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Methodenartikel

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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DOI:

10.3791/53748

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24. März 2016

 ,  , 
1ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of BioSciences, University of Melbourne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken, die für die strukturelle Charakterisierung von Glykosylsequenz(en) im reduzierenden Endbereich (RE) und Glykosylsequenz(en) im internen Bereich von Heteroxylanen verwendet werden, indem das RE vor der enzymatischen Hydrolyse (Endoxylanase) mit 2 Aminobenzamid markiert und dann die resultierenden Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)

analysiert werden.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken zur Charakterisierung verwendet Ende Reduktions (RE) und inneren Bereich Glycosyl-Sequenz (en) von Heteroxylane. De-gestärkten Weizen Endosperm Zellwände wurden als Alkohol unlösliche Rückstand (AIR) 1 und der Reihe nach mit Wasser (W-sol Fr) und 1 M KOH , die 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) extrahiert isoliert , wie von Ratnayake et beschrieben al. (2014) 2. Zwei verschiedene Ansätze (siehe Zusammenfassung in Abbildung 1) angenommen werden . In der ersten werden intakte W-sol AXs mit 2AB behandelt, um die ursprüngliche RE Hauptkette Zuckerrest zu markieren, und dann mit einem Endoxylanase behandelt, um eine Mischung aus 2AB-markiertem RE und inneren Bereich Reduktions Oligosaccharide zu erzeugen, respectively. In einem zweiten Ansatz wird die KOH-sol Fr mit Endoxylanase hydrolysiert, zuerst eine Mischung von Oligosacchariden zu erzeugen, die mit 2AB anschließend markiert sind. Die enzymatisch veröffentlicht ((un) markiert) Oligosaccharide aus beidenW- und KOH-sol Frs sind dann methyliert und die detaillierte Strukturanalyse sowohl die nativen und methylierte Oligosaccharide erfolgt eine Kombination von MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS und ESI-MS n verwenden. Endoxylanase verdaut KOH-sol AXs werden auch durch kernmagnetische Resonanz gekennzeichnet (NMR), die auch Informationen über die anomere Konfiguration liefert. Diese Techniken können auf andere Klassen von Polysacchariden angewendet werden, um die entsprechenden endo-Hydrolasen verwendet.

Einleitung

Heteroxylane sind eine Familie von Polysacchariden , die die vorherrschenden nicht-cellulosischen Polysacchariden der Primärwänden von Gräsern und den sekundären Wänden aller Angiospermen 3-6 sind. Die Xylan - Backbones unterscheiden sich in ihren Typen und Muster der Substitution mit Glykosyl (Glucuronsäure (GlcA), Arabinose (Araf)) und nicht-Glycosyl (O-acetyl, Ferulasäure) -Reste je nach Gewebetyp, Entwicklungsstadium und Art 7.

Wände aus Weizen (Triticum aestivum L.) Endosperm bestehen hauptsächlich aus Arabinoxylane (AXs) (70%) und (1 → 3) (1 → 4) zusammengesetzt -β-D-Glucane (20%) mit geringen Mengen an Cellulose und heteromannans (je 2%) 8. Die Xylan-Rückgrat kann verschieden un-substituiert sein und überwiegend mono-substituierte (hauptsächlich O-2-Position und in einem geringeren Ausmaß O-3 Position) und di-substituierte (O-2 und O-3-Positionen) mit α-L-Ara f Reste 9. Das Reduktions Ende (RE) von heteroXylane aus dikotylen Pflanzen (beispielsweise Arabidopsis thaliana) 10 und Gymnospermen (beispielsweise Fichte (Picea abies)) 11 enthält eine charakteristische Tetrasaccharid Glycosyl - Sequenz; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Um zu verstehen, heteroxylan Biosynthese und Funktion (biologische und Industrie), ist es wichtig, um vollständig die Xylan-Hauptsequenz die Typen und die Muster der Substitutionen sowie die Sequenz des reduzierenden Ende (RE) zu verstehen.

