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Methodenartikel

Isolierung von CD146

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DOI:

10.3791/53782

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17. Juni 2016

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.

Zusammenfassung

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Darüber hinaus haben sie wahrscheinlich eine Rolle bei der normalen Organentwicklung und haben Rollen in Krankheit zugeschrieben worden, insbesondere solche mit einer fibrotischen Natur. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen. Die Isolierung hier beschriebene Technik gilt mehrere Merkmale von Lungen ansässig MSCs (L-MSCs). Nach Opfer der Ratten, sind Lunge entfernt und mehrmals gewaschen, um Blut zu entfernen. Folgende mechanische Dissoziation von Skalpell werden die Lungen für 2-3 Stunden mit einer Mischung aus Collagenase Typ I, neutrale Protease und DNase Typ I. Die obtaine verdautd Einzelzellsuspension wird anschließend gewaschen und überlagert über Dichtegradienten-Medium (Dichte 1,073 g / ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen aus der Zwischenphase gewaschen und in Kulturflaschen behandelt plattiert. Die Zellen werden für 4-7 Tage in physiologischer 5% O 2, 5% CO 2 Bedingungen. Zu verarmen Fibroblasten (CD146 -) und eine Bevölkerung von nur L-MSCs (CD146 +), die positive Selektion für CD146 + Zellen gewährleistet ist, durch magnetische Perle Auswahl durchgeführt. Zusammenfassend ergibt dieses Verfahren zuverlässig eine Bevölkerung von Primär L-MSCs für weitere in vitro-Studie und Manipulation. Aufgrund der Natur des Protokolls kann es leicht zu anderen experimentellen Tiermodellen übersetzt werden.

Einleitung

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Während der Entwicklung, unter anderem in der Lunge ist das Mesenchym eine wichtige Quelle für Entwicklungsanzeichen und Bewohner MSCs sind ein aussichtsreicher Kandidat in der Mitte davon zu sein. Darüber hinaus wird immer mehr Anzeichen dafür, dass die Bewohner MSCs bei erwachsenen Krankheiten gestört werden, einschließlich Krebs 1,2 und Fibrose 3. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen 4. Stammzell-Antigen-1 (Sca-1) wurde in Mäusen als Marker für eine Vielzahl von Gewebestammzellen identifiziert und können für die Isolierung von L-MSCs 5 verwendet werden, hat aber leider6 Orthologe in anderen Spezies nicht bekannt. Forscher haben eine Vielzahl von verschiedenen Isolationsverfahren für die Isolierung von L-MSCs entweder von Lungengewebe oder Flüssigkeit berichtet. Diese reichen von Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) basierte Verfahren für CD31 Auswahl - / CD45 - / CD90 + Zellen 7, CD31 - / CD45 - / epithelialen Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) - / Sca-1 + Zellen 8, Multidrug-Resistenz-Transporter ATP-Bindungskassette G (ABCG2) positive Zellen 9 oder Hoechst 33342 Farbstoff Auslauf 10, Kunststoffadhärenz 11,12 und Migration von zerkleinerten Gewebes 13.

Die Vorteile der hier vorgestellten Verfahren sind mehrfach. Durch die Verwendung von 14 eine sanfte enzymatische Verdauung und Dichtegradienten erhält man alle Zellen des Dichtebereichs, die MSCs gehören, epithelialen oder endothelialen Zellen auszuschließen. Die anschließende Kunststoffadhärenz Schritt stellt sicher, dass nur die mesenchymal Zellen anhaften und in der Kultur bleiben, Leukozyten zu beseitigen. Vor allem aber erlaubt die CD146 + Selektionsschritt zur Beseitigung von Fibroblasten, da diese Zellen nicht CD146 exprimieren. Die Expression des Zelladhäsionsmolekül CD146 positiv mit Multipotenz korreliert, und ist daher eine gute Markierung Fibroblasten aus einer mesenchymalen Zellpopulation 15-19 auszusondern. Dies ist ein Vorteil gegenüber CD90 als Selektionsmarker verwendet, da sie nicht nur in MSCs exprimiert wird, sondern auch in lipofibroblasts 5,20. In diesem Protokoll haben wir ausdrücklich ein magnetisches bead Auswahl gewählt, da es auf die Zellen sanfter ist, und die gesamte Prozedur kann unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Isolierungsverfahren wie zum Auswachsen Verfahren gegenüber, ist, dass es relativ schnell ist, als 6-10 Tage bis zu einem Monat oder mehr für den Auswuchs Verfahren gegenüber. Drei bis fünf Tage nach der ersten Isolierung der mesenchymalen Bevölkerung ist bereit für CD146 + Sele ction; Nach weiteren drei bis fünf Tagen die CD146 + Zellen sind bereit für Experimente verwendet werden oder kann für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Die verringerte Zeit der Kultur verbessert die Qualität der Zellen als MSCs transdifferentiate Richtung Fibroblasten in Kultur verlängert ex vivo 19. Schließlich wegen der Art des Protokolls ist es möglich, dieses Verfahren auf andere Arten anzuwenden, indem einfach geeignete Antikörper oder sogar auf andere Organsysteme Auswahl durch die Wahl der Verdauungsenzyme und Inkubationszeit eingestellt wird.

