Methodenartikel

Immunfärbung Phospho-Epitope in Ciliated Organe Ganze Berge Zebrafischembryonen

DOI:

10.3791/53747

⸱

19. Februar 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es sind Techniken beschrieben Phospho-Epitope in ganz Zebrafischembryonen zu Immunfärbung und dann leiten zweifarbige Leuchtstoff konfokalen Lokalisierung in zellularen Strukturen so klein wie primäre Zilien. Die Techniken zur Fixierung und Bildgebung können die Position und die Kinetik des Erscheinens oder Aktivierung spezifischer Proteine ​​definieren.

Zusammenfassung

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Die schnelle Proliferation von Zellen, die gewebespezifische Expression von Genen und die Entstehung von Signalisierungsnetze charakterisieren frühen embryonalen Entwicklung aller Wirbeltiere. Die Kinetik und die Lage der Signale - auch innerhalb einzelner Zellen - in den sich entwickelnden Embryo ergänzt die Identifizierung wichtiger Entwicklungsgene. Immunfärbung Techniken beschrieben, die die Kinetik der intrazellulären und ganzen Tier Signalen in Strukturen so klein wie primäre Zilien definieren abgebildet wurden. Die Techniken zur Fixierung, Imaging und Bearbeitung von Bildern mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskops verwendet, kann in nur 36 Stunden abgeschlossen sein.

Zebrafisch (Danio rerio) ist eine wünschenswerte Organismus für Forscher, die versuchen, Studien in einem Wirbeltierarten durchzuführen, die erschwinglich und relevant für die menschliche Krankheit. Genetic Knockouts oder Niederschlägen muss durch den Verlust der tatsächlichen Proteinprodukt bestätigt. Eine solche Bestätigung von Proteinverlustwerden können unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken erreicht. Clues der Signalwege kann auch durch Verwendung von Antikörpern entschlüsselt werden, der mit Proteinen reaktiv sind, die durch Phosphorylierung posttranslational modifiziert wurden. Die Erhaltung und die phosphorylierten Zustand eines Epitops Optimierung ist daher entscheidend für diese Bestimmung und wird von diesem Protokoll erreicht.

Diese Studie beschreibt Techniken Embryonen während der ersten 72 Stunden der Entwicklung und zu beheben eine Vielzahl von relevanten Epitope mit Zilien in das Vesikel (KV), die Nieren und das Innenohr des Kupffer co-lokalisieren. Diese Verfahren sind einfach, nicht Dissektion erforderlich und kann in einer relativ kurzen Zeitspanne abgeschlossen werden. Projizieren konfokale Bildstapel zu einem einzigen Bild ist ein nützliches Mittel, um diese Daten zu präsentieren.

Einleitung

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Die hier beschriebenen Techniken sind das Ergebnis von Studien, die versucht haben, nachgelagerte Ziele von Ca2+-Signalen während Ereignissen zu definieren, die während der frühen Entwicklung auftreten, einschließlich Befruchtung, Gastrulation, Somitogenese und Rumpf-, Augen-, Gehirn- und Organbildung. 1-3 Die ursprünglichen Entdeckungen der embryonalen Ca2+-Signalgebung hingen von der Verwendung natürlicher und manipulierter Ca2+-Indikatoren wie Aequorin4 und Fura-2 ab. 5 Selbst mit dem derzeitigen Stand der Technik erfordert die Detektion von transienten Erhöhungen von Ca2+ umständliche Analysewerkzeuge und verrät nicht die Ziele solcher Ca2+-Signale.