Spezifische Techniken zur strukturellen Charakterisierung von reduzierenden Ende (RE) und inneren Bereich Glycosyl-Sequenz (en) von Heteroxylane sind in diesem Manuskript beschrieben. Die Techniken beruhen auf Fluorophore (mit 2 Aminobenzamid (2AB)) das reduzierende Ende (RE) der heteroxylan Kette vor der enzymatischen (Endoxylanase) Hydrolyse Tagging. Dieser Ansatz, insbesondere für die RE Sequenzierung wurdezuerst vom Labor Yorker berichtet 10,12-13 aber jetzt sind der innere Bereich Sequenzierung erweitert und ist eine Kombination von etablierten Techniken, die für alle Heteroxylane unabhängig von ihrer Quelle der Isolation ebenso anpaßbar ist. Dieser Ansatz kann auch auf andere Klassen von Polysacchariden verwendet (soweit verfügbar) die entsprechenden endo-Hydrolasen angewendet werden.

In der vorliegenden Studie de-gestärkte wheat endosperm Zellwände wurden als ein in Alkohol unlösliche Rückstand (AIR) und der Reihe nach mit Wasser (W-sol Fr) und 1 M KOH , enthaltend 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) extrahiert wie beschrieben isoliert in Ratnayake et al. (2014) 2. Die freigesetzten Oligosaccharide von beiden W- und KOH-sol Frs dann methyliert und die detaillierte Strukturanalyse von sowohl den nativen und methylierte Oligosaccharide erfolgt mit einer Kombination von MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-Verbindung mit HPLC mit der Verwendung Online chromatographische Trennung einer RP C-18-Säule unter Verwendung vonund ESI-MS n. Endoxylanase verdaut KOH-sol AXs auch durch magnetische Kernresonanz (NMR) charakterisiert wurde.

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Protokoll

1. Kennzeichnung des reduzierenden Ende (RE) Zuckerrest von W-sol AXs mit 2-Aminobenzamid (2AB)

  1. Inkubieren W-sol AXs mit 2AB (0,2 M) in Gegenwart von 1 M NaBH 3 CN (Natriumcyanoborhydrid) (pH 5,5) für 2 Stunden bei 65 ° C , um die reduzierenden Enden der Polysaccharid - Hauptketten in ihre fluoreszierenden Derivate umzuwandeln.
    ACHTUNG: Der folgende Schritt sollte im Abzug durchgeführt werden , wie NaBH 3 CN frei giftige Zyanid Gas , wenn es mit Wasser in Kontakt ist.
    1. Abwiegen NaBH 3 CN (62,8 mg) und in Wasser (1 ml) in einem Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) lösen , um eine 1 M NaBH 3 CN - Lösung herzustellen. Auflösen 2AB - Reagenz (27,2 mg) in 1 M NaBH 3 CN - Lösung (1 ml) durch Erhitzen auf 65   ° C und den pH - Wert des Reaktionsgemisches (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) bis pH 5,5 mit 10% Essigsäure eingestellt werden .
    2. In 200 ul Reaktionsmischung (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) zu W-sol AXs (1 mg) in einem Glasrohr mit einer Kappe und mischen Sie einen Vortexer. Inkubieren für 2 h bei 65   ° C in einem Abzug. Man kühlt die Suspension auf RT und fügen 4 Bde. absolutem Ethanol.
    3. Platzieren Sie die Suspension in einem Kältespeicher (4 ° C) O / N auszufällen Polysaccharide.
    4. Zentrifuge (1500 xg, 10 min, RT) Überstand zu entfernen. Waschen des Pellets extensiv mit absolutem Ethanol (4 x), Aceton (1x) und Methanol (1x), zwischen jeder Wasch Zentrifugieren. Vakuum trocken bei 40 ° CO / N.
      Hinweis: gründliches Waschen entfernt auch Rest 2AB.

2. Erzeugung von Xylo-Oligosaccharide aus 2 AB Labelled W-sol AXs

  1. Auflösen 2AB W-sol AXs (1 mg) in 500 & mgr; l Natriumacetat-Puffer (100 mM, pH 5) in einem Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) markiert. In 4 Einheiten Endoxylanase (GH 11, [M1]) und Inkubation bei 37   ° C für 16 Stunden.
  2. Zerstören Sie die Enzymaktivität durch die Reaktion mixt Heizungure für 10 min in einem kochenden Wasserbad. Man kühlt die Suspension auf RT und Transfer zum Glasrohr mit einer Kappe. In 4 Bde. absolutem Ethanol gelöst und die Suspension in einem Kühllager Ort (4 ° C) O / N keine unverdaute Polysaccharide auszufällen.
  3. Zentrifuge (1500 xg, 10 min, RT) unverdaute Polysaccharide (Pellet) und Endoxylanase erzeugt Xylo-Oligosaccharide (Überstand) zu trennen. Dekantieren Überstand in ein sauberes Glasröhrchen und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad (40 ° C).
  4. Man dampft das Ethanol unter einem Strom von Stickstoffgas zu einem Endpunkt Volumen (~ 500 & mgr; l). Frieren Sie den Überstand bei -80 ° C für 4 Stunden und Trocknen des gefrorenen Überstand in einem Gefriertrockner Xylo-Oligosaccharide zu erholen.