Ein detailliertes Protokoll dieser Isolierungsmethode ist unten angegeben, und eine schematische Übersicht über die Isolierung und anschließende Auswahl der CD146 + Subpopulation ist in 1A und 1B vorgesehen. Zusätzlich werden Details für die Passage enthalten, Einfrieren und diese Zellen aufgetaut.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung von Lungen mesenchymalen Zellen (A) und die anschließende CD146 + Zellauswahl (B) min = Minuten. EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; 2. Ab = Sekundärantikörpers; a-CD146 Ab = primäre anti-CD146-Antikörper; & ndash; ve Zellen = CD146-negativen Zellen; + ve Zellen = CD146-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Animal Care Committee der University of Ottawa (Tierethik Protokoll Ohri-1696) zugelassen. Tierbetreuung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Isolierung von Lung mesenchymalen Stromazellen

  1. Bereiten Sie die Enzymmischung in einer 50 ml Tube: wiegen 30 U neutrale Protease, 2.500 U Kollagenase I und 500 U DNAse I. ausreichen Diese Beträge für die Lunge eines erwachsenen Maus oder Ratte Welpen. Bereiten Sie am Tag der Isolierung und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  2. Opfer Rattenjungen am Tag 13 durch eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (0,2 ml, 65 mg / ml). Verwenden Sie die Zehe Prise Reflex Bewusstlosigkeit zu etablieren. Tod des Tieres wird durch Öffnen des Brustgewährleistet, wie weiter unten beschrieben.
  3. Desinfizieren Sie die Haut durch das Tier mit 70% Ethanol Spritzen und vorsichtig öffnen den Brustkorb chirurgische Schere, bei der Membran ausgehend und in Richtung der rostralen Seitenschneider, sehr aufpassen, nichtdie Lunge zu beschädigen. Verbreiten Sie den Brustkorb geöffnet blutstillende Schellen, oder alternativ den Brustkorb aufgeschnitten Zugriff auf den Brustkorb zu schaffen.
  4. Exsanguinate das Tier durch das Herz zu entfernen. Um das Herz zu entfernen, fassen Sie die Thymusdrüse und Herzen mit kleinen Pinzette und schneiden Sie diese mit chirurgische Schere entfernt. Unmittelbar danach nehmen das Blut mit einer Gaze, bis kein Blut mehr aus der abgetrennten Aorta und Lungenarterie kommt.
  5. Entfernen Sie die Lungen aus dem Thorax wie folgt: Halten Sie die Luftröhre mit kleinen Zange, dann trennen die Luftröhre mit chirurgischer Schere auf dem rostralen Seite. Während sanft die Lunge Paket aus dem Brustkorb ziehen, geschnitten entlang der Brustkorb in die Lunge frei, jede Bindegewebe auf der Rückenseite entfernt.
  6. Sever die Lungen von der Aorta und der Speiseröhre, mit chirurgische Scheren entlang der Membran zu schneiden. Nun, da die Lungen aus dem Thorax völlig frei nehmen Sie verbleibendes Blut vorsichtig mit einem Gaze.
  7. Entfernen Sie die Luftröhre und Bronchien mit surgische Schere und sorgfältig die Lungenlappen zu einer 50-ml-Röhrchen übertragen haltige Kalt 35 ml 30% Citrat-Phosphat-Dextrose-Adenin (CPDA-1) Antikoagulans (26,30 g Trinatriumcitratdihydrat, 3,27 g Ascorbinsäure Monohydrat, 2,22 g Natriumhydrogenphosphat, 31,80 g D-Glucose, 0,275 g Adenin in 1 L gereinigtem H 2 O; Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Blut und Trümmer zu entfernen verwenden.
  8. Nach 5 min Spülen in 30% CPDA-1 / PBS, übertragen die Lunge auf eine neue 50-ml-Röhrchen 35 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (RT) enthält, vorsichtig umdrehen Citrat zu entfernen. Transfer in ein Rohr 35 ml Dulbeccos PBS + Natrium-Pyruvat + Glucose (DPBS ++) (RT) enthält. Jeder Waschschritt sollte ungefähr 5 Minuten dauern.