Dieses Labor untersucht Ca2+-Signale, die über die Ca2+/Calmodulin-abhängige (multifunktionale) Proteinkinase wirken, die als CaMK-II bekannt ist, ein Enzym, das im Zentralnervensystem angereichert ist und ursprünglich als Regulator der Langzeitpotenzierung identifiziert wurde. 6 CaMK-II ist nicht gehirnspezifisch, wird weit verbreitet exprimiert und ist über die gesamte Lebensspanne und den Körper von Arten im gesamten Tierreich, einschließlich wirbelloser Tiere, hochkonserviert. 7,8 CaMK-II hat die einzigartige Fähigkeit, seine eigene Aktivität auch dann aufrechtzuerhalten, wenn der Ca2+-Spiegel aufgrund seiner Fähigkeit, bei Thr287 zu autophosphorylieren, abgenommen hat. In diesem autophosphorylierten Zustand bleibt CaMK-II in einer Ca2+/CaM-unabhängigen Weise aktiv, bis es dephosphoryliert ist. 6 Somit kann die Lokalisation von phosphoryliertem CaMK-II (Thr287) Zellen identifizieren, in denen natürliche, relevante Ca2+-Erhöhungen aufgetreten sind.

Ein Antikörper gegen autophosphoryliertes (P-Thr287) Säugetier-CaMK-II wurde gut charakterisiert und ursprünglich zur Lokalisierung von aktiviertem CaMK-II im Hirngewebe verwendet. 9 Zebrafische (Danio rerio) besitzen sieben CaMK-II-Gene10,11, deren Proteinprodukte in dieser Region eine Sequenz von MHRQE[pT287]VECLK enthalten. 10,11 Diese Sequenz ist dem Phosphopeptid-Antigen, das zur Herstellung dieses polyklonalen Kaninchen-Antikörpers (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) und daher war es nicht völlig überraschend, dass dieser Antikörper mit dem Zebrafisch CaMK-II kreuzreagierte. In diesem Labor konnte gezeigt werden, dass dieser Antikörper mit Zebrafisch CaMK-II proportional zur Autophosphorylierung und Ca2+/CaM-unabhängigen Aktivität reagiert. 12 Es wurde auch gezeigt, dass zusätzliche pan-spezifische CaMK-II-Antikörper mit Zebrafisch-CaMK-II kreuzreagieren. 13

Dieser Antikörper wurde verwendet, um zu zeigen, dass Zebrafisch-CaMK-II bevorzugt in Zellen auf einer Seite des Zebrafisch-Kupffer-Vesikels (KV) aktiviert wird, dem Flimmerorgan, das für die Etablierung der Links/Rechts-Asymmetrie notwendig ist. 12 Dieser Antikörper wurde verwendet, um zu zeigen, dass CaMK-II in vier benachbarten Zellen auf der linken Seite des KV während genau derselben Entwicklungsphase, in der die Organpositionierung bestimmt wird, vorübergehend aktiviert wird. 12 Zusätzlich zum Kupffer-Vesikel (KV) befand sich autophosphoryliertes (P-T287) auch an spezifischen intrazellulären Stellen in anderen Flimmergeweben wie der Niere, den Neuromasten und dem Innenohr. 12,13 In der Zebrafischniere istP-T 287-CaMK-II entlang der apikalen Grenze der Flimmerdrüsenzellen und innerhalb der kloakalen Flimmerhärchen angereichert, wo es deren Anordnung beeinflusst. 13 Schließlich ist P-T 287-CaMK-II im sich entwickelnden Innenohr stark an der Basis der Zilien konzentriert und beeinflusst die Zelldifferenzierung über den Delta-Notch-Signalweg. 14 Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nachweis von aktiviertem CaMK-II die Stellen der intrazellulären Ca2+-Freisetzung lokalisiert und potentiell neue Signalwege beleuchtet hat.

Diese Entdeckungen hingen vollständig von der Entwicklung einer sensitiven und genauen Methode zur Lokalisierung von aktiviertem (P-T 287-autophosphoryliertem) CaMK-II ab. Es werden die Methoden zur Fixierung und Immunfärbung des Zebrafisch-KV, der Niere und des Innenohrs beschrieben. Auch die Grenzen dieser Technik werden beschrieben. Diese Techniken sollten für jeden Forscher nützlich sein, der während der frühen Entwicklung von Wirbeltieren hochauflösende Bilder in zwei Fluoreszenzkanälen nicht nur von Phospho-Epitopen, sondern von jedem Epitop erhalten möchte.

