Entwicklung Methode Regie in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Summary

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Konstruktion und zum Screening von Mutantenbibliotheken für gerichtete Evolutionskampagnen in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae bietet viele attraktive Vorteile , wenn Enzyme für biotechnologische Anwendungen entwerfen, ein Prozess, der Konstruktion, Klonierung und Expression von mutanten Bibliotheken, die mit Hochfrequenz - homologe DNA - Rekombination in vivo beinhaltet. Hier stellen wir ein Protokoll zu erstellen und Bildschirmmutantenbibliotheken in Hefe am Beispiel eines Pilz Aryl-Alkohol-Oxidase (AAO) seine Gesamtaktivität zu verbessern. Zwei Proteinsegmente wurden einer fokussierten gerichteten Evolution durch zufällige Mutagenese und in - vivo - DNA - Rekombination. Auskragungen von ~ 50 bp jedes Segment flankieren, erlaubt die korrekte Zusammenbau der AAO-Fusionsgens in linearisierter Vektor zu einem vollen autonom replizierenden Plasmid führt. Mutant Bibliotheken angereichert mit funktionellen AAO - Varianten wurden in S. gescreent cerevisiae Überstand mit einem empfindlichen Assay mit hohem Durchsatz auf die Fenton - Reaktion basiert. Der allgemeine Prozess derBibliothekskonstruktion in S. cerevisiae beschrieben hier leicht zu entwickeln viele andere eukaryotischen Genen angewandt werden, die Vermeidung zusätzliche PCR - Reaktionen, in vitro - DNA - Rekombination und Ligatur Schritte.

Introduction

Regie molekulare Evolution ist eine robuste, schnelle und zuverlässige Methode zu entwerfen Enzyme ^{1, 2.} Durch iterative Runden zufällige Mutation, Rekombination und Screening, verbesserte Versionen von Enzymen erzeugt werden können , die auf neue Substrate wirken, in neuartigen Reaktionen, in nicht-natürliche Umgebungen oder sogar um die Zelle zu unterstützen neue metabolische Ziele ^3-5 zu erreichen. Unter den Wirten in der gerichteten Evolution verwendet, um die Hefe Saccharomyces cerevisiae Brau bietet ein Repertoire an Lösungen für die funktionelle Expression von komplexen eukaryotischen Proteine ​​, die ^6,7 in den prokar....

Protocol

1. Mutant Library Construction

1. Wählen Sie die Regionen unterworfen werden mit Hilfe von Computer - Algorithmen auf MORPHING basierend auf den verfügbaren Kristallstruktur oder Homologie - Modelle ^18.
   1. Dabei zielen zwei Regionen AAO aus Pleurotus für zufällige Mutagenese und Rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), während Amplifizieren der Rest des Gens (844 bp) von High-Fidelity - PCR (Abbildung 1).
      Hinweis: Mehrere Segmente können durch MORPHING in einem unabhängigen oder kombinierten Weise ¹⁶ untersucht werden.
2. Amplify die Zielgebiete durch mutage....

Results

AAO von P. eryngii ist eine extrazelluläre flavooxidase die Pilz-Peroxidasen mit H ₂ O ₂ liefert Lignin zu starten angreifen. Zwei Segmente der AAO wurden fokussierte gerichtete Evolution unterworfen , indem MORPHING, um ihre Aktivität und ihre Expression zu verstärken in S. cerevisiae ^19. Unabhängig von den ausländischen von S. beherbergte Enzyme cerevisiae, die kritischste Problem , wenn Mutantenbibliotheken in Hefe K.......

Discussion

In diesem Artikel haben wir die meisten der Tipps und Tricks beschäftigt in unserem Labor zu konstruieren Enzyme durch gerichtete Evolution in S. zusammengefasst cerevisiae (unter Verwendung AAO als Beispiel) , so dass sie für die Verwendung mit vielen anderen eukaryotischen Enzymsysteme durch einfaches Folgenden werden die allgemeinen hier beschriebenen Ansatz angepasst werden kann.

In Bezug auf die Bibliothek Schöpfung ist MORPHING eine schnelle Ein-Topf - Verfahren einzu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Nährmedien
	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose-Pentahydrat	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Pepton	Difco	211677
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Hefeextrakt	Difco	212750
Hefe Stickstoff Base ohne Aminosäuren	Difco	291940
Hefe Synthetisches Drop-out Medium Supplements ohne Uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	<>Unternehmen	>Katalognummer	Kommentare
2. PCR-Reaktionen
chlorid-Tetrahydrat	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197,91
			prone PCR
strong>Name	Company	Katalognummer<	strong>Comments
3. Plasmid-Linearisierung
	New England Biolabs	R0146S
Not I Restriktionsenzym	New England Biolabs	R0189S
	Biotium	41003	Zum Färben von DNA
strong>Name	Company<	strong>Katalognummer	Comments
4. FOX assays
sulfathexahydrat	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alkohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbit	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Wasserstoffperoxid 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard
curve Xylenol Orange Dinatriumsalz	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Katalognummer	Comments
5. Agarose Gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Rot	Biotium	41003	DNA-Analysefarbstoff
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. Standard
Ladefarbstoff 6x	Thermo Scientific	R0611
Niedrigschmelztemperatur Agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Unternehmen	Katalognummer	strong>Comments
6. Kits und Zellen
S. cerevisiae Stamm BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease-defizienter Stamm mit Genotyp: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue kompetente Zellen	Agilent Genomics	200150	Für die Plasmidaufreinigung und -amplifikation
NucleoSpin Gel und PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA-Gel-Extraktion
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Säule Miniprep Kit
Hefe Transformation	Kit Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Inklusive DNA-Träger (Lachshoden)
Zymoprep Hefe Plasmid Miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmidextraktion aus Hefe
Name	Unternehmen<	>Katalognummer	Comments
7. Platten96-Well-Platten
	Greiner Bio-One	655101	Klar, unsteril, Polystyrol (für Aktivitätsmessungen)
96-Well-Platten	Greiner Bio-One	655161	Klar, steril, Polystyrol (für Mikrofermentationen)
96-Well-Plattendeckel	Greiner Bio-One	656171	Klar, steril, Polystyrol (für Mikrofermentationen)