    Hinweis: DPBS ++ Handel bestellt werden kann oder sich wie folgt zusammen 21: Calciumchloriddihydrat 132,4 mg, Magnesiumchlorid-Hexahydrat 100 mg, Kaliumchlorid (wasserfrei) 200 mg, monobasisches Kaliumphosphat (wasserfrei) 200 mg, Natriumchlorid (wasserfrei) 8,000 mg, dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) betragen mit 1.144,5 mg, D-Glucose 1000 mg, Natriumpyruvat 36 mg in 1 L gereinigtem H 2 O, pH 7,3. Sterilfilter die Lösung einen 0,22 um Membranfilter vor dem Gebrauch verwenden.
  9. Man löst das Enzymgemisch durch Zugabe von 10 ml DPBS ++ (vorgewärmt auf 37 ° C) und dem invertierenden sanft bis gelöst.
  10. Übertragen Sie die Lunge zu einem neuen 50-ml-Tube und hacken die Lunge an der Wand der Röhre mit einem Skalpell, bis fein gehackt. In der Enzymmischung auf das Gewebe (10 ml Enzymmischung / pro Erwachsener Maus / Rattenjungen Lunge), schließen Sie das Rohr fest und Inkubation bei 38 ° C unter leichtem Schütteln (entweder in einem Thermomischer, einem Schüttelwasserbad, oder ein Wasser Bad mit regelmäßiger manueller Bewegung). Die Dauer hängt von der Art des Gewebes: fetalen Gewebes 60 min, juvenile / erwachsenem Gewebe 90-120 min, fibrotische erwachsenem Gewebe 120-150 min.
  11. Stoppen Sie die Verdauung von Chela die zweiwertigen Kationen with 200 & mgr; l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung verwendet wird).
  12. 20 ml 5% fötalem Rinderserum (FBS) / PBS und die gesamte Suspension durch 100 & mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Röhrchen übergeben. Spülen Sie das Rohr und Zellsieb mit 10 ml 5% FBS / PBS, um das Gesamtvolumen auf 40 ml zu bringen.
  13. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 500 · g, RT.
  14. Entfernen Sie den Überstand (Pellet sollte gut sichtbar sein), Resuspension in 40 ml 5% FBS / PBS und wiederholen Zentrifugation Schritt 1.13.
  15. Resuspendieren in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) und 14 vorsichtig auf 3 ml Dichtegradientenmedien (1,073 g / cm 3) in einem 15 ml Rohrschicht. Um eine gute Interphase erhalten, ist es entscheidend, dass die Schichtung der Einzelzellsuspension bei einer auftritt> 45 ° Winkel mit sehr geringer Geschwindigkeit.
  16. Zentrifuge 20 min bei 900 · g, Medium (5/10) Beschleunigung, keine Verzögerung, 19 ° C.
  17. Sammeln Sie die Zellen, die in der interphase und resuspendieren sie in 10 ml sterilem PBS.
  18. Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 × g, 21 ° C.
  19. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 10 ml vorgewärmten abgeschlossen L-MSC-Kulturmedium (Minimum Essential Medium Eagle alpha-Modifikation (& agr; MEM), ergänzt mit 2 mmol L-Glutamin pro 500 ml & agr; MEM, 20% vol / vol FBS und 1% vol / vol Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B.
  20. Wiederholen Zentrifugationsschritt 1,18. Anschließend entfernen Überstand und resuspendieren in 10 ml vorgewärmten frisches Kulturmedium.
  21. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler und Platte mit einer hohen Dichte, da die Mehrzahl der Zellen in diesem Stadium sind nicht aus Kunststoff anhaftenden. Die genaue Beschichtungsdichte hängt von der Tierart und Alter, zB werden die Zellen eines erwachsenen Mauslunge bei 10 5 Zellen / cm 2, wohingegen Zellen, die aus einer Lungenrattenjungen ausreichend dicht sind bei einer Aussaatdichte von 1-2 x 10 4 Zellen / cm 2 . Verwenden Sie 0,2 ml L-MSC Kulturmedium / cm 2.
  22. Kultur L-MSCs in einer befeuchteten 5% O 2, 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C.
  23. Ändern Medium 24 Stunden nach der ersten Aussaat und danach alle 3 Tage, nachdem er einmal mit PBS spülen. Zellen werden, bis 80-90% Konfluenz kultiviert werden, die in Abhängigkeit von dem Tier Ursprungs 3-5 Tage im Durchschnitt dauert. Höhere Zusammenfluss wird die Differenzierung in Fibroblasten fördern.