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Protokoll

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Der Zebrafisch Verfahren in diesem Protokoll wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Commonwealth University genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. 4% PFA / PBS. Wiegen 8 g Paraformaldehyd (PFA) in der Abzugshaube. Während noch in der Dunstabzugshaube, lösen sich die trockene PFA in ~ 80 ml ​​destilliertem H 2 O unter Rühren und Erwärmen auf 50 ° C. Unter Rühren hinzufügen, 3-10 Tropfen frischer 1 N NaOH bis PFA vollständig gelöst ist und Lösung klärt. Vom Herd nehmen und mit 100 ml 2x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bringen Volumen auf 200 ml mit destilliertem H 2 O. Abkühlen auf RT und bestätigen pH-Wert von 7,4 vor dem Gebrauch. Lagerung im Dunkeln bei 4 ° C, aber verwenden innerhalb einer Woche.
  2. Verwenden Sie 100% Methanol ohne Ergänzungen. Verwenden Sie 95% Ethanol ohne Ergänzungen.
  3. Bereiten Phosphat-gepufferter Tween (PBT). Ergänzen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Tween-20. In 0.5 ml einer 20% igen Tween-20-Stammlösung zu 100 ml 1x PBS. Lagern bei RT.
  4. Bereiten phosphatgepufferter Triton-X (PBTx). Ergänzen PBS mit 0,1% Triton X-100. 0,5 ml einer 20% Triton X-100 Lager zu 100 ml PBS. Lagern bei RT.
  5. Bereiten Sie 10% NGS / PBTx. Normales Ziegenserum (NGS) blockiert unspezifische Bindungsstellen. Shop NGS bei -20 ° C. So verwenden, 1 ml bis 9 ml PBTx.
  6. Vorbereitung 50% Glycerin / PBS. Gründlich mischen zu gleichen Teilen aus 2x PBS und 100% Glycerin. Lagern bei RT.

2. Embryo Fixation

  1. . (. ZB β-Actin: CAAX-GFP) Abstammung Erhalten Wildtyp (AB und WIK) oder transgenen Embryos durch natürliche Paarungen. Falls gewünscht, injizieren Embryonen mit Konstrukten oder Morpholinos, wie beschrieben. 15,16
  2. Embryonen erhöhen. Sammeln Embryonen und Inkubation bei 28,5 ° C in Gegenwart von 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) Pigmentierung zu blockieren, wie beschrieben. 17 p>
  3. Fix. Wenn Embryonen den gewünschten Entwicklungsstadium erreicht haben, 18,   betäuben die Embryonen mit MESAB, entfernen Sie so viel Wasser wie möglich System und fügen Sie frisch 4% PFA / PBS für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur. HINWEIS: In Zeiten von weniger als 20 Stunden nach der Befruchtung (HPF), fix vor dechorionation. Manchmal nach 20 HPF, dechorionate vor der Fixierung mit zwei Paaren von feinen Spitze einer Pinzette unter einem Binokular.
  4. Ändern Lösungen. Transfer-Embryonen eine breite Bohrung Pipette, wie beschrieben. 17 Lösungen wechseln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kappe bedeckt, einfach, indem Embryonen durch die Schwerkraft ohne Zentrifugation zu begleichen.
  5. Post-Fixierungs Nach 3 -. 4 Stunden, entfernen PFA / PBS, ersetzen mit 100% Methanol und bei -20 ° C für mindestens 48 Stunden. HINWEIS: Für maximale P-CaMK-II-Immunreaktivität, begrenzen Gesamt Methanol Lagerzeit bis zu einer Woche.
"> 3. Die Immunfärbung Ganze Embryonen