3. Erzeugung von Xylo-Oligosaccharide aus KOH-sol AXs und 2AB Kennzeichnung

  1. Behandeln KOH-sol AXs mit Endoxylanase (GH 11, [M1]) Xylo-Oligosaccharide zu erzeugen, wie oben (Abschnitte 2.1-2.4) beschrieben.
  2. Treat Endoxylanase erzeugt Xylo-Oligosaccharide aus KOH-sol AXs mit 2AB Reaktionsgemisch (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) , wie oben (Abschnitte 1.1.1-1.1.2) beschrieben.
  3. Dekantieren Überstand in ein sauberes Glasröhrchen und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad (40 ° C). Man dampft das Ethanol unter einem Strom von Stickstoffgas zu einem Endpunkt Volumen (~ 500 & mgr; l). Frieren Sie den Überstand bei -80 ° C für 4 Stunden und Trocknen des gefrorenen Überstand in einem Gefriertrockner Xylo-Oligosaccharide zu erholen.

4. MALDI-TOF-MS

  1. Herstellung von MALDI-Matrix-Lösung
    1. Eine kleine Kugel 2, 5-dihydroxbenzoic Säure (DHB) bis 50% Acetonitril (500 ml), enthaltend 0,1% Ameisensäure in einem Rohr (MALDI-Matrix-Lösung). Mischen Sie einen Wirbel verwenden, wenn es sich schnell auflöst, fügen Sie eine weitere kleine Kugel DHB. Hinweis: Ideal Konzentration von MALDI-Matrix - Lösung beträgt 10 ug / ul -1.
  2. Herstellung von MALDI-Zielplatte
    1. Hinterlegung der aqueouns Oligosaccharid (nativ) Proben (5-10 ug) (W-Sol und / oder KOH-sol) auf eine MALDI-Zielplatte. Zugabe von 0,3 ul MALDI-Matrix-Lösung eine separate Spitze mit und mischen durch Pipettieren von oben und unten. Lassen Sie die Mischung bei RT trocknen.
      Hinweis: Richtig getrockneten Proben von langen nadelförmigen Kristallen bestehen sollte in Richtung der Mitte des Flecks zeigt. Wenn die Ablagerung klebriger ist und / oder schmierige die Probe entweder zu konzentriert sein kann, oder aus Salzen sind solche Ablagerungen unwahrscheinlich gute Spektren zu erzeugen, und die Probe sollte weiter gereinigt werden.
    2. Führen Sie die Zielplatte in die MS Quelle und arbeiten in positiver (+ ive) Ionenmodus. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 19,0 kV bei Ionenquelle 1 und 16,3 kV bei Ionenquelle 2. Stellen Sie die Laserleistung auf mehr als 70%. Wählen Sie den Probenpunkt auf der MALDI-Zielplatte und klicken Sie auf Start Laserschüssen zu beginnen.
      Hinweis: Alle Bereiche des Ziel werden keine Signale ergeben. Eine bestimmte Stelle wird nur ein Signal für ein paar Laserschüsse aufgrund entweder gebenAbreicherung der Probe / Matrix-Mischung oder Eigenschaften des Kristalls.
      1. Bewegen Sie den Laser auf verschiedene Bereiche des Targets während der Erfassung und durchschnittlich etwa 200 Zufalls Spektren zufriedenstellendes Signal-zu-Rauschen zu erhalten.