2. Auswahl der CD146 + Lung mesenchymalen Stromazellen

  1. Beschichtung von Magnetic Beads mit sekundärem Antikörper
    1. Beschichten der magnetischen Kügelchen mit biotinyliertem sekundärem Antikörper, bei einem Verhältnis von 10 ug sekundären Antikörper / 100 ul magnetischen Perlen in einem Rundboden sterile 2 ml Kryoröhrchen in sterilen Bedingungen. Verwenden Sie 10 ul sekundären Antikörper pro erwartet 0,5 x 10 6 Zellen, und mit einem Minimum von 100 ul magnetische Perlen und 10 ug Antikörper.
      Hinweis: das Verhältnis einestibodies pro Volumen der Kugeln verwendet wird, kann von Hersteller zu Hersteller unterscheiden, sollten Sie die Anweisungen des Herstellers für die Perlen der Wahl beraten. Aus diesem Protokoll finden Sie in Tabelle 1 für die Perlen und Antikörper, die bei der Optimierung von diesem Protokoll verwendet wurden.
    2. Inkubieren in einem rotierenden Probenmischer für 30 Minuten bei 30 Umdrehungen / min (rpm), bei RT.
    3. Resuspendieren der Kügelchen in 1,5 ml steriler 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS und Transfer zu einem 3 ml Rundbodenrohr (Durchflusszytometrie Rohr). Spülen Sie die Kryoröhrchen mit einer zusätzlichen 1,5 ml 0,1% BSA / PBS und Transfer zum 3-ml-Tube.
    4. Das Röhrchen wird auf einem geeigneten Magnet und warten 2 Minuten, bis alle Perlen an der Rückwand der Röhre befestigt sind, und die Lösung bleibt klar. Entfernen Abfluss und wiederholen Waschen mit 3 ml 0,1% BSA / PBS zweimal.
    5. Resuspendieren der Kügelchen in 3 ml 0,1% BSA / PBS und lagern bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Verwenden Sie innerhalb von 5 Tagen.
  2. Kennzeichnung CD146 + L-MSCs
    1. Ernten Sie die mesenchymalen Zellen nach Spülen mit PBS eine sanfte nicht-Trypsin-Lösung.
      Anmerkung: Volumes hängen von der Größe der Kulturflasche (0,2 ml / cm 2 Medium oder PBS).
      1. Kulturmedium entfernen und spülen Zellen dreimal mit sterilem PBS.
      2. Fügen Sie den entsprechenden Volumen von sanften Nicht-Trypsin-Lösung (siehe Tabelle 1). Im Brutschrank bei 37 ° C inkubieren, bis die Zellen abgelöst, etwa 10 min, wenn die Lösung in Tabelle 1 verwendet wird.
      3. Inaktivierung des Enzyms durch L-MSC Kulturmedium zugibt und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
    2. Überstand entfernen, resuspendieren Zellen in 0,1% BSA / PBS und die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler zählen.
      Hinweis: Das Volumen der 0,1% BSA / PBS auf die Größe der Kulturflasche abhängt: Ziel für 5 oder 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2 und resuspendieren engagierten Menge an Zellen in 3 ml 0,1% BSA / PBS (Blöcke unspezifischen Bindungsstellen und hält die Zellen am Leben). Halten Zellen auf Eis.
    4. Bereiten Sie eine 3 ml-Rundbodenröhrchen mit dem primären anti-CD146-Antikörper, und halten Sie auf dem Eis.
      Anmerkung: Die Konzentration an primären Antikörper, der an die spezielle Menge an Zellen hinzugefügt wird, hängt auf dem Antikörper, der verwendet wird. Für einen empfohlenen Anti-Ratten CD146-Antikörper siehe Tabelle 1.
    5. Hinzufügen des Gesamtvolumens der Zellen aus Schritt 2.2.3 auf das Rohr mit dem primären Antikörper. Dicht schließen und 4 ° C bei 15 rpm, 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer inkubiert.
    6. Zentrifuge Zellen 5 min bei 500 × g, 4 ° C, Überstand und resuspendieren Zellpellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS entfernen. Wiederholen Zentrifugenschritt.
    7. Resuspendieren der Zellen in der Lösung 3 ml sekundärem Antikörper beschichteten Kügelchen enthält, die 2,1 nach den Anweisungen in Abschnitt wurde hergestellt und inkubiert 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer bei 15 Upm, 4 ° C.
  3. Auswählen von CD146 + L-MSCs
    1. Das Röhrchen wird das markierte CD146 + L-MSCs auf den Magnet enthält. Die positiven Zellen werden an der Rückseite des Rohres gezogen werden. Ohne das Rohr zu bewegen oder um die Perlen zu berühren, ernten den Überstand mit den negativen Zellen langsam mit einer sterilen Pasteurpipette (diese entweder auf der Grundlage der experimentellen Design gesammelt oder verworfen werden kann).
    2. Entfernen des Rohres aus dem Magneten und Resuspendieren der Zellen in 3 ml 10% BSA / PBS. Wiederholen Sie den Auswahlverfahrens beschrieben in Schritt 2.3.1. vier weitere Male (Σ 5 Stufen des Auswahlverfahrens).
    3. Resuspendieren CD146 + L-MSCs in vorgewärmte L-MSC Kulturmedium und zurück zum Magneten.
    4. Überstand entfernen, resuspendieren in L-MSC Kulturmedium und die Platte in einem passenden Kulturflasche (0,2 ml / cm 2). Als Faustregel gilt, aus denen Zellen Platte in derselben Größe Kulturflasche wurden die Zellen vor der Wulst-Auswahl aufgehoben. Die Zahl der CD146 + L-MSCs und damit die Beschichtungs-Dichte, wirdabhängig vom Alter, Art und Stamm des Quell Tier. Immer streben eine Plattierungsdichte von ~ 5.000 Zellen / cm 2.
      Hinweis: Die Perlen werden nicht das Zellwachstum stören und wird nach und nach verschwinden, wenn die Zellen vermehren.