  1. Setzen Sie ein Minimum von 10 Embryonen für jede Versuchsbedingung in verschlossenen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und beschriften.
  2. Lassen Sie die Embryonen zu regeln. Entfernen und entsorgen Methanol und rehydratisieren mit progressiven wäscht mit 0,5 ml Ethanol-Konzentrationen abnimmt, wie im nächsten Schritt angegeben. Jeder Schritt ist ein 5 min Waschen mit Schaukel.
  3. Progressiv mit diesen 5 Lösungen rehydriert: 66% Ethanol / 33% PBTx, 33% Ethanol / 66% PBTx 100% PBTx 100% PBTx (dies ist die erste Wiederholung PBTx), 100% PBTx (dies ist die zweite Wiederholung von PBTx).
  4. Entfernen letzten PBTx waschen. 0,5 ml 10% NGS / PBTx. mindestens 1 Stunde bei RT inkubieren unter leichtem Schütteln und dann entfernen und Lösung verwerfen.
  5. Bereiten primären Antikörperlösung durch in 10% NGS / PBTx verdünnen. Wenn Co-Immunfärbung verwenden höhere Affinität Antikörper zuerst. 500: mit der Maus anti-acetylierten Antikörper Tubulin monoklonalen verdünnt 1 Für diese Studie inkubiert. für example, wenn 10 Proben sind, kombinieren 6 ul der Stammantikörperlösung mit 3 ml 10% NGS / PBTx und dann 0,3 ml davon in jedes Röhrchen verteilt.
  6. Hinzufügen 0,2-0,5 ml der verdünnten primären Antikörpers zu jedem Röhrchen alle Embryonen einzutauchen. Inkubieren unter leichtem O / N bei RT zu schaukeln.
  7. Am Morgen, zu entfernen und Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx überschüssigen primären Antikörpers weg zu waschen. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen.
  8. Dim Lampen oder verdünnen Sie den entsprechenden fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper in 10% NGS / PBTx so dass jeder Zustand mindestens 0,5 ml enthält. Mit der Maus-Anti-acetyliertes Tubulin primärer Antikörper, verwenden Sie die grün-fluoreszierenden Farbstoff Ziegen-Anti-Maus-IgG bei einer 1: 500-Verdünnung.
  9. Inkubieren sekundären Antikörper für 4 Stunden unter leichtem im Dunkeln bei RT Schaukel. Von nun an Verfahren die Proben unter gedämpftem Licht und in einem dunklen Behälter brüten oder in Alufolie wickeln.
  10. Am Ende der Inkubation entfernt und die sekundäre Antikörperlösung verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx zu waschen. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen.
  11. Wenn Co-Immunfärbung, erhalten den zweiten primären Antikörper von einer anderen Spezies als der ersten primären Antikörper. In diesen Studien, folgen Sie dem Kaninchen-Anti-phospho CaMK-II-Antikörper von der rot-fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörpers.
  12. Verdünnen Kaninchen-Anti-phospho CaMK-II-Antikörper 1.20. Für jedes Röhrchen von Embryonen, in 0,3 ml 10% NGS / PBTx aussetzen, dann 15 ul der Stammantikörperlösung hinzuzufügen.
  13. Stellen Sie sicher, dass Embryonen werden eingetaucht und Lichter gedimmt werden. Inkubieren unter leichtem O / N bei RT im Dunkeln zu schaukeln.
  14. Am Morgen unter der gedämpften Beleuchtung entfernen und Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen.
  15. Halten Overhead Lichter dimmen und verdünnen genug von dem entsprechenden fluoreszenz conjugated sekundären Antikörper, so dass jeder Zustand mindestens 0,5 ml. In dieser Studie wurden die verdünnten roten Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (roter Kanal) 1: 500 in 10% NGS / PBTx.
  16. Inkubieren zweiten sekundären Antikörper für 4 Stunden mit sanften im Dunkeln bei RT zu schaukeln.
  17. Am Ende dieser Inkubation und unter der gedämpften Beleuchtung ist zu entfernen und die sekundäre Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml PBTx. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen. Speicher in entweder PBTx oder 50% Glycerin / PBS in Abhängigkeit von dem Bildgebungsverfahren.