5. ESI-QTOF-MS

  1. Analysieren Endoxylanase-generierte Oligosaccharide (nativ) unter Verwendung von Nano-HPLC gekoppelt mit einem Elektrospray-Ionisation (ESI) Quadrupol-Flugzeit (QTOF) MS-Gerät mit Online-chromatographische Trennung unter Verwendung einer RP C-18-Säule (75 & mgr; m × 150 mm; 3,5 & mgr; m Wulst Größe).
    1. Übertragen Sie die Endoxylanase-generierte wässrigen Oligosaccharide Mischung in ein Fläschchen aufnehmen und in die HPLC-Autosampler. Programmieren des Elutionsgradienten von 5-80% mit den mobilen Phasen 0,1% (v / v) Ameisensäure in Wasser und 0,1% (v / v) Ameisensäure in Acetonitril jeweils über 60 min.
    2. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 ml / min. Stellen Sie den Positiv-Ionen-Modus im Scan-Bereichvon 300-1,600 m / z und einer Scan-Geschwindigkeit von 0,5 Scans / Sekunde die ESI - Quelle Bedingungen wie folgt: Vorhanggas 10, GS1 4, Quellentemperatur 100 ° C, Ionensprayspannung 2300 V, und de-Clustering Potential 50 V. Führen Sie das LC-chromatographischen Programm und elute Oligosaccharide. Die sich ergebende Gesamt Ionenchromatogramm (TIC) automatisch durch die Software gespeichert.
    3. Öffnen Sie die gespeicherte TIC und wählen Extrakt Chromatogramm. Geben Sie die erwarteten Massen (zB 271, 403, 535, 667, 799 und 931 m / z) in der Befehlszeile. Scan-Chromatogramm durch Eingabe klicken. Verarbeiten Sie die ausgewählten Ionen Scans der ESI-MS QTOF Chromatogrammdaten unter Verwendung von Software gemäß den Anweisungen des Herstellers 14.

6. ESI-MS n

  1. Legen 1 bis 2 & mgr; l per-O-methylierten Oligosaccharid (methyliert , wie durch Pettolino et al. 1) Probe in 50% Acetonitril in eine Nanospray - Spitze mit einer Spritze. Trimmendie Nano-Spritzdüse ein Glasschneider in der diskreten Nanospray Halter an der MS angebracht zu passen.
  2. Stellen Sie die Masse entsprechend der erwarteten Massenbereich (200-1.500 m / z) und Vorhanggas bis 10, Ionensprayspannung bei 1.900 V und Polarität positiv.
  3. Drücken Sie die Taste acquire entsprechende Fenster zu öffnen, geben Sie Datendateiname eine Gesamtionen Scan (ESI-MS 1) zu erhalten. Dann drücken Sie die STOP-Taste.
  4. Ändern Sie Scan-Typ von Produkt-Ion einen Spitzenwert von Interesse zu fragmentieren. Geben Sie die Masse von Interesse (zB 885 m / z) zu fragmentieren und stellen Sie den Massenbereich (200 bis 900 m / z). Drücken Sie die Taste Erfassen und stellen Sie die Kollisionsenergie ( nach oben und / oder unten in der Verbindung tab) gesamte Fragmentierung der Elternionen (885 m / z) zu erzielen und ein Fragment - Ion - Scan (ESI-MS 2) erwerben.
  5. Geben Sie die Masse von Fragment - Ionen von Interesse (zB 711 m / z) und stellen Sie den Massenbereich (200 bis 720 m / z). Drücken Sie die Taste ein acquired die Kollisionsenergie einzustellen gesamte Fragmentierung der Vorläuferionen (711 m / z) und erwerben ein Fragment - Ion zu erreichen scan (ESI-MS 3).