3. Gefrierzellen

  1. Verwenden Sie das folgende Gefriermittel: 60% Pentastärke-Lösung (10% Pentastärke in 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) 22.
    Hinweis: Wenn nicht alle Zutaten vorhanden sind, ist eine Lösung, die 5% DMSO, 30% FBS und 65% & agr; MEM ist eine gute Alternative.
  2. Die Zellen in 0,5 x 10 6 Zellen / ml aliquoten in Kryoröhrchen von jeweils 1 ml und O / N bei -80 ° C unter Verwendung eines Gefrierbehälters einfrieren.
  3. Transfer zu einem Flüssigstickstofflagertank am nächsten Tag.

4. Auftauen Cells

  1. Auftauen eine Ampulle von Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min.
  2. Die Zellen in 10 mlvorgewärmtes Kulturmedium und Zentrifuge für 5 min bei 500 × g, 21 ° C.
  3. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml Kulturmedium. Samenzellen in einem belüfteten Kappe Zellkultur behandelt Kolben bei 5.000 Zellen / cm 2 in 0,2 ml / cm2 Medien (zB 15 ml für einen 75 cm 2 Kolben).
  4. Kulturzellen in 5% O 2, 5% CO 2, bis 80-90% konfluent zum Ernten und / oder experimentelle Verwendung. Über Konfluenz wird die Differenzierung induzieren. Wenn bei 5.000 Zellen Aussaat / cm 2, L-MSCs werden 80-90% Konfluenz innerhalb von 3-4 Tagen Kultur erreichen.