4. Die konfokale Fassung und -verarbeitung

  1. Berg Embryonen für die Bildgebung. Zeigen 1-5 Embryonen auf einem Glasträger. Erstellen einer Kammer zwischen dem Hauptdeckglas und dem Objektträger unter Verwendung von Deckglas-Fragmente auf jeder Seite der Kammer. Typischerweise werden vier # 1 Deckgläser verwendet, um diese Abstandshalter Stapel zu machen, ohne zu verkleben.
    HINWEIS: Keine Montage Medium notwendig.
  2. Verwenden Sie eine 100X ÖlimmersionZiel einzigen Embryo in den Fokus Durchlicht zu bringen. Schalten Sie Licht. Schalten Sie konfokalen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass geeignete Laser (grün und / oder rot) eingeschaltet sind und Remote-Fokus Mithelfer eingreift.
  3. Schalten Sie den konfokalen Programm. In der "Acquire Bar", die richtige Ziel wählen. In der "XY Basic" Bar, setzen die Bildgröße auf 1.024 von den 1.024 Button.
  4. In der "Laser und Detektor" Leiste klicken Sie auf den roten 488-Box und dem grünen 568 Feld Laser und Detektor für jeden Kanal zu schalten. Stellen Pinhole bis mittelgroß und passen Sie die Verstärkung in der "Gain" Bar jeder Kanal zu visualisieren.
  5. Im "Einstellungen Acquire" Leiste auf "Live" Erfassung von Bildern zu beginnen. In der "Einstellungen anzeigen" Bar, deaktivieren Sie die "Force Integral Zoom" Box-Center in der "Live" -Fenster.
  6. In der "Einstellungen abrufen" bar unter dem "Z" Registerkarte Schritt durch die Schichten des Bildes. Nach der Auswahl der number optischer Schnitte in das Bild zu übernehmen, in der "Mitte" der z-Ebene bis zu einem gewissen Punkt.
  7. Im Rahmen der "Z", klicken Sie das kleine rote "Reference" ein. Dadurch wird die RFA an dem Punkt Null, wenn die "Mitte" gewählt. Im Feld "Schrittweite" bezeichnet, wählen Sie die Dicke der Schichten (zwischen 0,25 & mgr; m und 2,0 & mgr; m ist ideal). Achten Sie auf das "File Size" ein und versuchen zu 1 GB zu begrenzen.
    HINWEIS: In der Regel bis zu 40 optische Schnitte von 0,5 bis 1,0 & mgr; m erhalten werden, aber die Anzahl der Abschnitte können empirisch bestimmt werden.
  8. Um die oben extreme des Bildes zu finden, klicken Sie auf den Kreis neben "Top" und bewegen sich durch die z-Schichten. Jetzt den Kreis klicken Sie neben "Unten", nimmt der Computer das Bild wieder in der Schicht als Zentrum. bewegen wieder durch die Schichten der unteren extremen des Bildes zu finden.
  9. Klicken Sie auf "Live" wieder in den "Einstellungen abrufen" Feld des Lasers zu stoppenErwerb. In diesem Fenster klicken Sie auf die roten Kisten etikettiert Durchschnitt und Z-Stapel. Diese Boxen wird grün.
  10. In der "Einstellungen abrufen" ein, klicken Sie auf "Single" das ganze Reihe von Bildern zu erwerben. Sie können den Fortschritt überwachen, da es in beiden Kanälen durchsucht und durch die gesamte Z-Stapel.
  11. Zu speichern, klicken Sie auf das Fenstervolumen und klicken Sie auf "Speichern unter" und den Dateinamen. Speichern als ".ids" -Datei. Um die Lautstärke zu machen, die Datei während der Z-Stapel noch geöffnet ist, wählen Sie das Menü Daten nach unten ziehen und klicken Sie auf "Volumen machen". Speichern Sie die gerenderte Datei als TIFF-Datei. Dies ist das projizierte Bild, das in dieser Veröffentlichung dargestellt sind.