7. H 1 NMR - Spektroskopie

  1. Man löst Endoxylanase erzeugte Mischung von Oligosacchariden (KOH-sol, nativen Form) (~ 500 ug) in D 2 O (1,0 ml, 99,9%) in einem Kunststoff - Teströhrchen (15 ml). Fixieren Sie die Suspension bei -80 ° C für 4 Stunden und trocknen Sie die gefrorene Suspension in einem Gefriertrockner Xylo-Oligosaccharide zu erholen.
  2. Wiederholen 7.1 zweimal , um voll und ganz die H 2 O mit D 2 O austauschen
  3. Auflösen getrocknet Oligosaccharide in D 2 O (0,6 ml, 99,9%) und mit 0,5 & mgr; l Aceton (5% in D 2 O) als interner Standard. Übertragen Sie die deuterierten Oligosaccharide in der NMR-Probenröhrchen.
  4. Halten Sie das NMR-Röhrchen enthaltenden Probe von oben und legen Sie die Probenröhrchen in einem Kunststoff-Spinner. Legen Sie die Spinner in der Probe Tiefenmesser. Eiterh oder ziehen Sie die Probenröhrchen, die Tiefe der Probe anzupassen, um sicherzustellen, dass die Mittellinie der Probe oberen und unteren Tiefenmesser gleich sind.
  5. Entfernen Sie den Tiefenmesser und legen Sie die Probe in den Autosampler zu einem 600-MHz-NMR-Spektrometer mit einer Kryo-Sonde ausgestattet angebracht.
  6. Anmeldung und offene Spektrometer Steuerungssoftware. Geben Sie die Beispieldateinamen. Öffnen Sie eine vorhandene Datensatzes und verwenden Sie dann den "edc" Befehl, es zu speichern, um unter einem neuen Namen. Geben Sie die Positionsnummer der Probe im Autosampler und drücken Sie "ENTER".
    Hinweis: Durch Drücken der Taste "ENTER" wird das Probenröhrchen sanft auf die Magnetöffnung fallen, wo sie an der Spitze der Sonde positioniert werden.
  7. Stellen Sie die gewünschte Probentemperatur durch "versehenes Werkzeug" in der Befehlszeile eingeben. Warten für die Probentemperatur den gewünschten Wert erreicht hat, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Geben Sie "sperren" in der Befehlszeile ein und wählen Sie geeigneten Lösungsmittel (D 2 O). Warten Sie auf die & #34; verriegeln fertig "Meldung am unteren Rand des Fensters angezeigt werden.
  8. Geben Sie "ATMM" in der Befehlszeile und klicken Sie auf "optimieren" an der Spitze des ATMM Menüleiste. Wählen Sie für Tuning und Anpassung der Sonde für den gewählten Kanal (1 H in diesem Fall) zu starten.
  9. Geben Sie "topshim" in der Befehlszeile für den Shim-Prozess, in dem kleinere Anpassungen an das Magnetfeld vorgenommen werden, bis eine einheitliche Magnetfeld um das sample.Acquire das Signal durch Eingabe von "zg" in der Befehlszeile erreicht wird, und tritt ein.
  10. Analysieren Spektren unter Verwendung von Software 15 gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 1 H chemische Verschiebung auf einen internen Standard Aceton bei 2,225 ppm referenziert.

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Ergebnisse

Endoxylanase Verdau von 2AB-markiertem W-sol AXs eine Mischung aus 2AB-markiertem RE Oligosaccharide erzeugt , und eine Reihe von nicht-markiertem (ohne 2AB label) Oligosaccharide von den inneren Regionen der Xylan - Kette abgeleitet (1; von Ratnayake et al. 2). Eine Reihe von chromatographischen Vorgehensweisen wird dann die komplexe Mischung von Isomeren zu fraktionieren eingesetzt. Schließlich werden MS - Techniken die isomeren Strukturen zu identi...

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Diskussion

Die meisten Matrixphase Zellwandpolysaccharide scheinbar zufällig haben Backbones substituierte (mit sowohl Glycosyl und nicht-Glycosyl - Reste) , die sehr variabel in Abhängigkeit von der Pflanzenart, Entwicklungsstadium und Gewebetyp 3 sind. Da Polysaccharide wird sekundären Genprodukten ihre Reihenfolge sind Vorlage nicht abgeleitet und es gibt daher keinen einzigen analytischen Ansatz, wie Nukleinsäuren und Proteinen besteht, für ihre Sequenzierung. Die Verfügbarkeit von gereinigten gestänge spezifische h...

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Offenlegungen

Wir haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde mit Mitteln aus dem Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program unterstützt, das dem High Fibre Grains Cluster über das Food Futures Flagship zur Verfügung gestellt wurde. AB bedankt sich auch für die Unterstützung des ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007) durch einen Zuschuss des Australia Research Council (ARC).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 Aminobenzamid (2AB)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A89804
Natriumborhydrid (NaBH4)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)247677Gefährlich, mit Vorsicht umgehen
Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)156159Gefährlich, mit Vorsicht behandeln
endo-1,4-β-Xylanase M1 (aus Trichoderma viride) (120101a)Megazyme (www.megazyme.com)E-XYTR1
Deuteriumoxid (D2O)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)151882
Gefriertrockner (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus Säule Agilent (2.1&fach; 100 mm; 1.8 & Mikro; m Perlengröße) 
MicroFlex MALDI-TOF MS    (Modell - MicroFlex LR)(Bruker Daltonics, Deutschland)
(ESI) -(QTOF) MS    (Modell # 6520)(Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - Ionenfalle  (Modell # 1100 HCT)(Agilent, Palo Alto, Kalifornien).
Bruker Avance III 600 MHz -NMRBruker Daltonics, Deutschland
Topspin (Version 3.0)-Biospin- Software Bruker 
GC-MS (Modell # 7890B)Agilent 

Referenzen

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