Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Darüber hinaus haben sie wahrscheinlich eine Rolle bei der normalen Organentwicklung und haben Rollen in Krankheit zugeschrieben worden, insbesondere solche mit einer fibrotischen Natur. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen. Die Isolierung hier beschriebene Technik gilt mehrere Merkmale von Lungen ansässig MSCs (L-MSCs). Nach Opfer der Ratten, sind Lunge entfernt und mehrmals gewaschen, um Blut zu entfernen. Folgende mechanische Dissoziation von Skalpell werden die Lungen für 2-3 Stunden mit einer Mischung aus Collagenase Typ I, neutrale Protease und DNase Typ I. Die obtaine verdautd Einzelzellsuspension wird anschließend gewaschen und überlagert über Dichtegradienten-Medium (Dichte 1,073 g / ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen aus der Zwischenphase gewaschen und in Kulturflaschen behandelt plattiert. Die Zellen werden für 4-7 Tage in physiologischer 5% O 2, 5% CO 2 Bedingungen. Zu verarmen Fibroblasten (CD146 -) und eine Bevölkerung von nur L-MSCs (CD146 +), die positive Selektion für CD146 + Zellen gewährleistet ist, durch magnetische Perle Auswahl durchgeführt. Zusammenfassend ergibt dieses Verfahren zuverlässig eine Bevölkerung von Primär L-MSCs für weitere in vitro-Studie und Manipulation. Aufgrund der Natur des Protokolls kann es leicht zu anderen experimentellen Tiermodellen übersetzt werden.
Einleitung
Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Während der Entwicklung, unter anderem in der Lunge ist das Mesenchym eine wichtige Quelle für Entwicklungsanzeichen und Bewohner MSCs sind ein aussichtsreicher Kandidat in der Mitte davon zu sein. Darüber hinaus wird immer mehr Anzeichen dafür, dass die Bewohner MSCs bei erwachsenen Krankheiten gestört werden, eins....
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Protokoll
Alle Verfahren wurden von der Animal Care Committee der University of Ottawa (Tierethik Protokoll Ohri-1696) zugelassen. Tierbetreuung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Isolierung von Lung mesenchymalen Stromazellen
- Bereiten Sie die Enzymmischung in einer 50 ml Tube: wiegen 30 U neutrale Protease, 2.500 U Kollagenase I und 500 U DNAse I. ausreichen Diese Beträge für die Lunge eines erwachsenen Maus oder Ratte Welpen. Bereiten Sie am Tag der Isolierung und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Opfer Rattenjungen am Tag 13 durch eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (0,2 ml, 6....
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Ergebnisse
Zwei der zuverlässigsten physikalischen Eigenschaften von MSCs, Dichte und Kunststoffadhärenz werden im ersten Teil dieses Protokolls verwendet, um die mesenchymale Zellfraktion der Lunge zu erhalten, das L-MSCs enthält. Obwohl der Dichtegradient Interphase wird Monozyten und Makrophagen neben Lungen mesenchymalen Zellen, die Kunststoffadhärenz gefolgt von 3-5 Tagen Kultur gewährleistet sind, dass nur die Lunge mesenchymalen Zellen bleiben. Tatsächlich diese Zellpopulation drückt die kla.......
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Diskussion
Die Isolierung und Kultur von Primär L-MSCs stellt eine Chance zu einer besseren ihre Funktion und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellpopulationen auf zellulärer Ebene zu verstehen und ihre Rolle in der Lungenentwicklung, Gesundheit und Krankheit. Dies ist besonders wichtig, da der Mangel an einem bestimmten einzigen Markierung dieser Zellen macht es nahezu unmöglich, diese Zellen in situ zu untersuchen. Wie bei allen primären Zellpopulationen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass diese Zellen eher auf ihre.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
JJPC wird durch ein Postdoktorandenstipendium der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. MAM erhält ein Leistungsstipendium der Studienstiftung des Deutschen Volkes und wird durch ein Stipendium der EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant) unterstützt. BT wird unterstützt von CIHR, der Canadian Lung Association, dem Stem Cell Network und dem Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Neutrale Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Bereiten Sie sich am Tag der Isolierung vor und lagern Sie sie bei 4 Grad; C bis zur Verwendung |
| Kollagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Am Tag der Isolierung vorbereiten und bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Am Tag der Isolierung vorbereiten und bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung |
| Pentobarbital-Natrium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, | Irland-Verwenden | Sie 0,2 ml für Rattenbabys zwischen 20 und 30 g; größere Tiere benötigen möglicherweise mehr. |
| Dulbecco' s PBS + Natriumpyruvat + Glukose | Life Technologies | 14287-072 | Sehr wichtig für die Verwendung dieser Art von D-PBS, da das in diesem D-PBS enthaltene Calcium und Magnesium die enzymatische Verdauung erleichtern |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1,073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Medien mit Dichtegradienten. Um eine gute Interphase zu erhalten, ist es entscheidend, dass die Schichtung der Einzelzellsuspension bei einem >45°; Winkel bei sehr niedriger Geschwindigkeit und dass die anschließende Zentrifugation bei 19 °C durchgeführt wird. |
| α MEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch |
| 200 mM L-Glutamin | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotikum-Antimykotisch | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetische Beads |
| biotinyliertes polyklonales Kaninchen-Anti-Maus-IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylierter Sekundärantikörper, der mit dem unten beschriebenen Anti-Ratten-Antikörper CD146 übereinstimmt |
| DynaMag5-Magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet, der für die Verwendung mit Dynabeads empfohlen wird. HINWEIS: Der Magnet sollte auf der Grundlage des Herstellers ausgewählt werden. s Anleitung für die Magnetperlen der Wahl. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Sanfte Alternative ohne Trypsin, verwenden Sie 1 ml TrypLE express/25 cm2 Oberfläche. Nach der Ablösung reichen 10 ml L-MSC-Kulturmedium aus, um 3 ml TrypLE |
| Anti-Ratten-CD146-Antikörper | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12,5 μm l pro 0,5 x 106 Zellen |
| Pentaspan (Pentastärkelösung) | Bristol-Myers Squibb | Kanada-Kann | über lokale Blutspendedienste oder Hämatologieabteilungen bezogen werden. Alternativ könnte man die PSI 20%ige Pentastärkelösung (Preservation Solutions, PST001) 1:1 verdünnt mit 0,9% NaCl verwenden. |
| Mr. Frosty Gefrierbehälter | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Verbessert die Lebensfähigkeit beim Einfrieren von L-MSCs über Nacht bei -80 & Grad; C |
Referenzen
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5....
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Nachdrucke und Genehmigungen