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Ergebnisse

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Optimale Bedingungen für die Visualisierung von Phospho-Epitope

Methoden, um die Immun von Protein-Epitope in Zebrafischembryonen beschrieben haben relativ spärlich gewesen im Vergleich zu denen für mRNAs über in-situ-Hybridisierung zu lokalisieren. Fixiermittel bei der Lokalisierung von Protein-Epitope in Geißelzellen des Zebrafischembryonen verwendet haben 4% PFA / PBS und Dent Fixierungsmittel enth...

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Diskussion

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Die PFA / Methanol-Verfahren wurde in diesem Labor mit dem vorrangigen Ziel der Optimierung der Immun des Phospho-T 287 -CaMK-II-Epitop während Zebrabärblingentwicklung entwickelt. Diese Methode erfolgreich P-CaMK-II bei der Bildung von mehreren ciliated Organe, einschließlich Zebrafisch KV, 12 Innenohr 14 und Niere. 13 besonders am KV Stufe diese Technik notwendig war, lokalisiert. Der Erfolg dieses Verfahrens ist wahrscheinlich auf eine Kombination von a) Minimierung von Aut...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Grant IOS-0817658 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)SigmaP-76290,12 % Stammlösung. 1:40 in Systemwasser verdünnen
Alexa488 Anti-Maus IgGLife TechnologiesA11001Ziege polyklonal, verwenden bei 1:500
Alexa488 Anti-Kaninchen IgGLife TechnologiesA11008Ziege polyklonal, verwenden bei 1:500
Alexa488 PhalloidinLife TechnologiesA12379Bindet bevorzugt an F-Aktin
Alexa568 Anti-Maus IgGLife TechnologiesA11004Ziegenpolyklonal, verwenden bei 1:500
Alexa568 anti-Kaninchen IgGLife TechnologiesA11011Ziege polyklonal, verwenden bei 1:500
anti-acetyliert α-TubulinSigmaT7451Maus monoklonal, verwenden bei 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Kaninchen polyklonal, verwenden bei 1:20
anti-gesamt CaMK-IIBD Biosciences611292Maus monoklonal, Verwendung bei 1:20
EthanolFisherS96857Laborqualität, 95% denaturiert
PinzetteFine Science Tools11252-20Dumont #5
GlasdeckgläserVWR16004-330#1  Dicke
GlasobjektträgerFisher12-550-15Standard Glasobjektträger
MethanolFisherA411Im Gefrierschrank aufbewahren
MikrozentrifugenröhrchenVWR20170-038Röhrchen mit Deckel, nicht steril
Normales ZiegenserumLife Technologies16210-064Aliquot 1 ml Röhrchen, im Gefrierschrank
aufbewahren ParaformaldehydSigmaP-6148Reagenzqualität, kristallin
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Qualität Biologisch119-069-13110x Stammlösung oder im Labor hergestellt
Triton X-100SigmaBP-15110% ige Lösung in Wasser, lagern bei RT
Tween-20Life Technologies8511310% ige Lösung in Wasser, lagern bei RT
VerbundmikroskopNikonE-600Halterung auf vibrationsfreiem Tisch
C1 Plus Zwei-Laser-Scanning konfokalNikonC1 PlusLäuft durch das EZ-C1-Programm, aber Upgrades verwenden " Elemente"

Referenzen

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Schlagwörter

KonfokalmikroskopiePFA Methanol Fixierungacetyliertes TubulinPhospho CaMKIIKupffer VesikelWhole Mount ImagingLaser Scanning

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