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Ergebnisse

Zwei der zuverlässigsten physikalischen Eigenschaften von MSCs, Dichte und Kunststoffadhärenz werden im ersten Teil dieses Protokolls verwendet, um die mesenchymale Zellfraktion der Lunge zu erhalten, das L-MSCs enthält. Obwohl der Dichtegradient Interphase wird Monozyten und Makrophagen neben Lungen mesenchymalen Zellen, die Kunststoffadhärenz gefolgt von 3-5 Tagen Kultur gewährleistet sind, dass nur die Lunge mesenchymalen Zellen bleiben. Tatsächlich diese Zellpopulation drückt die kla...

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Diskussion

Die Isolierung und Kultur von Primär L-MSCs stellt eine Chance zu einer besseren ihre Funktion und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellpopulationen auf zellulärer Ebene zu verstehen und ihre Rolle in der Lungenentwicklung, Gesundheit und Krankheit. Dies ist besonders wichtig, da der Mangel an einem bestimmten einzigen Markierung dieser Zellen macht es nahezu unmöglich, diese Zellen in situ zu untersuchen. Wie bei allen primären Zellpopulationen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass diese Zellen eher auf ihre...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

JJPC wird durch ein Postdoktorandenstipendium der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. MAM erhält ein Leistungsstipendium der Studienstiftung des Deutschen Volkes und wird durch ein Stipendium der EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant) unterstützt. BT wird unterstützt von CIHR, der Canadian Lung Association, dem Stem Cell Network und dem Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Neutrale ProteaseWorthington Biochemical CorporationLS02104Bereiten Sie sich am Tag der Isolierung vor und lagern Sie sie bei 4 Grad; C bis zur Verwendung
Kollagenase IWorthington Biochemical CorporationLS004196Am Tag der Isolierung vorbereiten und bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung
DNAse ISigma-AldrichD5025Am Tag der Isolierung vorbereiten und bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung
Pentobarbital-Natrium (Euthanyl)Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin,Irland-VerwendenSie 0,2 ml für Rattenbabys zwischen 20 und 30 g; größere Tiere benötigen möglicherweise mehr.
Dulbecco' s PBS + Natriumpyruvat + GlukoseLife Technologies14287-072Sehr wichtig für die Verwendung dieser Art von D-PBS, da das in diesem D-PBS enthaltene Calcium und Magnesium die enzymatische Verdauung erleichtern
Ficoll-Paque PREMIUM (1,073 g/cm3)GE Healthcare17-5446-52Medien mit Dichtegradienten. Um eine gute Interphase zu erhalten, ist es entscheidend, dass die Schichtung der Einzelzellsuspension bei einem >45°; Winkel bei sehr niedriger Geschwindigkeit und dass die anschließende Zentrifugation bei 19 °C durchgeführt wird.
α MEMSigma-AldrichM8042Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch
200 mM L-GlutaminLife Technologies25030-164
100x Antibiotikum-AntimykotischLife Technologies15240-062Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 DynabeadsLife Technologies11205DMagnetische Beads
biotinyliertes polyklonales Kaninchen-Anti-Maus-IgGDako, Agilent TechnologiesE0464Biotinylierter Sekundärantikörper, der mit dem unten beschriebenen Anti-Ratten-Antikörper CD146 übereinstimmt
DynaMag5-MagnetLife Technologies12303DMagnet, der für die Verwendung mit Dynabeads empfohlen wird. HINWEIS: Der Magnet sollte auf der Grundlage des Herstellers ausgewählt werden. s Anleitung für die Magnetperlen der Wahl.
TrypLE expressLife Technologies12605-028Sanfte Alternative ohne Trypsin, verwenden Sie 1 ml TrypLE express/25 cm2 Oberfläche. Nach der Ablösung reichen 10 ml L-MSC-Kulturmedium aus, um 3 ml TrypLE
Anti-Ratten-CD146-AntikörperLifespan Biosciences Inc.C3584112,5 μm l pro 0,5 x 106 Zellen
Pentaspan (Pentastärkelösung)Bristol-Myers SquibbKanada-Kannüber lokale Blutspendedienste oder Hämatologieabteilungen bezogen werden. Alternativ könnte man die PSI 20%ige Pentastärkelösung (Preservation Solutions, PST001) 1:1 verdünnt mit 0,9% NaCl verwenden.
Mr. Frosty GefrierbehälterThermoFisher Scientific5100-0001Verbessert die Lebensfähigkeit beim Einfrieren von L-MSCs über Nacht bei -80 & Grad; C
zu inaktivieren.

Referenzen

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