1B, gelber Kasten) klicken.
    4. Im Menü "Erfassungsmodus" gesetzt "Binning" zu 5x5. Klicken Sie doppelt auf ECFP in der Kanäle-Menü, um es auszuwählen. Senken Sie die Laserleistung auf 20%, so dass die Probe wird beim Einrichten der Parameter für die Bildaufnahme nicht gebleicht werden.
    5. Aktivieren Sie das Feld "Fliesen" in der "Experiment-Manager 'Abschnitt und die Fliesen Werkzeug erscheint in der" Mehrdimensionale Bildaufnahme' Werkzeuggruppe (Abbildung S1C). Klicken Sie auf "Erweiterte Einstellungen", um das Live-Bild der Kamera zu sehen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" im Bereich "Position" 4 bis 6 Positionen auf das Experiment hinzuzufügen. Um eine Position zu löschen, wählen Sie diese Position, und klicken Sie auf das Papierkorb-Taste.
    6. In der Werkzeuggruppe "Erwerb Parameter ', öffnen Sie das Werkzeug" Fokus-Strategie ", und wählen Sie" Absolute Fest Z-Position "aus der Dropdown-Liste.
    7. Schauen Sie sich die Z-Stapel-Box in der 'Experiment-Manager' Abschnitt und dem Z-Stapel-Tool erscheint in der "Mehrdimensionale Bildaufnahme 'Werkzeuggruppe (Abbildung S1D). Klicken Sie doppelt auf eine der Positionen in der "Position" Abschnitt und drücken Sie "Live". manuell einstellen ersten und letzten Position des Abbildungsfeldes gesetzt. Legen Sie das Intervall auf 4 um.
      Hinweis: Das Programm wird die Anzahl der Scheiben für den gewählten Bereich und Intervall bestimmen. Im Idealfall sind 5-7 Scheiben praktisch ausreichende Visualisierung und schnelle Bildaufnahme zu ermöglichen.
    8. Überprüfen Sie das Feld "Time Series" in der "Experiment-Manager-Seite. Den gewünschten "Laufzeit" und "Interval" mal in der "Time Series" Tool, das in der "Mehrdimensionale Bildaufnahme 'Werkzeuggruppe (Abbildung S1E) erschien.
    9. In der "Erwerbtion-Modus 'Menü einstellen "Binning" zu 2x2. Klicken Sie doppelt auf einem Fluorophor in den Kanälen Menü, um es auszuwählen und die Laserleistung auf 100% erhöhen. Drücken Sie "Live" und stellen Sie die "Belichtungszeit". Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fluorophor.
    10. Überprüfen Sie die "Enable Auto Save" ein. Wählen Sie einen Ordner und geben Sie den Namen der Datei ein. Alle aufgenommenen Bilder automatisch in diesem Ordner gespeichert werden.
    11. Klicken Sie auf "Start Experiment 'im Abschnitt' Experiment-Manager" Bildaufnahme zu starten.
  3. Nach der Bildaufnahme, die Rohdaten in Imaris Software kompilieren. Konvertieren von Bildern in .IMS Dateien und Anpassungen vorgenommen werden können. Eine detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Konvertierung von Dateien, so dass Anpassungen und Speichern von Filmen Imaris verwendet, ist zuvor beschrieben 18.
  4. Wenn Sie den Film zu speichern, setzen Sie die "Frame Rate" zu 5 Bilder pro Sekunde (fps).

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Ergebnisse

Mit Spinnen-Scheibe konfokalen Mikroskopie, verschiedene Mausmodellsystemen und Injektionen kann der metastatischen Mikroumgebung sichtbar gemacht und im Laufe der Zeit verfolgt werden. Mit Hilfe eines MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP dreifach transgenen Mausmodell, verschiedenen zellulären Komponenten werden fluoreszenzmarkierten (2A, Film 1). Die typische Struktur des Lungenparenchym kann in der GFP-Kanal sichtbar gemacht werden, da alle Zellen unter der β-Actin-Promotors exp...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung von Lungenmetastasen in Maus-Modellen der Metastasierung. Diese Bildgebungsprotokoll stellt eine direkte Visualisierung der Dynamik und räumliche Tumorzell-Stroma-Interaktionen innerhalb der Lunge Mikroumgebung. Es ist eine relativ einfache und schnelle Methode, die für mindestens 4 h zuverlässige Abbildung von Lungenmetastasen ermöglicht. Filme aus diesen Experimenten erworben kann verwendet werden, um dynamische Prozesse ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den von der IACUC genehmigten Protokollen, UCSF, durchgeführt.

Danksagungen

Wir danken Nguyen H. Nguyen für ihre technische Hilfe und Audrey O'Neill für die Unterstützung mit dem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop Zeiss Cell Observer. Diese Arbeit wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des Verteidigungsministeriums (W81XWH-11-01-0139) und das Weizmann Institute of Science-National Postdoctoral Award Program for Advancing Women in Science (to V.P.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MMTV-PyMT/FVB-MäuseJackson Laboratory2374Weibliche Mäuse
ACTB-ECFP/FVB-MäuseUCSF Werb labWeibliche Mäuse
c-fms-EGFP/FVB MäuseUCSF Werb labWeibliche Mäuse
FVB MäuseJackson Laboratory1800Weibliche Mäuse
GFP+ VO-PyMT ZellenUCSF Werb lab
70.000 kDa Dextran, Rhodamin-konjugiertesInvitrogenD1818Verdünnen auf  4mg/ml in 1 x PBS und lagern bei -20  >C. Verwenden Sie 0,4 mg pro Tier. 
10.000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 konjugiertesInvitrogenD22914Verdünnen auf  4mg/ml in 1 x PBS und lagern bei -20  &nb;C. Verwenden Sie 0,4 mg pro Tier. 
Anti-Maus-Gr-1-Antikörper Alexa Fluor 647UCSF Monoklonaler Antikörper KernBestand 1 mg/ml. Verwenden Sie 7 μg pro Tier.
, die von der IACUC zugelassen ist und für die Anästhesie und/oder Euthanasie
verwendet wird 1X PBSUCSF Zellkulturanlage
PBS, USP steril Amresco INCK813-500MLUltrareine Qualität für die intravenöse Injektion
StyroporplattformWird als Sezierbrett verwendet
Feine Schere scharf  Fine Science Tools14060-11
PinzetteRoboz Surgical StoreRS-5135
HeißperlensterilisatorFine Science Tools18000-45Einschalten 30 Minuten vor Gebrauch
AirUCSF
SauerstoffUCSF
KohlendioxidUCSF
1 mL Spritze ohne Nadel BD309659
27 G x 1/2 Nadel  BD305109für i.v. Injektion
20 G x 1 Nadel, kurze Abschrägung;  BD305178
Agarose bei niedriger Schmelztemperatur Lonza50111Um 10 ml Lösung herzustellen, wiegen Sie 0,2 g Agarose, geben Sie 1 x PBS zu 10 ml und erhitzen Sie sie, um sich aufzulösen. Agarose verfestigt sich bei Raumtemperatur, also bei 37 ° C halten; C Wasserbad, bis es zum Aufblasen verwendet wird.
RPMI-1640 Medium ohne PhenolrotLife Technologies11835-030
24 Well Speicherfolie E& K scientificEK-42892
Objektträger aus Glas, 15 mm Fisher Scientific22-031-144
Digitaler CO2- und TemperaturreglerOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
KlimakammerOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer konfokales Spinning-Disk-MikroskopZeiss
Zen-SoftwareZeiss Inverses
MikroskopCarl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
ICCD-KameraStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Konfokaler Scankopf mit Spinning-DiskYokogawa CorporationCSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale Lab, UCSFOpen-Source-Software
Anästhesie-Anästhesie

Referenzen

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  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
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